殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法

專利名稱：：殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法
技術領域：
：本發明屬于酶固定化
技術領域：
，特別涉及殼聚糖衍生物固定化酶的方法。
背景技術：
：研究表明胰凝乳蛋白酶在醫藥上具有消化膿汁和壞死組織，消凈創面，局部消炎，促進血腫吸收，創面愈合等功效；在食品、輕工等行業具有分解蛋白質、皮革脫毛等功能。目前，使用的游離酶，主要有成本高，利用率低，排放的廢酶還污染環境等缺點。因此，研制使用半衰期較長的新型固定化胰凝乳蛋白酶，具有重要的經濟、社會價值。殼聚糖是自然界含量豐富、價廉易得的天然高分子材料，因其具有良好的成膜、保濕、吸附、抗菌等特性，廣泛用于醫藥、食品、輕工等行業中。又因殼聚糖具有易生物降解，安全無毒，生物相容性好，容易進行化學修飾，特別是殼聚糖衍生物具有親水性好、剛性大、機械性良好等特點，是優異的固定化酶的載體。現有固定化酶的方法包括包埋法、吸附法、共價結合法及交聯法等。包埋法是指將酶包埋在高分子凝膠細微網格或半透膜中，其制備工藝簡便且反應條件較為溫和，可獲得較高的酶活力回收，由于只有小分子可通過高分子凝膠網格，且擴散阻力會導致酶活力降低，因此包埋法只適合作用于小分子底物和產物的酶。吸附法則是指酶被吸附于不溶性載體的固定化方法，該法操作簡便，條件溫和，酶的活力損失很少，載體價廉易得，可反復使用，但是，酶與載體的相互作用力弱，易脫落。共價結合法是指酶與載體以共價鍵結合的固定化方法，該法固定化的酶，不易脫落，可連續使用相當長的時間，但載體的活化比較復雜，且結合法有較激烈的反應而使酶活力損失較大。交聯法指用雙功能或多功能試劑使酶與載體之間交聯的固定化方法，交聯法固定化酶穩定性好，如寧波大學學報1999年3月第1期的"殼聚糖固定化胰蛋白酶的制備及理化性質研究"一文，公開了從甲克質粗品中獲得的殼聚糖，再在交聯劑戊二醛的作用下將胰蛋白酶固定到該殼聚糖上的方法；該法的不足之處在于從甲克質粗品中難以獲得純凈的殼聚糖，而且直接以殼聚糖作為載體，胰蛋白酶大分子靠近時位阻大，直接交聯固定化酶效率低，容易引起胰蛋白酶分子自交聯。又如公開號CN1904043A的"一種納米磁性殼聚糖固定化酶的制備方法"專利，公開了使用表面含有酰氯基團的納米磁性殼聚糖與酶蛋白分子在磁場作用下反應制備固定化酶的方法；該法的不足之處在于制備一定粒徑的納米磁性殼聚糖載體比較困難，同時納米磁性殼聚糖在使用過程中容易被氧化而發生沉聚，導致酶活力的降低。
發明內容本發明的目的是針對現有殼聚糖樹脂固定化酶方法的不足之處，提供一種殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法。該方法具有操作簡單、酶活回收率高、反應條件溫和、制備成本低等特點，同時固定化胰凝乳蛋白酶較游離胰凝乳蛋白酶酶熱穩定性增加，適用pH值降低，半衰期延長，而且可反復利用，減少污染，充分利用資源。本發明的機理由于殼聚糖分子鏈中含有大量的游離氨基，這些氨基有一孤對電子，具有很強的親核性，而戊二醛是一種常用的雙官能團試劑，可與殼聚糖的氨基發生交聯反應生成席夫堿結構，交聯主要是在分子間發生；二環己基碳二亞胺(DCC)是一種常用的接肽縮合劑，它可以活化羧基，即加強羧基碳原子的親電性，使得親核的非離子化氨基很容易對它進行攻擊，從而發生縮合反應生成肽鍵。再次以戊二醛作為交聯劑，使胰凝乳蛋白酶表面游離氨基與精氨酸殘余氨基發生shiff反應，即得殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶。本發明的目的是這樣實現的一種殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，以市售殼聚糖為原料，先制備交聯殼聚糖微球，再制備殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂，最后進行希夫反應固定化胰凝乳蛋白酶而得成品。具體的方法步驟如下(1)制備交聯殼聚糖樹脂以市售殼聚糖為原料，先將殼聚糖加入鹽酸質量百分數為1~5%稀鹽酸中，攪拌溶解后，就制備出殼聚糖質量百分數為1~4%的殼聚糖酸性溶膠。后按殼聚糖酸性溶膠液體石蠟的體積比為1:1~4的比例，將殼聚糖酸性溶膠緩慢加入液體石蠟中，攪拌2030min，并加熱升溫至35~45°C制得到殼聚糖石蠟溶液后，再加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.05~0.25%的吐溫80，進行乳化2030min，然后加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.050.3%戊二醛交聯劑，使殼聚糖分子的部分氨基參與交聯反應，從而使線性殼聚糖分子轉變成殼聚糖微球。