專利名稱：：甘蔗宿根矮化病菌pcr快速檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種PCR檢測方法，尤其是甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速檢測方法。
背景技術：
：甘蔗宿根矮化病(Ratoonstuningdisease,RSD)是由寄生在甘蔗木質部導管內的Zei/^o/7j'a;^乃'subsp.病菌引起。目前應用于甘蔗宿根矮化病的PCR檢測技術，首先需要從甘蔗蔗汁或蔗莖組織提取DNA，然后進行PCR擴增。而病菌DNA的提取需要經過一系列步驟，即CTAB緩沖液裂解，氯仿/異戊醇抽提，醋酸鈉和無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌等過程。其過程復雜、繁瑣、耗時，很難應用于甘蔗病害大規模檢測和甘蔗早代RSD抗病育種研究。
發明內容本發明的目的是提供一種甘蔗RSD病菌PCR快速檢測的方法。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:甘蔗RSD病菌加入BufferA試劑，經過95。C水浴10分鐘后，再加入BufferB試劑，甘蔗RSD病菌即可裂解出Zej'/s朋j'asubsp.J7h'基因組DNA，然后作為PCR反應的模板。本發明的甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測方法，其特征在于具體步驟如下1、提取蔗汁在甘蔗的基部節間取蔗汁l1.5mL置離心管A中，室溫下3000rpm離心46min，取上清液300400uL放入離心管B中，室溫下12000rpm離心812min，棄上清，取沉淀；2、病菌裂解在收集到的沉淀中加入50uLBufferA，混勻，稍離心；95。C水浴10min，取出放置冰上3min;加入50pLBufferB，混勻；稍離心后靜置備用；所述BufferA為100mMNaOH與2。/。Tween20水溶液的混合液；BufferB為100mMTris-Hcl與2mMEDTA水溶液的混合液；3、模板PCR檢測和電泳成像；PCR檢測和電泳成像采用常規技術。BufferA是裂解液,通過NaOH堿性裂解RSD病菌；BufferB是中性溶液，平衡裂解后溶液的pH值。本發明專利的有益效果是，可以快速裂解甘蔗RSD病菌，釋放基因組DNA，操作簡單、方便，不影響檢測靈敏度和準確性，而且試劑價格便宜、無毒，通過對一定甘蔗樣品蔗汁病菌的裂解，然后PCR檢測，驗證了本發明具備了較高的靈敏性和準確性，與常規CTAB法相比，PCR反應的靈敏度高1個數量級，且具有快速、簡便、成本低、無污染的特點。圖1是兩種不同甘蔗RSD病菌裂解方法的PCR檢測靈敏度比較圖。具體實施方式為了充分公開本發明甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測方法，以下結合實施例加以說明。實施例甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測方法，具體步驟如下1、提取蔗汁用帶槽錐子在甘蔗的基部節間取蔗汁lmL，放入1.5mL的離心管中，室溫下3000rpm離心5min。取上清液350nL放入新的l.5mL的離心管中，室溫下12000rpm離心10min，棄上清。2、病菌裂解在收集到的沉淀中加入50liLBufferA，混勻，3000rpm離心5秒；95"水浴10min，取出放置冰上3min;加入50uLBufferB，混勻，3000rpm離心5秒，置-2(TC冰箱內備用。3、PCR擴增用于甘蔗RSD病菌檢測的引物為Lxxl:5，-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3，Lxx2:5，-ACCCTGTGTTGTTTTCMCG-3'PCR體系<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>PCR程序95°C，15min;94°C，15sec，55°C，15sec，72°C，lmin;40個循環72°C，10min;4°C，Hold4、電泳成像。甘蔗蔗汁RSD病菌經過BufferA和BufferB裂解處理后，分別稀釋10、102、103、104、和105倍，然后進行甘蔗RSD病菌PCR檢測，以確定本方法PCR檢測靈敏度。沒有稀釋的病菌為模板，PCR擴增產物經電泳檢測有明亮的特異性條帶，稀釋104倍的病菌作為模板，仍可檢測出微弱的特異性條帶。而蔗汁經過CTAB裂解提取的DNA稀釋104倍后(5pg)，幾乎看不到目的片段的條帶。本方法建立的甘蔗蔗汁RSD病菌快速PCR檢測技術具有較高的靈敏度,可應用于甘蔗病害大規模檢測和甘蔗早代RSD抗病育種研究。檢測結果如圖1所示，M.250bpDNALadderMarker;16為甘蔗RSD病菌經過BufferA和BufferB裂解，然后分別稀釋10°、101、102、103、104、105倍，作為PCR擴增模板；712.為甘蔗RSD病菌經過常規CTAB提取，然后分別稀釋10。、101、102、103、104、105倍，作為PCR擴增模板。13為陽性對照，RSD病菌DNA;14為陰性植株對照；15為雙蒸水對照。電泳結束后，用1.2。/。的瓊脂糖凝膠檢測PCR目的條帶(439bp)。權利要求1、一種甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測方法，其特征在于具體步驟如下(1)提取蔗汁在甘蔗的基部節間取蔗汁1～1.5mL置離心管A中，室溫下3000rpm離心4～6min，取上清液300～400μL放入離心管B中，室溫下12000rpm離心8～12min，棄上清，取沉淀；(2)病菌裂解在收集到的沉淀中加入50μLBufferA，混勻，稍離心；95℃水浴10min，取出放置冰上3min；加入50μLBufferB，混勻；稍離心后靜置備用；所述BufferA為100mMNaOH與2％Tween20水溶液的混合液；BufferB為100mMTris-Hcl與2mMEDTA水溶液的混合液；(3)模板PCR檢測和電泳成像。2、根據權利要求1所述的一種甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測方法，其特征在于所述稍離心為3000rpm離心5秒。3、根據權利要求1或2所述的一種甘蔗宿根矮化病菌PCR快速檢測方法，其特征在于所述靜置備用，指置-2(TC冰箱內備用。全文摘要本發明涉及甘蔗RSD病菌的快速裂解和PCR檢測技術。本發明通過BufferA和BufferB裂解甘蔗RSD病菌，用PCR檢測技術快速檢測出Leifsoniaxylisubsp.xyli病菌。本發明的檢測靈敏度比常規CTAB裂解提取DNA的方法高，且具有快速、簡便、成本低、無污染的特點，具備較高的靈敏性和準確性。本發明可用于大規模甘蔗RSD病菌的PCR檢測。文檔編號C12Q1/68GK101328501SQ20081007143公開日2008年12月24日申請日期2008年7月23日優先權日2008年7月23日發明者華張,徐景升,潘永保,許莉萍,陳如凱,陳平華,高三基申請人:福建農林大學