辣椒疫病菌分子檢測引物及其應用的制作方法

文檔序號：564783閱讀：464來源：國知局

專利名稱：辣椒疫病菌分子檢測引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域，更具體涉及一種辣椒疫病菌分子檢測引物及其應用。
背景技術：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(戶/^o; /^om co/wZc/)侵染引起的一種毀滅性病害，該病于 1918年首次在美國新墨西哥州發現，現已成為世界各國辣椒生產上的主要病害(Ristaine et al.，1999)。辣椒疫霉菌寄主范圍廣，除辣椒外，還可侵染茄科和葫蘆科的番茄、茄子、西瓜和西葫蘆等50多種作物(Tianetal.，2004; Hausbeck， et al., 2004)，其發生面積廣，危害十分嚴重，在適宜發病條件下，病害大流行可造成寄主作物絕收(Gevensetal.,2007;姜彥全等,2008; 劉學敏等，2007)。同時，辣椒疫霉菌是一種土傳病原菌，它可以經雨水、土壤、病殘體等從發病區向未發病區傳播，而且其侵染能力強，由其引起的病害多屬于多循環病害，在較短的時間內可造成植株死亡、根莖和果實腐爛。因此，開展辣椒疫霉菌檢測，防止其從發病區向未發病區傳播，以及在其發病初期進行診斷檢測，對辣椒疫病的及時控制具有重要意義(Silvar， etal,2005)。
自從發現辣椒疫霉菌以來，各國研究人員便對其檢測技術進行研究，傳統的檢測方法是采用選擇性培養基從土壤、植物組織或水體中分離菌株，再對這些菌株的形態等進行鑒定，來確定是否存在辣椒疫霉菌，或者用肉眼和借助顯微鏡技術對發病癥狀進行判定是否由辣椒疫霉菌引起的病害。傳統的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經驗，最重要一點是它不能滿足病害防治中制定最佳防治時期的需求，因此傳統病原學檢測方法已不能滿足現代植物病理學研究的需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期(Kelly， et al.， 2006; Schena， et al., 2008)。
隨著分子生物學技術的發展，應用PCR技術對病原菌進行特異、靈敏的快速分子檢測的成功例子己越來越多(Li etal，2003)。國內外有學者利用基于ITS堿基序列設計引物對辣椒疫霉菌的分子檢測開展研究(Silvar et al., 2005; Zhang, et al.， 2006)，但是ITS在病原菌的近緣種之間變化很小，從ITS序列上設計引物很難將兩個相以性高的種區分開(Martin and Tooley， 2003)，很難從ITS序列上對它們進行區分(Brasier et al,2004)。因此要對辣椒疫霉菌進行高靈敏性和特異檢測，應從疫霉菌其它基因上設計引物進行檢測。已有研究表明，疫霉菌屬中的YPT1基因(ras-related protein)含有多個外顯子和內含子，多個外顯子具有保守性，而這些內含子在不同種之間具有多變性，非常適合于設計引物進行疫霉屬卵菌近緣種的分子檢測，區分不同種的疫霉菌(Schenaeta1，2006)。

發明內容
本發明的目的是提供一種辣椒疫病菌分子檢測引物及其應用，針對現有技術中辣椒疫病菌的生物學檢測方法所需周期長、目前辣椒疫病菌分子檢測測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種辣椒疫病菌的特異分子檢測引物，方法結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高，可用于帶菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間辣椒疫病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，此技術對于辣椒疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
實現本發明的目的包括下列步驟
1. 根據辣椒疫病YPT基因序列的特異性，設計了對辣椒疫病菌具有特異擴增作用的一對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為
上游引物PCA1F: 5'- GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA -3，下游引物PCA2R: 5'- ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT -3，，
2. 辣椒疫病菌特異分子檢測體系的建立
(1) 被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物組織或存在辣椒疫病菌的土壤中提取DNA;
(2) PCR擴增PCR反應體系25pl，包括2.5pl 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng模板 DNA， d.d.H20補足25pl， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94。C變性lmin,60。C退火 30 sec ，72。C延伸lmin共35個循環；72 。C延伸10 min。
