專利名稱：兩種抑制“肌肉生長抑制素基因”表達的合成小干擾rna分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠對肌肉抑制素基因產生顯著抑制作用的小干擾RNA分子的 設計、合成和抑制作用在肌肉細胞上的評價方法。
背景技術：
肌肉的生長性狀(包括產量和質量)決定著肉用家畜的生產性能。產肉性 能的好壞，除與家畜的營養和飼養管理因素有關外，主要決定于遺傳因素，即主 要受與肌肉生長發育相關基因的調控。肌肉抑制素基因(myostatin，簡稱MSTN) 是一種抑制肌肉細胞增殖生長的負調控基因，該基因表達的抑制或突變失活， 能阻斷MSTN對肌細胞增殖生長的抑制作用，引起廣泛的肌肉增殖并顯著降低體 表脂肪的沉積，產生以肌纖維數量顯著增加為特征的肌肥大現象，即所謂的"雙 肌性狀"。根據國內外研究報道，目前在牛、羊、豬、人和鼠上都發現了與雙 肌性狀相關的突變基因型。除突變基因型外，通過生物技術手段阻斷MSTN基因 表達和功能，同樣能夠復制出類似MSTN突變產生的雙肌性狀。根據MSTN基因結 構和作用機制，通過生物技術手段阻斷MSTN對肌肉生長的抑制作用來促進肌肉 生長發育的研究已經成為MSTN研究的熱點。siRNA干擾技術是最近兩年來發展起 來的阻斷基因轉錄表達的新技術，其阻斷基因轉錄的功能已在各種不同基因上 得到了充分的證明，并被廣泛應用。針對MSTN的基因結構，設計合成能夠有效 抑制MSTN基因表達的干擾RNA分子，對深入研究家畜肌肉生長發育的分子調控機制和研制促進家畜肌肉生長的生物制劑具有重要意義和廣闊的應用前景。
發明內容
根據GeneBank中MSTN從啟始密碼(ATG)至終止密碼(TGA)共1128bp 編碼區序列，用siRNA設計軟件設計干擾MSTN基因轉錄的siRNA分子群，從設 計的87條siRNA分子中，根據結構和位置選出8條針對不同位點的siRNA序列 進行合成。將合成的兩條單鏈互補的siRNA分子經退火形成雙鏈后，分別連接 到pSilence4. 1 siRNA專一性表達載體上，構建了 8個干擾RNA質粒(pSi-MSTN)。 干擾RNA質粒用脂質體轉染法轉染C2d2小鼠成肌細胞，建立了最佳外源基因轉 染條件。48小時后收集細胞，提取細胞總RNA，通過實時定量熒光PCR檢測肌 肉細胞MSTNmRNA表達水平，分析了 siRNA對MSTN的干擾抑制作用。通過分析 比較實驗組和對照組細胞MSTN表達水平與肌細胞生長的相關性，評價了 siRNA 對MSTN基因表達的阻斷作用和促進肌肉細胞增殖生長的作用。最終獲得 PSi-717和pSi-986兩種能夠有效抑制MSTN基因表達的siRNA分子。
具體實施例方式
1、 siRNA表達載體構建
各取10ul lOuM的兩條siRNA寡核苷酸(正鏈和互補鏈)，加入8iU 10X annealing buffer和12ul滅菌超純水，煮沸10分鐘后自然冷卻至室溫。同 時pSilencer4. l質粒載體經Bam HI和Hind III雙酶切后回收線性化質粒，與 退火產物4'C過夜連接。連接產物轉化DH5a感受態細胞，LB平板氨芐青霉素 (lOOug/ul)篩選。用載體檢測引物及siRNA寡核苷酸引物篩選陽性克隆并送 上海生工測序鑒定序列正確后，提取純化重組質粒用于轉染。
2、 siRNA表達載體轉染CA2細胞轉染前一天按每孔2. 5X 1()5個/mL的密度將C2C,2細胞接種于六孔板，用2ml 含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養細胞。24h后細胞達到60% 70%匯合度時， 將4ug的siRNA表達載體(包括無關基因對照質粒)和10ul (l"g/ul)的 Lipo-fectamine 2000加入50 y 1無血清的OPTI-MEM I ，混勻后室溫下放置20 分鐘。將質粒DNA和脂質體復合物加入含2毫升無血清DMEM培養液的細胞中， 輕輕混勻，37°C、 5%C02培養箱培養12小時后，更換為含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養液。培養48小時后收獲細胞，用Trizol法提取總RNA。 3、 siRNA抑制效果在肌肉細胞上的評價
上述轉染細胞的總RNA經反轉錄成cDNA后，通過實時定量熒光PCR對MSTN 基因表達進行相對定量分析，評價對MSTN基因表達的抑制效果。定量分析方法 如下Q腦tiTect SYBR Green I試劑進行Real time PCR， PCR反應體系為: 2xmaster mix 10P 1,上下游引物(10 pm)各0. 5ul; cDNA 2wl。 PCR反應條 件為95°C 15min預變性后進行如下循環95°C 10s, 58°C 20s，72。C 20s， 55 個循環后進入融解曲線分析程序40°C-99°C (0. rc/s)。通過相對定量分析， PSi-717能夠有效抑制61%的MSTN的轉錄，pSi-986能夠有效抑制53%的轉錄。本專利所設計的核苷酸弓I物序列如下
MSTN-Si-986:
(正鏈)5， GATCCGCAAACCCCAGAGGTTCAGTTCAAGAGACTGAACCTCTGGGGTTTGCTTA3 (負鏈)5， AGCTTAAGCAAACCCCAGAGGTTCAGTCTCTTGAACTGAACCTCTGGGGTTTGCG3 MSTN-Si-717:
(正鏈)5， GATCCCCTTCCCAGAACCAGGAGATTCAAGAGATCTCCTGGTTCTGGGAAGGTTA3 (負鏈)5， AGCTTAACCTTCCCAGAACCAGGAGATCTCTTGAATCTCCTGGTTCTGGGAAGGG權利要求
1 兩個針對肌肉生長抑制素基因編碼區的干擾RNA序列。
2 構建的兩個干擾RNA真核表達載體。
3 兩個干擾RNA真核表達載體轉染肌肉細胞的方法。
全文摘要
本發明公布了兩種抑制“肌肉生長抑制素基因”的合成小干擾RNA分子。發明涉及對肌肉抑制素基因產生顯著抑制作用的體外合成小干擾RNA分子的設計、合成和抑制效果的評價。根據GeneBank中MSTN序列設計siRNA分子群，選擇針對不同位點的8條siRNA序列進行合成，siRNA單鏈分子經退火、連接到pSilence4.1專一表達載體上，構建pSi-MSTN表達質粒。脂質體轉染小鼠成肌細胞C<sub>2</sub>C<sub>12</sub>，建立最佳外源基因轉染條件。轉染48小時后收集C<sub>2</sub>C<sub>12</sub>細胞，提取總RNA，通過實時定量熒光PCR檢測肌肉細胞MSTN mRNA表達水平，分析siRNA對MSTN的干擾抑制作用。分析比較實驗組和對照組細胞MSTN表達水平與肌細胞生長的相關性，評價siRNA對MSTN基因表達的阻斷作用和促進肌肉細胞增殖生長的作用，獲得pSi-717和pSi-986兩種有效抑制MSTN基因表達的siRNA分子載體。
文檔編號C12N15/79GK101591652SQ20081007288
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月26日 優先權日2008年5月26日
發明者劉明軍, 劉晨曦, 森 唐, 馬曉林 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心