一種番茄紅素的制備方法

專利名稱：一種番茄紅素的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，特別涉及一種生物合成番茄紅素的方法。
背景技術：
番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素，分子式為C4。Hs6,分子量為536. 85。 最近的研究表明，番茄紅素的抗氧化性能是天然類胡蘿卜素中最強的，它獨特 的生理功能越來越引起人們的重視能高效猝滅單線態氧及清除過氧化自由基； 通過影響人體細胞的活性以及營養物質的吸收及循環，控制細胞的生長及其代 謝；作為一種低膽甾醇劑抑制膽固醇生物合成酶，調節膽固醇代謝，防治心jfii 管疾病。因而番茄紅素在食品、化妝品以及醫藥領域有重要的應用。
目前番茄紅素可通過化學合成、天然提取和微生物發酵3種方法來獲得。將 上述三種生產方法作一比較天然提取法由于番茄的種植為季節性產物，產量 和含量受多因素控制，且番茄紅素在番茄中含量不穩定，提取工藝繁瑣冗長， 成本昂貴；而化學合成法盡管成本較低，但由于污染環境及產品活性較低，產 品應用范圍受到限制；采用微生物發酵法生產番茄紅素，其產品質量和生理活 性完全和天然提取產品相同，且釆用發酵法能降低成本，污染相對較小。因此， 我們可以看出微生物發酵法是最具有潛力的生產方法。
雖然番茄紅素在很多植物和微生物中均有分布，但由于其中所含色素的成 分復雜致使提取單一組分的成本較高。隨著不同生物類胡蘿卜素合成基因的相 繼克隆，為利用微生物發酵來獲取番茄紅素提供了可能。crf/基因編碼八氫番茄 紅素脫氫酶，在不同的物種中這種脫氫酶的作用有所不同。研究表明，^vi/ /a 力e/^/co/s是一種革蘭氏陰性菌，不屬于光合細菌，其crt基因族按照以下順 序來產生類胡蘿卜素，首先八氫番茄紅素經過4次脫氫形成番茄紅素，然后依 次產生胡蘿卜素、隱黃質、玉米黃質。而光合細菌Wocto^"er MAgeroA/"的八氫番茄紅素在同樣由cr〃基因編碼的八氬番茄紅素脫氳酶作用下只經過三次脫氫形成鏈孢紅素，而后則生成羥化鏈孢紅素、去甲基球狀烯、
球形烯及球狀菌素，并不形成番茄紅素。A ^力aero^/^的突變抹TC72是在原 始菌4朱A ^ A2ero/V"的c〃/基因中插入轉座子Tn5而得。研究表明，突變 林TC72內雖然crt基因族是完整的，但由于Tn5的插入而使其類胡蘿卜素合成 途徑停留在八氫番茄紅素，"f/及以后基因的表達均被中斷(如圖1所示)。如 果能夠利用基因工程的方法使A力erWco/a的cr〃基因在光合細菌突變抹TC72 中表達，使TC72中積累的八氫番茄紅素生物合成番茄紅素。同時，由于TC72 中不存在crtY和crtZ蛋白，使生物合成的番茄紅素不被繼續代謝成其他類胡 蘿卜素，從而使得光合細菌突變抹TC72中利用A力er6/co/a的crtl蛋白生物 合成的番茄紅素在細胞內大量積累并容易分離純化。

發明內容
本發明的目的是提供一種番茄紅素的制備方法。本發明方法將￡力er6/co" 的crZ/基因克隆并連接到含強啟動子A/c的表達載體pRKR5上，結合轉移到突 變抹TC72中構建工程菌，啟動子戶"c在厭氧條件下高效表達，通過氧濃度的調 控使工程菌生產目的產物番茄紅素。為實現工業化生產番茄紅素奠定了基礎， 在生產實踐中具有潛在的應用價值，有生產成本低，利于環保的優點。
本發明方法包括以下步驟
(1 )提取A力er&Vo"基因組DNA,通過PCR方法克隆出cr〃基因全長； (2 ) J&I酶切pMD18-crtl質粒，將切下的c"/片段連接到含強啟
動子尸wc的表達載體pRKR5上，構建表達載體pRKR5-crtl;
(3) 通過接合轉移的方式將表達載體pRKR5-crtl導入光合細菌 y 力6^o6a"er i7 /73ero/de5"突變林TC72中；
(4) 啟動子A/c在厭氧條件下高效表達，調控氧濃度可誘導工程菌 TC72-pRKR5-crtl累積紅色色素。
經HPLC和吸收光譜分析，工程菌TC72-pRKR5-crtl中合成的色素為番茄紅 素，工程菌的生物量(干重)為2. 36gDCW/L,番茄紅素含量可達1.52mg/gDCW。