① 當在用于植株組織中存在辣椒疫病菌時，采用CTAB法提取辣椒疫病菌的DNA，按如下的PCR反應體系和反應條件用所設計的引物進行PCR擴增PCR反應體系25^1，包括 2.5^1 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA, d.d.H20補足25^1， PCR反應條件為 95°C預變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30sec， 72。C延伸lmin共35個循環；72 °C 延伸10min。
② 當在土壤樣品中存在辣椒疫病菌條件下，采用土壤DNA提取法(步驟見具體實施例4) 提取土壤中辣椒疫病菌的DNA，按如下的PCR反應體系和反應條件用所設計的引物進行PCR 擴增PCR反應體系25^il，包括2.5^1 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCAIF和PCA2R各0.5nmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20補足25pl， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94'C變性lmin， 60。C退火30 sec， 72'C延伸lmin共35個循環；72 'C延伸10 min。
(3) 然后將8(ilPCR產物用重量濃度1.5。/。瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果。
(4) 如果能特異性地擴增出364bp產物時，即可判斷所述的植株組織或土壤樣品中存在辣椒疫病菌；否則所述的植株組織或土壤樣品中未存在辣椒疫病菌。
本發明的關鍵性技術是辣椒疫病菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了獲得辣椒疫病菌的特異引物序列，本發明以我國福建、安徽和北京等省的42株辣椒疫病菌和多個疫霉屬近緣種以及常見的幾種病原真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入卯Opl重量濃度2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(重量濃度2。/。CTAB; 100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0; 20mmol/LEDTA， pH8.0; 1.4 mol/LNaCD禾B 90^1重量濃度10% SDS (十二烷基苯磺酸鈉) 后混勻，于55 6(TC水浴1.5h，每10min振蕩混勻一次，水浴1.5h后離心(12,000rpm)15min，
取上清液加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿異戊醇的體
積比為25 : 24 : 1,離心(12,000rpm)5 min，取上清液(水相)，加入等體積氯仿抽提一次 (12,000rpm離心5min)，吸上清液，加0.1體積的3mol/LNaAC溶液和2體積的—20。C無水乙醇，一20。C下沉淀30min后12，000rpm離心5min，輕輕地倒去上清液，加入700W體積濃度70%的一20"乙醇進行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用lxTE (10mmol/LTris-HCL， 0.1mmol/LEDTA， pH8.0)溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng4U待用。在辣椒疫病菌特異DNA片段序列的基礎上應用ClustalX軟件比對設計特異引物，經對供試菌株和42株辣椒疫病菌的特異性進行PCR驗證(具體的反應體系是PCR反應體系25^1，包括2.5^1 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+, 5Opmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng 模板DNA， d.d.H20補足25pd， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94。C變性lmin， 60°C 退火30sec， 72'C延伸lmin共35個循環；72 'C延伸10min，此特異引物在辣椒疫病菌上特異性地擴增出364bp的產物。這說明該引物可被用于生產實踐中發病植物組織和土樣中辣椒疫病菌快速可靠的檢測和鑒定。
本發明有益效果本發明針對現有技術中存在的缺陷，通過測定辣椒疫病菌及其它疫霉菌的YPT1基因，并進行多重比對分析，針對辣椒疫病菌的YPT1基因內含子特異序列設計出了一對引物，用于帶辣椒疫病菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，建立辣椒疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的實時定量監測技術體系。此技術可應用于辣椒疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，對于確定病害防治最佳時期具有重要的作用，為防治策略的制定提供科學依據。
本發明方法適用于土樣和植物組織中辣椒疫病菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中辣椒疫病菌引起的病害的防治具有重要的實用價值；本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果 .