再加入占殼聚糖石蠟溶液質量分數為0.01~0.1%碳酸鈣致孔劑，進行制孔反應50~70min制得殼聚糖微球的懸浮液。最后用氫氧化鈉溶液調節殼聚糖微球懸浮液的pH值為910，并加熱至5575。C，攪拌固化2~4h，再過濾，棄濾液，收集濾渣。對濾渣先用乙醇洗滌36次，后用質量分數為1~5%稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣，再用蒸餾水洗滌至中性，就制備出交聯殼聚糖樹脂。(2)殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的制備第(1)步完成后，將第(1)步制備出的交聯殼聚糖樹脂，加入精氨酸質量分數為0.52.0%精氨酸溶液中，振蕩2030min，使殼聚糖樹脂懸浮于精氨酸溶液中，制備出殼聚糖質量分數為0.5~2.5%的殼聚糖_精氨酸溶液。然后按殼聚糖一精氨酸溶液中的精氨酸二環己基碳二亞胺(DCC)的摩爾比為1:0.52.5的比例，在殼聚糖一精氨酸溶液中，加入DCC接肽縮合劑，進行縮合反應2040min,使殼聚糖樹脂中另一部分氨基與精氨酸的羧基發生縮合反應，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂。最后經過濾，棄濾液，收集濾渣。對濾渣先用乙醇洗滌36次，后用蒸餾水透析812h后，再過濾，再棄濾液，再收集濾渣，就制備出殼聚糖一精氨酸陰離樹脂。(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先將胰凝乳蛋白酶加入pH值為4.5-6.0磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻，就制備出胰凝乳蛋白酶的摩爾濃度為0.050.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液。后按第(2)步制備出的殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中胰凝乳蛋白酶的質量比為1:1525的比例，將殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中，在3060。C的恒溫水浴條件下，振蕩2040min，使殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂懸浮于胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中。再按戊二醛殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的質量比為1:614的比例，將戊二醛加入到懸浮殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中，并置于振蕩器中振蕩，進行希夫反應5070min后，進行抽濾，棄濾液，收集樹脂濾渣，對樹脂濾渣用磷酸鹽緩沖液洗滌47次，除去游離胰凝乳蛋白酶，再抽濾，再棄濾液，再收集殼聚糖一精氨酸陰離子固定化胰凝乳蛋白酶濾渣而得成品。本發明采用上述技術方案后，主要有以下特點(1)固定化效果好。由于精氨酸分子中胍基和羧基之間具有一個長脂肪鏈結構一(CH2)4，當殼聚糖樹脂與精氨酸反應后，相當于給殼聚糖樹脂接上許多"懸臂"，以其作為固定化酶的載體，避免了酶蛋白大分子靠近載體時位阻大，直接交聯固定化酶效率低，且易引起酶分子自交聯等缺點，所以固定化酶效果更好；以該固定化酶進行酶促反應，更利于固定化酶與反應介質接觸，提高反應效率。(2)固定化酶的穩定性高。本發明方法是采用戊二醛交聯法固定胰凝乳蛋白酶，增加酶與載體之間的結合力，提高固定化酶的機械強度，避免使用過程中酶分子從載體上脫落的缺陷，使得酶的穩定性得到了進一步的增強。(3)適用pH值降低。游離胰凝乳蛋白酶的最適pH值為8.0，而固定化胰凝乳蛋白酶的最適pH值僅為5.92，進一步擴大了胰凝乳蛋白酶的使用范圍。(4)生產成本低。本發明方法采用殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化的胰凝乳蛋白酶更容易與有機溶劑分離，更有利于酶的回收利用，提高酶的使用效率，降低生產成本。(5)酶活回收率高、半衰期長。固定化的胰凝乳蛋白酶熱穩定性增加，酶活回收率高達89.95%，半衰期延長，即75。C半衰期長達18小時，4。C半衰期長達56天。(6)本發明方法簡單，操作簡便，生產過程中反應條件溫和，便于推廣應用。