本發明的優點是將A力e^/co/a中的cr//基因轉化到光合細菌A ^A3eroA/^突變株TC72中異源表達，使原來不生產番茄紅素的A ^/wero/o^ 經過改造后生產番茄紅素，并且使生產的番茄紅素不繼續代謝成其他類胡蘿卜 素，而在細胞內大量積累，有利于番茄紅素產量的提高和分離純化。此外，光
合細菌A ^ 力ae/Y /c^y極易培養，還可用于凈化高濃度有機廢水，使番茄紅素
的生產成本大大降^f氐，而且具有重大的環保意義。
為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳
實施例，并配合附圖，作詳細i兌明如下。


圖1為s/ 力aerc(7Ve51、 A.力er/ /co/a和577力ae/Y /cfes突變4朱TC72類胡 蘿卜素代謝途徑；
圖2為本發明的￡力er々/co/a中cr〃基因全長的PCR擴增電泳圖，圖中， 1: crf/基因的PCR擴增結果；2:陰性對照；3: 2000bp DNA ladder;
圖3為本發明的表達載體pRKR5的構建示意圖4為本發明的表達載體pRKR5-crtl的構建示意圖
圖5為本發明的表達載體pRKR5-crtl的酶切分析電泳圖，圖中，1:未酶 切的表達載體pRKR5-crtl; 2:表達載體pRKR5-crtl的i^cl和J&I雙酶切結果； 3: crW基因全長的PCR擴增結果；
圖6為本發明的番茄紅素標準品、TC72 、 TC72-pRKR5和工程菌 TC72-pRKR5-crtl的紫外分光光度計檢測圖，圖中,1:番茄紅素標準品；2:工 程菌所產色素；3: TC72所產色素;4: TC72-pRKR5所產色素;
圖7為本發明的番茄紅素標準品、TC72 、 TC72-pRKR5和工程菌 TC72-pRKR5-crtl的HPLC^企測圖，圖中，(1):番茄紅素標準品；(2):工程菌 所產色素；(3): TC72所產色素；(4): TC72-pRKR5所產色素；
圖8為本發明制備方法的流程示意圖。
具體實施例方式
材料
1. PrimeSTAR HS DNA聚合酶及各種限制性內切酶(Takara公司產品， 中國大連)2. 連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 ( Takara公司產品，中國大
連)
3. DNA純化試劑盒、離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天為時代公 司產品，中國北京)
4. DNA才是取i式劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3.0 (Takara公司產品，中國大連)
5. 大腸桿菌JM109感受態細胞(Takara公司產品，中國大連)
6. fr『2'/ /a力er6/co/a069菌抹(購自中國農科院植保所)
7. 大腸桿菌Sm(美國典型微生物菌種保藏中心，保藏登記號為ATCCNo. 47055，保藏時間1960)
8. 類球紅細菌RS-l (英國國家菌種保藏中心，保藏登記號為UKNCC No. 8253,保藏時間1956 )
注以下試劑均為市售產品。
9. LB培養基 酵母提取物 5g 胰蛋白胨 10g NaCl 10g 固體培養基加入2 % (w/v)瓊脂粉
溶于lOOOml去離子水中，并用lmol/L的NaOH調節pH值至7. 0,高壓蒸汽 滅菌。
10. 金氏培養基 蛋白胨 5g， 酵母膏 3g， 葡萄糖 2. 5g, 固體培養基加入1. 5 % (w/v)瓊脂粉溶于1000ml去離子水中，并用lmol/L的Na0H調節pH值至7. 2,高壓蒸汽
滅菌
11. M22+培養基
將光合細菌培養基命名為M22+培養基，其配方如下
M22+固體培養基向100ml 10xM22儲備液中加入900 ml去離子水和15g 瓊脂粉，混勻，高壓蒸汽滅菌。使用之前使固體培養基溶解，降溫到60。C時加 入lml過濾滅菌的1000 x維生素混合液。
其中10xM22儲備液的配制
KH2P04 K2HP04. 3H20 乳酸鈉 (NH4) 2S04 NaCl
琥珀酸鈉 谷氨酸鈉 天冬氨酸 Solution C
30. 6g
30g