1、特異性強本發明檢測方法是利用辣椒疫霉菌的YPT1基因具有保守性外顯子和多變性內含子特點，根據多變性內含子特異序列設計引物進行檢測。已經對源于來自我國福建、安徽、北京等不同地區的辣椒疫病菌和疫霉菌近緣種及其它卵菌的驗證，結果具有很強的特異性；
2、實用性好本發明所設計出的一對特異性引物，可用于帶辣椒疫病菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌土壤和發病植物組織中存在的辣椒疫病菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要；
3、操作簡便快速應用本發明方法，對帶辣椒疫病菌的土樣和植物組織進行病菌DNA 提取、PCR擴增和常規的瓊脂糖電泳后即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切。一般整個檢測過程可在8小時內完成。

圖1為本發明所要檢測的辣椒疫病菌的特異PCR擴增圖。
圖中泳道l和泳道22為100bpladder分子量marker，泳道2-14為辣椒疫病菌，泳道15為大豆疫病菌，泳道16為致病疫病菌，泳道17為掘氏疫病菌，泳道18為煙草疫病菌，泳道 19為惡疫霉菌，泳道20為黃瓜霜霉菌，泳道21為瓜果腐霉菌。
圖2為本發明辣椒疫病菌的靈敏性檢測擴增結果圖。
圖中泳道1和15為1 OObp ladder分子量marker，泳道2為1嗎，泳道3為1 OOng，泳道4為1 Ong，泳道5為lng,泳道6為100pg,泳道7為10pg，泳道8為lpg，泳道9為100fg，泳道10為10fg，泳道ll為lfg，泳道12為100ag，泳道13為10ag，泳道14為陰性對照。
圖3為本發明發病組織和帶菌土壤的檢測結果圖。圖中泳道1為100bp ladder分子量marker,泳道2為陰性對照，泳道3， 4， 5， 6為發病的辣椒植物組織，泳道7和泳道8為辣椒疫病發病田土壤。
具體實施例方式
本發明的技術內容包括辣椒疫病菌的特異檢測引物，所設計的引物及其序列為
PCA1F: 5'國GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA國3' PCA2R:: 5'- ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT -3';
利用該引物可從辣椒疫病菌上特異擴增出364bp的產物。以下結合實施例具體闡述本發明實施例l:引物對辣椒疫病菌的特異性擴增
1. 辣椒疫病菌的特異檢測
PCR反應體系25^d，包括2.5^1 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng模板DNA， d.d.H20 補足25pl， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30sec， 72°C 延伸lmin共35個循環；72 'C延伸10 min。
2. 檢測結果
檢測的特異性除了來自我國福建、安徽、江蘇等省份的辣椒疫病菌DNA可特異地擴增出364 bp的產物外，檢測了卵菌的其它13種疫霉種、霜霉菌、腐霉菌及其它的真菌和細菌等菌株DNA均未能擴增出任何產物，具有很強的特異性。實施例2:引物對辣椒疫病菌的靈敏性檢測
1. DNA濃度稀釋提取的辣椒疫病菌基因組DNA，經分光光度計測定濃度后，采用系列濃度稀釋。
2. 辣椒疫病菌的靈敏性檢測
PCR反應體系25^1，包括2.5pl 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F/PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20補足 25nl， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30 sec， 72。C延伸 lmin共35個循環；72 。C延伸10 min。
3. 檢測結果在25pl反應體系中，lpg辣椒疫病菌基因組DNA可獲得明顯擴增條帶，檢測靈敏度可達lpg。
實施例3:發病植物組織中辣椒疫病菌的檢測。
1. 樣品采集植物組織樣品采自福建省福州市郊南通鎮蔬菜基地
2. DNA提取及檢測
發病植物組織采用CTAB法提取DNA，按上述試劑盒實施的方法進行PCR擴增，PCR反應體系25nl，包括2.5^110xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCAIF和PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20補足25jil， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30 sec， 72。C延伸lmin共 35個循環；72'C延伸10min。電泳檢測擴增產物。 3.檢測結果
結果見圖3，見到一條清晰的分子量為364bp的特異條帶，因而判斷發病組織感染辣椒疫病菌。
實施例4: 土壤樣品中辣椒疫病菌的檢測。
1. 樣品采集土壤樣品采自福建省龍海市浮宮鎮辣椒蔬菜基地
2. DNA提取及檢測
(1) 從發病土壤樣品中提取DNA:
