腸出血性大腸桿菌o157h7志賀毒素ⅱb表位肽及其應用的制作方法

專利名稱：：腸出血性大腸桿菌o157h7志賀毒素ⅱb表位肽及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥生物
技術領域：
，尤其涉及腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIB表位肽及其應用。
背景技術：
：腸出血性大腸桿菌(EHEC)(M57:H7為重要的新發人畜共患傳染病原,其引發的食物中毒在世界各地包括中國均有大規模的暴發流行。2006年在美國爆發的波及26個州的毒菠菜事件就是由該菌污染所致，1999年末至2000年初，在我國東部部分地區發生了迄今為止世界上最大規模的0157:H7感染爆發流行，因此，該菌的感染己經成為一個全球性的公共衛生問題。由于EHEC0157:H7菌培養容易、感染力強、傳播途徑多樣，使0157菌極有可能作為未來軍事斗爭的細菌武器和生物恐怖戰劑。美國疾病控制中心(CDC)己將EHEC0157菌列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。此外，EHEC0157:H7菌的烈性致病因子還有可能用于新型生物武器——^S因武器的構建。然而目前對其感染尚缺乏有效的防治方法。研究證明抗生素可促使0157菌釋放致死性志賀毒素(Shigatoxin,Stx)，從而使患者病情加重。2002年中國國家衛生部制定的"腸出血性大腸桿菌0157:H7感染性腹瀉應急處理預案(試行)"第5條規定腸出血性大腸桿菌0157:H7病人和疑似病人禁止使用抗生素。因此，無論從公共衛生還是生物反恐的需要出發，探索新的治療手段迫在眉睫。研究表明志賀毒素II(Stx2)是0157:H7主要的致病因子。Stx2進入血液循環后，可引起靶組織器官，如腎小球和結腸內皮細胞的損傷，最終導致溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴重并發癥的發生。因此，Stx2是目前治療0157:H7菌感染的藥物研究的主要耙標。Stx2毒素由1個A亞基(32KDa)和5個B亞基(7.7KDa/單體)組成。Stx2通過B亞基與受體Gb3結合后，進入細胞內質網A亞基被裂解為Al和A2兩個片段后，Al片斷經內質網進入細胞質作用真核生物核糖體28SrRNA，導致蛋白質合成停止。這種作用會導致腎內皮細胞、腸上皮細胞、Vero細胞、Hela細胞或其他任何具有Gb3受體的細胞的死亡。鑒于Stx2的結構和致病其機理，針對Stx2的藥物研究主要集中在Stx2的疫苗和中和性抗體的研究，但目前國內外尚無Stx2的疫苗和中和性抗體上市。鑒于以上研究背景本發明預測并和成了Stx2Al毒性亞單位上的B細胞表位，并對預測的B細胞表位的免疫原性和免疫保護性進行了鑒定，本發明的B細胞表位肽可用于EHEC0157:H7感染的肽疫苗研究和利用B細胞表位肽制備Stx2特異的單克隆抗體診斷和治療0157:H7的感染。
發明內容本發明的一個目的是提供一種來自腸出血性大腸桿菌0157:H7Stx2Al毒性亞單位的B細胞表位肽，其具有下述氨基酸序列中的至少一種1)SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；2)將所述SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列。本發明的另一目的是提供一種編碼上述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7Stx2Al毒性亞單位上的B細胞表位肽的核苷酸序列，其具有下述核苷酸序列中的至少一種1)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的核苷酸序列；2)與所述SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的核苷酸序列不同但具有相同編碼產物的核苷酸序列。本發明的另一目的是提供上述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽的應用，其可用于制備預防或治療腸出血性大腸桿菌感染的藥物組合物，或制備單克隆抗體。本發明所述的預防或治療腸出血性大腸桿菌感染的藥物，其包含上述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIAl亞單位的B細胞表位肽和藥學上可接受的載體，其中上述的藥學上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。如本發明的B細胞表位肽可以與佐劑不耐熱腸毒素一起組成藥物制劑后口服,與鋁佐劑一起組成藥物制劑靜脈輸注射。本發明所述的另外一種可預防或治療腸出血性大腸桿菌感染的疫苗組合物，其也包含上述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽。本發明的B細胞表位肽及其藥物制劑可用于預防和治療腸出血性大腸桿菌0157:H7感染所致出血性腸炎；溶血性尿毒綜合征及血栓性血小板減少紫癜。本發明的思路如下首先基于Stx2與配體腺嘌呤相互作用的晶體結構，按B細胞表位的預測原則，對包含毒性活性位點的Stx2Al亞單位的氨基酸序列進行分析，預測Stx2Al的B細胞表位，并采用DNAStar軟件分析評價，人工合成B表位肽，用合成的B細胞表位肽偶聯載體蛋白鑰孔戚血藍素(keyholelimpethemocyanin，KLH)后免疫日本大耳兔，鑒定其免疫原性；DotELISA和Westernblot鑒定兔抗血清的特異性，獲得了4條B細胞表位肽；用4條B細胞表位肽分別免疫Balb/c小鼠，以天然Stx2攻毒，鑒定4條B細胞表位肽的免疫保護性，結果顯示P1B細胞表位肽能刺激機體產生中和Stx2的抗體，該肽段位于Stx2Al片段N端第5380位氨基酸，包含Stx2的毒性活性位點一位于Stx2Al片段N端77位上的酪氨酸。本發明的B表位肽可以用來研制人或小鼠用的0157:H7的肽疫苗，可以用來開發預防或治療EHEC0157:H7感染的多肽藥物。本發明經過深入而廣泛的研究，基于EHEC0157:H7的Stx2蛋白的晶體結構，輔以DNAStar軟件分析，選擇性的合成了4條可能誘導機體產生體液免疫應答的B細胞表位肽，并對其免疫特性進行評價，發現此4條表位肽能夠在Balb/c小鼠體內誘導特異性的體液免疫應答，產生的抗血清均能與Stx2蛋白發生特異性結合。因此，此四條多肽可以用于EHEC0157:H7的多表位肽疫苗的設計；本發明的4條多肽可以用于人及動物用的疫苗及藥物的開發。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。圖1A-圖1B表示斑點酶聯免疫吸附試驗鑒定兔抗血清的特異性A.斑點酶聯免疫吸附試驗包被抗原的示意圖；B.斑點酶聯免疫吸附試驗結果1.PIB表位肽兔抗血清2.P2B表位肽兔抗血清3.P3B表位肽兔抗血清4.P4B表位肽兔抗血清5.正常兔血清；6.PBS空白對照圖2表示免疫印跡鑒定兔抗血清的特異性1.陰性兔血清的免疫印跡2.PIB表位肽兔抗血清的免疫印跡3.P2B表位肽兔抗血清的免疫印跡4.P3B表位肽兔抗血清的免疫印跡5.P4B表位肽兔抗血清的免疫印跡；具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解的是，這些實施例僅用于說明本發明而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明制備方法的簡單改進，及對本發明表位肽及其核苷酸序列的利用都屬于本發明要求保護的范圍。實施例lB表位的篩選鑒定1.表位肽的預測及合成在NCBI的結構數據庫檢索EHEC0157:H7的Stx2以及Stx2與配體腺嘌呤晶體結構解析圖(編號1R4P和2GA4)，網址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezdb=Structure)。基于Stx2與酉己體月泉口票呤相互作用的立體結構，依據暴露在蛋白質表面、含伸展區和無規則巻曲或卩轉角、以及肽段長度約1530個氨基酸等B表位肽的預測原則，選取Stx2Al毒性片段上的氨基酸肽段，采用DNAStar軟件對預測的氨基酸肽段進行親水(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karplus-Schulz方案)、二級結構(Gamier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wol仿案)等參數進行評價，如果某肽段中，抗原指數S1、親水性指數20、氮基酸的表面可能性指數21，同時其內部或附近又具有柔性結構，則這一區段為抗原表位的可能性較大。通過BLAST檢索比較預測的B細胞表位肽與人、兔、鼠的同源性后，最終確定本研究所用的4條可能的B細胞表位肽序列，人工合成4條可能的B表位多肽(由北京中科亞光公司協助合成，4條B細胞表位肽的基本信息見表l)，并分別偶聯載體蛋白KLH。表1預測合成后的Stx2B表位的基本信息<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P328-49LEHISQGTTSVSVINHTPPGSY222428.5892P4100-114VPGVTTVSMTTDSSY_151648.2卯2.STX2A1B細胞表位肽免疫原性鑒定2.1免疫日本大耳兔雄性日本大耳兔，隨機分成5組，每組兩只，分別用偶聯KLH的4條B細胞表位肽(P1-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)加完全福氏佐劑皮下多點注射免疫，每只注射lml，含抗原肽1mg，此后每隔兩周用同樣劑量加不完全弗氏佐劑加強免疫，共加強3次，再隔兩周后不加佐劑同樣劑量免疫一次，一周后放血，間接ELISA檢測抗血清效價，對照組PBS替代多肽進行免疫，免疫方法及程序相同。