25g 5g 5g
43. 425g 2,7g 0.4g
200ml
去離子水定容到lOOOml,用Na0H調節pH值至6. 8,高壓蒸汽滅菌 其中Solution C的配制
MgCl2. 6 H20 CaCl2
EDTA. Na2. 2 H20
ZnCl2
FeCl2. 4H20 MnCl2. 4H20
24g 3. 34g 0.125g 0. 261g
0.25g 0. 09g(NH4)6Mo7024 4H20 0. 009g
CuCl2. 2H20 0. 008g
Co (N03) 2. 6H20 0. 0124g
硼酸 0. 0057g
氮川三乙酸 10g
去離子水定容到1000ml, -20。C保存，無需滅菌。
其中1000 x維生素混合液的配制
煙酸 lg
石克胺素 0. 5g
對氨基苯曱酸 0. lg
生物素 Q. Olg
去離子水定容到1000ml,過濾滅菌，-20。C保存。
M22+液體培養基在超凈工作臺上向一經過高壓蒸汽滅菌的1L培養瓶中分 別加入100ml高壓蒸汽滅菌的10xM22儲備液，1ml過濾滅菌的1000 x維生素 混合液，20ml 5%高壓蒸汽滅菌的酸水解酪素和879ml滅菌去離子水，混勻后于 4°C保存備用。
其中5%酸水解酪素的配制
稱取5g酸水解酪素，用去離子水溶解定容到100ml,高壓蒸汽滅菌，-20°C 保存。
實施例一 A/v/zz/a力er6/co/a中cr"基因的克隆
按照DNA提取試劑盒的操作說明，從iyW/7^力e/^/coA3069中提取基因組 DNA，根據已報道的力er^'co/s pv. Milletiae中cr〃基因序列(GenBank 登錄號AB076662 ),設計引物對S1/R1 ( SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9 )，分別 在S1的5，引入酶切位點，在R1的5，引入J&I的酶切位點，引物序列 如下
SI: 5， - GCGCGAGCTCCATATGAATAGAACTACAGTAATTGG -3，；Rl: 5， - GCGCTCTAGATCAAGCCAGATCCTCCAGCATCAA -3，。 以A力er6/co"069基因組DNA為模板，建立如下的PCR反應體系反應 體系為25jil,其中含引物Sl和Rl各lW , 0. 的dNTP, 0. 5 jn 1基因組DNA， 5 x PrimeSTARTM反應緩沖液2. 5 ju 1, PrimeSTAR HS DNA聚合酶0. 2W。 PCR的 反應條件為第一階段94。C預變性4分鐘；第二階段94°C變性30秒，56。C退 火30秒，72。C延伸90秒，循環35次；第三階段72。C延伸10分鐘。所得PCR 產物經瓊脂糖電泳;險測可見約1500bp大小電泳帶，如圖2所示。將PCR產物回 收、純化后測序。PCR擴增出大小約1500bp的DNA片斷，將PCR產物回收、純化 后測序。序列分析表明，該片斷與已報道的cr〃基因的大小一致；將其翻譯成 氛基酉^f歹寸，與i>『//2/a力er6/co/a pv. Milletiae ( GenBank登錄號AB076662) 氨基酸序列比較分析，結果發現二者氨基酸序列同源性為95.8%，證明所克隆 基因為Ai^力"'s Aer6/co/a069中cr"基因，并登錄NCBI,登錄號為DQ408590。 實施例二具有；wc強啟動子的表達載體pRKR5的構建
利用DNA提取試劑盒提取類球紅細菌RS-1基因組DNA，才艮據GenBank上報道的 ;w^喿縱子序列(GenBank登錄號X68796 )設計兩對PCR引物S2/R2 ( SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5)和S3/R3 (SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7 ),其中上游引物S2的 5，端含有保護堿基和酶切位點AcoRI,下游引物R2的5，端含有保護堿基和酶切 位點&cl，上游引物S3的5'端含有保護堿基和酶切位點J&I，下游引物R3的5' 端含有保護堿基和酶切位點戶WI,引物序列如下