取過篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 nl重量濃度0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻，12000 卬m離心15min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為1(Vg/ml蛋白酶K， 55°C 水浴1-3 h，水浴結束后，加入1/2體積的7.5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻，12000 rpm離心15min，吸上清液加2倍體積無水乙醇—2(TC沉淀(沉淀時間1.5h)。沉淀結束后，12000 rpm離心15 min。用體積濃度70%乙醇洗漆沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用 10plTE (或無菌超純水)溶解，-2(TC保存備用。
(2) 辣椒疫病菌的PCR檢測按上述方法進行PCR擴增，PCR反應體系25nl，包括2.5^11 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L
Mg2+， 50nmol/L dNTPs, 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5nmol/L和10ng 模板DNA， d.d,H20補足25nl， PCR反應條件為95°C預變性2min; 94'C變性lmin， 60°C 退火30sec， 72。C延伸lmin共35個循環；72。C延伸10min。電泳檢測擴增產物。
3. 檢測結果
結果見圖3,見到一條清晰的分子量為364bp的特異條帶，可以判斷土壤樣品侵染辣椒疫病菌。核苷酸序列表
<110>福建省農業科學院植物保護研究所
<120>辣椒疫病菌分子檢測引物及其應用
<160>2
<210> 1
<211>21
<212>DNA
<213>辣椒疫病菌(P一o盧/wra c印由')
<220>
<400> 1
5'- gtatagcagaggtttagtgaa -3，
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>辣椒疫病菌(P/ vtop/^wraca/w/d)
<220>
<400> 2
5'-actgaagttctgcgtgcgtt -3"
10
權利要求
1. 一種辣椒疫病菌分子檢測引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子檢測引物的序列為PCA1F5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’PCA2R5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’。
2. 根據權利要求1所述的辣椒疫病菌分子檢測引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子檢測引物PCA1F和PCA2R對辣椒疫病菌特異性擴增出364bp的產物。
3. 根據權利要求2所述的辣椒疫病菌分子檢測引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子檢測引物特異引物序列獲得方法為以辣椒疫病菌和多個疫霉屬近緣種以及常見的幾種病原真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900pl重量濃度2%十六垸基三甲基溴化銨 CTAB提取液和90jil重量濃度10%十二垸基苯磺酸鈉SDS后混勻，于55 6(TC水浴1.5 h, 每10 min振蕩混勻一次，水浴1.5h后離心15min,離心速度為12,000rpm，取上清液加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿異戊醇的體積比為25:24:1,離心5min，離心速度為12，000rpm，取上清液，即水相，加入等體積氯仿抽提一次，離心5min，離心速度為12,000rpm,吸上清液，力[]0.1體積的3mol/L NaAC溶液和2體積的一20'C無水乙醇，一20。C下沉淀30min后12,000rpm離心5 min，輕輕地倒去上清液，加入70(^1體積濃度70%的_20°0]乙醇進行洗滌，稍離心，傾掉上清，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用lxTE溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng4U待用；在辣椒疫病菌特異DNA片段序列的基礎上應用ClustalX軟件比對設計特異引物，獲得辣椒疫病菌分子檢測引物特異引物序列，經對供試菌株和42株辣椒疫病菌的特異性進行PCR驗證，所述特異引物在辣椒疫病菌上特異性地擴增出364bp的產物。
4. 根據權利要求3所述的辣椒疫病菌分子檢測引物，其特征在于所述CTAB提取液為重量濃度2% CTAB; 100 m mol/LTris-HCl， PH 8.0; 20mmol/L EDTA，pH8.0: 1.4 mol/L NaCl。