采用本發明方法制備出的殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶，可廣法應用于醫藥、食品、輕工等行業的各種水相及非水相的酶促反應。具體實施例方式下面結合具體實施方式，進一步說明本發明。實施例一一種殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法的具體步驟如下(1)制備交聯殼聚糖樹脂以市售殼聚糖為原料，先將殼聚糖加入鹽酸質量百分數為2%稀鹽酸中，攪拌溶解后，就制備出殼聚糖質量百分數為2%的殼聚糖酸性溶膠。后按殼聚糖酸性溶膠液體石蠟的體積比為1:1的比例，將殼聚糖酸性溶膠緩慢加入液體石蠟中，攪拌25min，并加熱升溫至40°C制得到殼聚糖石蠟溶液后，再加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.1%的吐溫80，進行乳化25min，然后加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.15%戊二醛交聯劑，使殼聚糖分子的部分氨基參與交聯反應，從而使線性殼聚糖分子轉變成殼聚糖微球。再加入占殼聚糖石蠟溶液質量分數為0.05%碳酸鈣致孔劑，進行制孔反應60min制得殼聚糖微球的懸浮液。最后用氫氧化鈉溶液調節殼聚糖微球懸浮液的pH值為9.5，并加熱至60。C，攪拌固化3h，再過濾，棄濾液，收集濾渣。對濾渣先用乙醇洗滌5次，后用質量分數為3%稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣，再用蒸餾水洗滌至中性，就制備出交聯殼聚糖樹脂。(2)殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的制備第(1)步完成后，將第(1)步制備出的交聯殼聚糖樹脂，加入精氨酸質量分數為l%精氨酸溶液中，振蕩25min，使殼聚糖樹脂懸浮于精氨酸溶液中，制備出殼聚糖質量分數為1.5%的殼聚糖一精氨酸溶液。然后按殼聚糖一精氨酸溶液中的精氨酸二環己基碳二亞胺(DCC)的摩爾比為1:1的比例，在殼聚糖一精氨酸溶液中，加入DCC接肽縮合劑，進行縮合反應30min，使殼聚糖樹脂中另一部分氨基與精氨酸的羧基發生縮合反應，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂。最后經過濾，棄濾液，收集濾渣。對濾渣先用乙醇洗滌4次，后用蒸餾水透析10h后，再過濾，再棄濾液，再收集濾渣，就制備出殼聚糖一精氨酸陰離樹脂。(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先將胰凝乳蛋白酶加入pH值為5.9磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻，就制備出胰凝乳蛋白酶的摩爾濃度為0.06mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液。后按第(2)步制備出的殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中胰凝乳蛋白酶的質量比為1:20的比例，將殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中，在45。C的恒溫水浴條件下，振蕩30min，使殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂懸浮于胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中。再按戊二醛殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的質量比為i:8的比例，將戊二醛加入到懸浮殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中，并置于振蕩器中振蕩，進行希夫反應60min后，進行抽濾，棄濾液，收集樹脂濾渣，對樹脂濾渣用磷酸鹽緩沖液洗滌6次，除去游離胰凝乳蛋白酶，再抽濾，再棄濾液，再收集殼聚糖一精氨酸陰離子固定化胰凝乳蛋白酶濾渣而得成品。實施例二一種殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法的具體步驟如下(1)制備交聯殼聚糖樹脂同實施例一，特征是將殼聚糖加入鹽酸質量百分數為1%稀鹽酸中，制備出殼聚糖質量百分數為1%的殼聚糖酸性溶膠。殼聚糖酸性溶膠液體石蠟的體積比為i:2，攪拌20min，并加熱升溫至35。