S2: 5' - CTCTGAATTC GCCTCGGA CACCCTCG _3，
R2: 5， -CTCTGAGCTC TGTGTCGTCT CCCAACTGG -3，
S3: 5， -ATATTCTAGA CGAATCACCA CGCCCTGCG -3， R3: 5， -ATATCTGCAG CAGTGGCAGG CAG -3，
以上述S2/R2為引物可擴增出/wc啟動子和SD序列，以上述S3/R3為引物 可擴增出/^c終止子序列。PCR的反應體系為100ji 1,其中含引物S2和R2各 20pmo1, 200 jaraol的dNTP, 1 ju 1 RS-1基因組DNA， 5 x PrimeSTAR反應緩沖液 20jul,高保真的PrimeSTAR HS DNA聚合酶5U。 PCR的反應條件為:第一階段 95。C預變性5分鐘；第二階段94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，循環30次；第三階^殳72。C延伸5分鐘。所得PCR產物(；wc啟動子和SD的核 苷酸序列為SEQ ID NO: 1),經1. 5°/ 瓊脂糖電泳檢測可見約360bp大小電泳帶， 將PCR產物回收、純化。同上述PCR反應體系和條件，以RS-1基因組DNA為模 板，以引物對S3/R3進行PCR擴增，回收、純化一約479bp的PCR產物(/wc終 止子的核香酸序列為SEQ ID NO: 2)。
取適量純化約360bp的PCR產物進行fcoRI和AcI分步酶切，然后利用DNA純 化試劑盒過柱純化酶切產物。同時，按照上述酶切策略將廣宿主性表達載體 pRK"5質粒DNA進行AcoRI和&cI分步酶切并純化(pRK415質粒DM序列可從NCBI 查閱，GenBank登錄號:EF437940, pRK415質粒來源:Keen, N. T. ， S. Tamaki, D. Kobayashi， and D. Trollinger. 1988. Improved broad-host—range plasmids for DM cloning in Gram-negative bacteria. Gene 70:191 - 197.)。
按照連接試劑盒的才喿作說明將適量經AcoRI和5^cI酶切的pRK415質粒DNA 和約360bp的PCR產物進行連接。連接產物通過CaCl2轉化法轉化頂109大腸桿菌感 受態細胞，經10jug/ml四環素抗性篩選陽性重組質粒pRKP,并測序驗證。
取適量純化約479bp的PCR產物進行i7^I和A d分步酶切，然后利用DNA純化 試劑盒過柱純化酶切產物。同時，將重組質粒pRKP進行AcoRI和&cI分步酶切并 純化。按照連接試劑盒的操作說明將適量經i^I和戶Wl酶切的pRKP質粒DNA和約 479bp的PCR產物進行連接。連接產物通過CaCl2轉化法轉化頂109大腸桿菌感受態 細胞，經10jug/ml四環素抗性篩選陽性重組質粒pRKR5，并測序驗證。pRKR5的 核苷酸序列為SEQ ID NO: 3。表達載體pRKR5的構建策略見圖3。 實施例三表達載體pRKR5-cr 11的構建
將表達載體pRKR5和克隆載體pMD18-crtl分別用^cl和i^l進行雙酶切，其 酶切體系為4jul 10xT緩沖液，1.5jal AcI和J^al酶液，4 ju 1 %BSA，加滅菌 雙蒸水到40 Jil， 3rC酶切2小時，DNA純化試劑盒過柱純化&cI-i^3l雙酶切產物。
按照連接試劑盒的操作說明將適量經^cl和J&I酶切的pRKR5質粒DNA 和cr/7片斷進行連接。連接產物通過CaCl2轉化法轉化JM109大腸桿菌感受態 細胞，經10jug/ml四環素抗性篩選后，挑取LB平板上的白色菌落于含有IOm g/ml四環素的LB液體培養基中，37°C， 250rpm,振蕩培養過夜，次日提取質粒DNA,用SAcl和XBAI進行雙酶切鑒定，酶切體系同上，酶切圖語如圖5所示， 酶切下約1500bp的片斷，大小與cr〃基因一致。對于酶切正確的表達載體進 行測序，測序結果表明，cr纟/基因已連接到表達載體pRKR5上，該表達載體命 名為pRKR5-crtl (載體構建策略見圖4)。
實施例四表達載體轉化大腸桿菌SiH (i)s!W感受態細胞的制備