5. 根據權利要求3所述的辣椒疫病菌分子檢測引物，其特征在于所述lxTE溶液為 10腿ol/LTris-HCL， 0.1腿ol/LEDTA, pH8.0。
6. 根據權利要求3所述的辣椒疫病菌分子檢測引物，其特征在于所述對供試菌株和42株辣椒疫病菌的特異性進行PCR驗證的具體的反應體系是PCR反應體系25^1，包括2.5^1 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50pmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物 PCA1F和PCA2R各0.5iimol/L和lOng模板DNA, d.d.H20補足25jJ， PCR反應條件為 95。C預變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30sec , 72'C延伸lmin，共35個循環； 72。C延伸10min。
7. —種如權利要求1、 2、 3、 4、 5或6所述的辣椒疫病菌分子檢測引物的應用，其特征在于所述的辣椒疫病菌分子檢測引物應用于辣椒疫病菌的快速分子檢測診斷，按照以下步驟檢測G) 從被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物組織或存在辣椒疫病菌的土壤中提取 DNA;(2) 以該DNA為模板用所述的一對引物PCA1F和PCA2R通過聚合酶鏈式反應PCR擴增；PCR反應體系25^1，所述PCR反應體系為2.5^ 10xPCR反應緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50pmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L 禾卩10ng模板DNA,d.d.H2O補足25jxl; PCR反應條件為95。C預變性2min; 94°C 變性lmin， 6(TC退火30sec， 72。C延伸lmin共35個循環；72 。C延伸10min;(3) 然后取適量步驟(2)的PCR擴增產物用瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性地擴增出364 bp的產物，即可判斷所述的植物組織或土壤樣品中存在辣椒疫病菌。
8. 根據權利要求7所述的辣椒疫病菌分子檢測引物的應用，其特征在于當植株組織中存在辣椒疫病菌時，采用CTAB法提取辣椒疫病菌的DNA。
9. 根據權利要求7所述的辣椒疫病菌分子檢測引物的應用，其特征在于采用土壤DNA提取法提取土壤中辣椒疫病菌的DNA:取過篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 ^1重量濃度0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻，12000 rpm離心15 min，取上清加入等體積蛋白酶 K緩沖液，加終濃度為10 Mg/ml蛋白酶K， 55'C水浴l-3h，水浴結束后，加入1/2體積的7.5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻，12000 rpm離心15 min，吸上清加2倍體積無水乙醇一20'C沉淀，沉淀時間1.5h，沉淀結束后，12000 rpm離心15 min，用體積濃度70% 乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干，每份樣品所提DNA用10WTE或無菌超純水溶解，-20 'C保存備用。
10. 根據權利要求7所述的辣椒疫病菌分子檢測引物的應用，其特征在于所述步驟(3)為取8 pi PCR產物用重量濃度1.5%瓊脂糖電泳分離。
全文摘要
本發明提供一種辣椒疫病菌分子檢測引物及其應用，該特異引物上游引物PCA1F5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’；下游引物PCA2R5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’；經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在辣椒疫病菌純DNA、帶菌的發病組織及土壤上特異性地擴增出片段長度為364bp的特異擴增產物，對辣椒疫病菌快速檢測；本發明的特異分子檢測引物及其用法可被用于生產實踐中辣椒疫病菌感染的植物組織和土壤中辣椒疫病菌的快速、靈敏、特異的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為辣椒疫病菌引起的病害的防治提供可靠的技術和理論依據。
文檔編號C12Q1/68GK101445825SQ20081007243
公開日2009年6月3日申請日期2008年12月23日優先權日2008年12月23日
發明者蘭成忠, 李本金, 翁啟勇, 健趙, 陳慶河申請人:福建省農業科學院植物保護研究所

完整全部詳細技術資料下載