C，再加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.05%的吐溫80，進行乳化20min，然后加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.05%戊二醛交聯劑，再加入占殼聚糖石蠟溶液質量分數為0.01%碳酸鈣致孔劑，進行制孔反應50min。用氫氧化鈉溶液調節殼聚糖微球懸浮液的pH值為9，并加熱至55。C，攪拌固化2h，對濾渣先用乙醇洗滌3次，后用質量分數為1%稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣。(2)殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的制備同實施例一，特征是精氨酸溶液中精氨酸質量分數為0.5%，振蕩20min，制備出殼聚糖質量分數為0.5%的殼聚糖_精氨酸溶液。殼聚糖_精氨酸溶液中精氨酸二環己基碳二亞胺(DCC)的摩爾比為1:0.5，進行縮合反應20min，對濾渣先用乙醇洗滌3次，后用蒸餾水透析8h。(3)胰凝乳蛋白酶的固定同實施例一，特征是先將胰凝乳蛋白酶加入pH值為4.5磷酸鹽緩沖液中，制備出胰凝乳蛋白酶的摩爾濃度為0.05mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液。第(2)步制備出的殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中胰凝乳蛋白酶的質量比為1:15,在30°C的恒溫水浴條件下，振蕩20min，戊二醛殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的質量比為1:6，進行希夫反應50min，對樹脂濾渣用磷酸鹽緩沖液洗滌4次。實施例三一種殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法的具體步驟如下(1)制備交聯殼聚糖樹脂同實施例一，特征是將殼聚糖加入鹽酸質量百分數為5%稀鹽酸中，制備出殼聚糖質量百分數為4%的殼聚糖酸性溶膠。殼聚糖酸性溶膠液體石蠟的體積比為i:4，攪拌30min,并加熱升溫至45。C，再加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.25%的吐溫80,進行乳化30min，然后加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.3%戊二醛交聯劑，再加入占殼聚糖石蠟溶液質量分數為0.1%碳酸鈣致孔劑，進行制孔反應70min。用氫氧化鈉溶液調節殼聚糖微球懸浮液的pH值為10，并加熱至75。C，攪拌固化4h，對濾渣先用乙醇洗滌6次，后用質量分數為5%稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣。(2)殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的制備同實施例一，特征是精氨酸溶液中精氨酸質量分數為2.0%，振蕩30min，制備出殼聚糖質量分數為2.5%的殼聚糖一精氨酸溶液。殼聚糖一精氨酸溶液中精氨酸二環己基碳二亞胺(DCC)的摩爾比為1:2.5,進行縮合反應40min，對濾渣先用乙醇洗滌6次，后用蒸餾水透析12h。(3)胰凝乳蛋白酶的固定同實施例一，特征是先將胰凝乳蛋白酶加入pH值為6.0磷酸鹽緩沖液中，制備出胰凝乳蛋白酶的摩爾濃度為0.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液。第(2)步制備出的殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中胰凝乳蛋白酶的質量比為1:25，在60。C的恒溫水浴條件下，振蕩40min，戊二醛殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂的質量比為1:14的比例，進行希夫反應70min后，對樹脂濾渣用磷酸鹽緩沖液洗滌7次。實驗結果將實施例13制備出的產品，進行了殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶最適催化溫度、最適催化pH值、酶活回收率、半衰期試驗。試驗結果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從上表可知，殼聚糖一精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的熱穩定性較游離胰凝乳蛋白酶高，固定化胰凝乳蛋白酶最適催化溫度為70°C，較游離胰凝乳蛋白酶提高10°C;固定化胰凝乳蛋白酶的最適催化pH值為5.92，較游離胰凝乳蛋白酶降低了2.08，擴大了固定化胰凝乳蛋白酶的使用范圍；固定化胰凝乳蛋白酶的活回收率高達到89.95%，75°C的半衰期長達18小時，4。