取-80。C保藏的大腸桿菌S^劃線于LB平板上，37 。C過夜培養；挑單菌落 接種于10ml LB培養液中，37 °C, 250 rpm,振蕩培養過夜；取lml過夜培養 物加入100ml LB培養液中，37 。C, 250 rpm，振蕩培養2小時；將100 ml培 養物置于冰水中10分鐘4吏細菌冷卻到0 °C;然后于4。C, 2500 rpm，離心7分 鐘；棄上清，用10ml冰浴預冷的0. 1M CaCL重懸；4 °C ， 2000 rpm，離心5分 鐘；棄上清，用2 ml冰浴預冷的0. 1M CaCL重懸，冰水中靜置2小時備用。
(2 )轉化
取100 jj 1冰浴的Sn」感受態細胞加到預冷的1. 5ml EP管中，再加入1 ja l構建好的表達載體pRKR5-crtl質粒顧a，輕輕地混合均勻，冰水中放置30分 鐘；然后于42 。C熱激90秒，迅速置于冰水中，^L置2分鐘；加入500jal LB 培養液，37 。C, 150 rpm，振蕩培養1小時；取50 ju 1菌液均勻涂布于含有 10 jig/ml四環素的LB平板上，37 。C,倒置培養過夜。次日，于四環素抗性平 板上正常生長的為S^轉化菌。同時，按照上述轉化方法將pRKR5質粒DNA轉入
Sn-i做為對照。
實施例五表達載體經接合轉移到兄^力aero2Ves突變林TC72
按照Coomber等(Coomber SA,—Chaudhri M, Connor A， Britton G, Hunter CN. Localized transposon Tn5 mutagenesis of the photosynthetic gene cluster of Rhodobacter sphaeroides. Mol Microbiol. 1990;4(6):977-989 )報道的方法，將轉座 子Tn5插入類球紅細菌RS-1 cW/基因中獲得類球紅細菌突變抹TC72。突變抹 TC72內雖然crt基因族是完整的，但由于Tn5的插入而使其類胡蘿卜素合成途 徑停留在八氯番茄紅素，該代謝途徑crf/基因及下游基因的表達均被中斷。將TC72劃線于含有20 jag/ml新霉素的M22+培養基上，34°C,黑暗，倒置 培養3天；挑取TC72單菌落接種于10ml含有20 ju g/ml新霉素的M22+培養液 中，34°C， 250rpm,黑暗振蕩培養過夜；次日，4°C, 6000rpm，離心10分鐘收 集菌體，lml LB培養液重懸菌體；刮取S17—i轉化菌單菌落加入100 jn 1 LB細菌 重懸液中，充分混勻，然后滴到充分干燥的LB培養基上，34°C,培養6h-8小 時，從LB培養基上刮取細菌，1 ml M22+重懸菌體，取100 ju 1重懸菌液涂布于 M22+培養基上(含有四環素2jug/ml，新霉素20 ju g/ml )， 34 。C ，黑暗培 養3 -4天左右即可看到紅色菌落；由于表達載體pRKR5-crtl和pRKR5上含有 四環素抗性基因，類球紅細菌突變株TC"基因組中含有新霉素抗性基因，只有 含有表達載體pRKR5-crtl或pRKR5質粒DNA的類球紅細菌才能在具有這兩種抗 生素的培養基中正常生長，所以這些紅色菌落即為含有表達載體pRKR5-crtl或 pRKR5質粒DNA的類球紅細菌；挑取單菌落接種到10 ml M22+培養液(四環素 2ng/ml，新霉素20ng/ffll)中，34°C， 250rpm，黑暗振蕩培養過夜；次曰， -8(TC菌種保藏。
實施例六調控氧濃度誘導表達載體的表達
將含有表達載體pRKR5-crtl的工程菌TC72-pRKR5-cr11劃線培養于M22+ 培養基(四環素2jug/ral，新霉素20 Mg/ml)上，34°C,黑暗倒置培養4 天；挑取單菌落接種到10ml M22+培養液(四環素:2 |ag/ml,新霉素20 |ng/ml ) 中，34°C， 220rpm，黑暗條件下振蕩培養過夜；取lml過夜培養物接種到100 ml M22+培養液中(四環素2jug/ml,新霉素20jug/ml,培養液體積為容器的20 % )， 34°C， 220rpm，黑暗條件下振蕩培養20小時；加入相同抗生素濃度的M22+ 液體培養基，直至培養基與培養瓶體積比為60%， 34°C，轉速170rpm,誘導培 養20h。同時，按照上述條件培養TC72 (M22+培養基內不添加四環素)和包含 表達載體pRKR5的TC72估文為陰性對照。
含有表達載體pRKR5-crtl的工程菌TC72-pRKR5-crtl經調控氧濃度誘導后， 菌體呈紅色，而TC72和包含pRKR5的TC72經誘導后沒有發生顏色變化，仍然是綠 色，這說明工程菌中的crtl基因在TC72中實現了表達，表達的重組酶具有生物 活性，使得一條新的代謝途徑在工程菌內建成，該途徑完成了一種紅色天然色 素的合成。實施例七番茄紅素的提取及鑒定 (l)番茄紅素的提取
番茄紅素易溶于氯仿、苯等有機溶劑，可溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石 油醚、己烷，難溶于曱醇、乙醇，不溶于水。選取丙酮從光合細菌破壁細胞中 提取番茄紅素。另外番茄紅素非常容易被氧化，因此經歷破碎與提取幾個工程 后，它的損失比較嚴重，而且在保存工程中，也要采用必要的防氧化措施。在 萃取的有機溶劑中加入合適的抗氧化劑，可以對萃取液中的番茄紅素起到保護 作用，延緩它被氧化的時間。因而選擇在萃取液中選擇加入1%的二丁基羥基甲
苯(BHT )。
將培養好的菌液4。C, 6000 rpm離心15min收集菌體。用滅菌水洗滌兩次， 得到的菌體按1:5的比例加入磷酸緩沖液進行超聲波破碎(60瓦，破碎15s,間 隔5s，工作20次)。破碎后的菌液按照一定的配比加入含BHTl。/。的丙酮進行萃取， 不斷振蕩使之充分混合，靜置10min后4。C, 6000rpm離心15min使之分層，取上 清液即為萃取出的色素溶液。
(2)番茄紅素的鑒定
1)紫外分光光度計鑒定
對于番茄紅素而言，它用紫外分光光度計檢測會有特征峰出現，其中在 472nm處有一強吸收峰。根據這一性質，我們將得到的色素溶液以丙酮為對照， 將從工程菌TC72-pRKR5-crtl、 TC72和TC72-pRKR5中提取的色素溶液以及番茄 紅素標準品分別用分光光度計(UV-2450日本島津)在380 600nm波長范圍內 掃描，得到的吸收光鐠如圖6。圖中，1為番茄紅素標準品，2為工程菌所產色素， 3為TC72所產色素，4為TC72-pRKR5所產色素。從圖中看出工程菌與番茄紅 素標準品的吸收峰基本相同，均具備番茄紅素的三指形特征吸收峰，3個吸收峰 分別為446nm、 472nm、 508nm，最大吸收峰都在472腿處，而TC72和TC72-pRKR5 由于不產番茄紅素因而不具備其三指形特征吸收峰。測定樣品在472nm下的吸 光值，樣品類胡蘿卜素的含量按照以下公式計算番茄紅素(mg)—昆合液體積x混 合液在472腿下的吸光值xl0+2500。根據以上公式計算出番茄紅素含量為 1. 52mg/gDCW，每升發酵液可得2. 36g干菌體。
2 ) HPLC鑒定首先精確稱取5mg番茄紅素標準品，用二氯曱烷溶解后定容至25ml，使其 質量濃度為0. 2mg/ml，經HPLC測定后作為標準參照。
取破碎菌體萃取上清液12000rpm離心5min，再次取上清液，上柱前經過 0.45nm孔徑的無菌濾膜過濾除菌，進樣量為20j^l,每個樣品的分析時間設為 20min,得到色素的HPLC分析圖譜。色譜條件為Diamonsi 1 C18色譜柱(5 p ， 250 mm x 4.6mm );流動相為曱醇乙腈二氯曱烷(40 : 30 : 30 ， V/V)，檢 測波長472 nm,柱溫為25°C，流速為1 ml/rain,進樣量為2(^1。測定結果如圖7 所示，圖中，(l)為番茄紅素標準品，(2)為工程菌所產色素，(3)為TC72所 產色素，(4)為TC72-pRKR5所產色素。從圖中可以看出工程菌所產色素的保留 時間為8. 741min，和番茄紅素標準品的保留時間9.178相近，而TC72-pRKR5和 TC72所產色素在此保留時間內沒有特征峰，從吸收光譜和HPLC分析可以推斷， 工程菌中合成的紅色的天然色素為番茄紅素。