C的半衰期長達56天，提高了固定化胰凝乳蛋白酶的利用效率，降低污染，充分利用資源。權利要求1.一種殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于具體的方法步驟如下(1)制備交聯殼聚糖樹脂以市售殼聚糖為原料，先將殼聚糖加入鹽酸質量百分數為1～5％稀鹽酸中，就制備出殼聚糖質量百分數為1～4％的殼聚糖酸性溶膠，后按殼聚糖酸性溶膠∶液體石蠟的體積比為1∶1～4的比例，將殼聚糖酸性溶膠緩慢加入液體石蠟中，攪拌20～30min，并加熱升溫至35～45℃制得到殼聚糖石蠟溶液后，再加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.05～0.25％的吐溫80，進行乳化20～30min，然后加入占殼聚糖石蠟溶液體積分數為0.05～0.3％戊二醛交聯劑，再加入占殼聚糖石蠟溶液質量分數為0.01～0.1％碳酸鈣致孔劑，進行制孔反應50～70min制得殼聚糖微球的懸浮液，最后用氫氧化鈉溶液調節殼聚糖微球懸浮液的pH值為9～10，并加熱至55～75℃，攪拌固化2～4h，再過濾，棄濾液，收集濾渣，對濾渣先用乙醇洗滌3～6次，后用質量分數為1～5％稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣，再用蒸餾水洗滌至中性；(2)殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂的制備第(1)步完成后，將第(1)步制備出的交聯殼聚糖樹脂，加入精氨酸質量分數為0.5～2.0％精氨酸溶液中，振蕩20～30min，制備出殼聚糖質量分數為0.5～2.5％的殼聚糖-精氨酸溶液，然后按殼聚糖-精氨酸溶液中精氨酸∶二環己基碳二亞胺的摩爾比為1∶0.5～2.5的比例，在殼聚糖-精氨酸溶液中，加入DCC接肽縮合劑，進行縮合反應20～40min，最后經過濾，棄濾液，收集濾渣，對濾渣先用乙醇洗滌3～6次，后用蒸餾水透析8～12h后，再過濾，再棄濾液，再收集濾渣；(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先將胰凝乳蛋白酶加入pH值為4.5～6.0磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻，就制備出胰凝乳蛋白酶的摩爾濃度為0.05～0.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液，后按第(2)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂∶胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中胰凝乳蛋白酶的質量比為1∶15～25的比例，將殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中，在30～60℃的恒溫水浴條件下，振蕩20～40min，再按戊二醛∶殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂的質量比為1∶6～14的比例，將戊二醛加入到懸浮殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂的胰凝乳蛋白酶磷酸鹽溶液中，并置于振蕩器中振蕩，進行希夫反應50～70min后，進行抽濾，棄濾液，收集樹脂濾渣，對樹脂濾渣用磷酸鹽緩沖液洗滌4～7次，再抽濾，再棄濾液，再收集殼聚糖-精氨酸陰離子固定化胰凝乳蛋白酶濾渣。全文摘要一種殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，涉及殼聚糖衍生物固定化酶的方法。本發明以市售殼聚糖為原料，先制備交聯殼聚糖樹脂。再制備殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂，最后進行希夫反應固定化胰凝乳蛋白酶而得成品。本發明具有方法簡單，操作簡便，反應條件溫和，生產成本低，固定化酶的穩定性高，酶活回收率高達89.95％，半衰期長，即75℃的半衰期長達18小時，4℃的半衰期長達56天，最適pH值僅為5.92。采用本發明制備出的產品，可廣泛應用于醫藥、食品、輕工業等行業的各種水相及非水相的酶促反應。文檔編號C12N11/10GK101285060SQ20081006979公開日2008年10月15日申請日期2008年6月3日優先權日2008年6月3日發明者周小華,柳小平,東王,娟王申請人:重慶大學