本發明所述的番茄紅素的制備方法的流程示意圖如圖8所示，本發明的實 驗結果表明，利用PCR技術擴增出fi^/"/s力er々/coh的cr〃基因并連接到含 強啟動子Pi/c的表達載體pRKR5上，構建表達質粒pRKR5-crtl，通過接合轉移 的方式將其導入光合細菌y /w^7&cfei" ^/^ei^A/es突變抹TC72中，由于啟動 子/^c在厭氧條件下高效表達，調控氧濃度可誘導工程菌累積紅色色素，經HPLC 和吸收光譜分析，工程菌中合成的色素為番茄紅素，工程菌的生物量(干重) 為2. 36gDCW/L，番茄紅素含量可達1.52mg/gDCW，該發明為實現工業化生產番
茄紅素奠定了初步的基礎，在生產實踐中具有潛在的應用價值。
雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發明，任何所 屬技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作些許的更動 與改進，因此本發明的保護范圍當視權利要求所界定者為準。序列表
〈110>重慶大學
〈120〉 一種番茄紅素的制備方法
〈130>
<160> 3
<170〉 Patent In version 3.2
<210> 1
<211〉 360
<212〉 DNA
〈213〉以S2/R2為引物擴增出；wc啟動子和SD的核苷酸序列
<400> 1
ctctg33ttcgcctcggsc3ccctcgtttttgcsgcsgcgsgsggctgcgggscggccct60
gtggggccgggscsggcagcgtcsatttcccgcgcgcctgcggcaaaattgtcccttttc120
33gccgtt3cgcsgg3ttcccggccgaitctggcggccsst33gtcgc3cccaasscggcc180
ttgtcsgcc33csctgsc3ttgwtctgtcsgcgc33tgtatgcgagccg240
gggcgg3tcsgM3tcgccgccsggtctctccggtctcgtcgssgcccgc300
gtgc3ggcccccgtcgstttscc3gttggg360
〈210〉 2 <211〉 479 〈212〉 醒
<213〉以S3/R3為引物擴增出/wc終止于的核tr酸序列
<400〉 2
atattctagacg33tc3cc3cgccctgcgtgcccgcttcccggsggtgcssaaggctact60
cctttgggggtctttgsastctcsgcctgcaggttcgcgccctcggcgcgcttcgccgca120
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ggcgssacccttggtt33ca33gsccttccctgccccgacttgtcc3C33240
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tctttttcgaaatctttgaat3ccctsggcsgcgscctgcctgcc3ctgc479
<210> 3
<211〉 11489
〈212〉 DNA
<213〉表達載體pRKR5質粒腿序列
<400> 3
ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggstggga 60
ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc 120
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ctctgcccctcaagtgtcaaggatcgcgcccctC3tctgtcsgtsgtcgcgcccctcsag360
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ctggstcgcctcctgg33ctggctttcggt33gccgtttc3C3CCC3t3311040tttgctccgc gccttggttg aacatagcgg tgacagccgc cagcacatga gagaagttta 11100
gctaaacstt tctcgcscgt caacaccttt agccgctaaa actcgtcctt ggcgt3aca3 11160
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sagccggttg ccgccgccgc caggatcgcg ccgatgstgc cggccacscc ggcc3tcgcc 11340
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cggcacgtcs atgcttccgg gcgtcgcgct cgggctgatc gcccstcccg ttsctgcccc 11460
gatcccggca atggcaaggs ctgccagcg 11489
<210〉 4
<211> 26
<212> 廳
<213> PCR引物S2
〈400〉 4
ctctgaattc gcctcggaca ccctcg 26
<210〉 5
<211〉 29
<212> DNA
<213〉 PCR引物R2
<4()0〉 5
ctctgsgctc tgtgtcgtct cccssctgg 29
<210> 6
<211> 29
〈212〉 DM
〈213〉 PCR引物S3
<400> 6
atattctaga cgaatcacca cgccctgcg 29
<210〉 7 .
<211〉 23
<212〉 DM
<213> PCR引物R3
<400〉 7
ststctgcsg csgtggcsgg csg 23210〉 8 〈211> 36 <212> 腿
<213> crt/基因引物Sl的序列 <400〉 8
gcgcgagctc catatgaata gaactacagt aattgg 36
210> 9 <211> 34 <212〉 DNA
〈213〉 crt/基因引物Rl的序列 〈400> 9
gcgctctaga tcasgccsgs tcctccagca tcaa 3權利要求
1. 一種番茄紅素的制備方法，其特征在于有步驟(1)提取E.herbicola基因組DNA，通過PCR克隆出crtI基因全長；(2)構建pRKR5載體；(3)將crtI基因片段連接到pRKR5載體上，構建表達載體pRKR5-crtI；(4)將pRKR5-crtI質粒導入光合細菌Rhodobacter sphaeroides突變株TC72中構建工程菌TC72-pRKR5-crtI；(5)將步驟(4)得到的工程菌TC72-pRKR5-crtI調控氧濃度誘導表達，得到細胞內累積紅色色素的番茄紅素。
2. 根據權利要求1所述的番茄紅素的制備方法，其特征在于所述pRKR5表 達載體的構建有以下步驟以S2/R2為引物擴增出/wc啟動子和SD序列，pwc啟動子和SD序列具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，以S3/R3為引物擴增出/wc終止子，；wc終止 子具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；將所述；wc啟動子基因和SD序列插入到pRK415的AcoRI和^cl之間，p〃c 終止子基因插入到pM415的J&I和尸WI之間，構建策略見圖3 。
全文摘要
本發明公開了一種番茄紅素的制備方法，利用PCR技術擴增出Erwinia herbicola的crtI基因并連接到含強啟動子Puc的表達載體pRKR5上，構建表達質粒pRKR5-crtI，通過接合轉移的方式將其導入光合細菌Rhodobacter sphaeroides突變株TC72中，由于啟動子Puc在厭氧條件下高效表達，調控氧濃度可誘導工程菌累積紅色色素，經HPLC和吸收光譜分析，工程菌中合成的色素為番茄紅素，工程菌的生物量(干重)為2.36gDCW/L，番茄紅素含量可達1.52mg/gDCW，該發明為實現工業化生產番茄紅素奠定了初步的基礎，在生產實踐中具有潛在的應用價值。
文檔編號C12P5/02GK101285076SQ20081006980
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月5日 優先權日2008年6月5日
發明者宇 潘, 胡宗利, 姣 薛, 趙志平, 陳國平 申請人:重慶大學