2.2ELISA檢測血清效價間接ELISA的包被抗原分別為4條未偶聯KLH的多肽和天然Stx2。具體方法如下包被用包被液將抗原稀釋為2pg/ml，加入酶標板，100^1/孔，4°C過夜，PBS洗滌5遍，空干；封閉力口1。/。BSA封閉液300(il/孔，4。C過夜，洗滌5遍，空干，密封4。C保存備用；兔血清稀釋按1:100，1:200，1:400......進行系列倍比稀釋至第IO管；取包被好的酶標板，加入依次稀釋血清100pl/孔，37。C水浴30分鐘，洗滌5遍，空干；加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體工作液(l:20000稀釋)IOOpl/孔，37。C水浴30分鐘，洗滌4遍，空干；加底物顯色液100|11/孔，室溫避光反應510分鐘；加終止液100pl/孔，立即在酶標儀上以492nm波長測定OD值；結果判斷OD值大于或等于陰性對照(小鼠免疫前血清1:10倍稀釋)的2.1倍為抗Stx2抗體陽性。呈抗體陽性的最大稀釋倍數即為抗體效價。結果間接ELISA結果顯示4條合成多肽均能剌激日本大耳兔產生抗多肽和Stx2的抗體，兔血清抗體與多肽和天然Stx2反應的效價如表2所示，而免疫前的兔血清與PBS免疫對照組血清檢測為陰性，此結果表明本發明的4條B細胞表位多肽具有較好的反應原性和免疫原性。表2B細胞表位肽免疫兔血清效價<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3多克隆抗體的特異性鑒定3.1斑點酶聯免疫吸附試驗檢測抗體的特異性包被抗原在硝酸纖維膜(NC膜)上分別加入4條抗原肽、KLH及天然Stx2各2(il/點，待其室溫干燥。封閉將包被抗原的NC膜浸入5。/。的脫脂奶粉中，置37"C1小時。洗滌棄去封閉液，用TTBS漂洗膜3次，每次l分鐘，NC膜下點溪水濾紙和海綿。分別加入4種抗血清和陰性兔血清，2pl/點，置37。C15分鐘，TTBS沖洗3次。NC膜入HRP標記的羊抗兔IgG，工作濃度為1:10000，置37'C15分鐘，TTBS沖洗3次。加入DAB顯色液，輕搖至顯色，蒸餾水漂洗終止反應。3.2免疫印跡檢測抗體的特異性取已處理的天然Stx2，并設定蛋白質分子量標準，在5%濃縮膠，15%分離膠上進行垂直SDS-PAGE，80V，30分鐘，調整電壓為150V，約1.5小時。電泳結束后，取下凝膠，一塊用考馬斯亮藍R-250染液快速染色，另一塊置于硝酸纖維素膜上，15V恒壓電轉移過夜。轉移后的硝酸纖維素膜在麗春紅S中染色1分鐘，標記蛋白質分子標準，再用蒸餾水脫去紅色。將轉移膜置于封閉液(TTBS)中，37°C，150rpm，輕輕振搖封閉60分鐘棄去封閉液，用洗滌液(TTBS)漂洗膜4次，每次10~15分鐘。加入以洗滌液1:1000稀釋的兔抗血清，37°C，150rpm，輕輕振搖反應60分鐘。TBS漂洗膜4次，每次IO~15分鐘。加入以TBS稀釋的HRP標記的羊抗小兔IgG(l:20000)，150rpm，輕輕振搖反應60分鐘。TBS漂洗4次，每次10~15分鐘。加入DAB顯色液，輕搖至顯色，蒸餾水漂洗終止反應。斑點酶聯免疫吸附試驗檢測結果(圖1A和圖1B所示)顯示4條B細胞表位肽制備的兔抗血清分別在相應的多肽抗原、KLH和Stx2處出現顯色斑點，為陽性，而正常兔血清上述抗原處未出現顯色，為陰性，該結果說明:4條B細胞表位肽制備的兔多克隆抗體能特異的與B細胞表位肽、Stx2和載體蛋白KLH反應；采用免疫印跡對4種兔抗血清的特異性作進一步鑒定，結果(圖2)表明在分子量約32KDa處即天然Stx2的A亞單位處，可見清晰的單一陽性反應條帶；而用免疫前血清為一抗孵育，無特異反應條帶出現，說明4條B細胞表位肽誘導機體產生特異針對Stx2A亞單位的多克隆抗體。實施例2免疫小鼠攻毒試驗篩選保護性B細胞表位肽68周齡雌性Balb/c小鼠，隨機分成5組，每組5只，分別用偶聯KLH的4條B細胞表位肽(P1-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)皮下多點加腹腔注射免疫Balb/c小鼠，每只注射0.51ml，含抗原100嗎，免疫時間為0、2、4、6、8周，共5次，第1次加入福氏完全佐劑第24次加福氏不完全佐劑，最后一不加佐劑同樣劑量腹腔注射免疫一次，第2、3、4、5次免疫后7d斷尾采血，采用間接ELISA法檢測免疫Balb/c小鼠血清效價(操作步驟同前)；計算抗體的陽轉率和幾何滴度平均數(GMT)和平均增長倍數。末次免疫10天后每只小鼠腹腔注射致死劑量(LDuk))的天然Stx2，50ng/kg，觀察10天內各組小鼠的存活率。對照組PBS替代多肽進行免疫，免疫方法及程序相同。表3免疫小鼠血清特異性抗體陽轉率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析ELISA檢測結果(表3)，以免疫前后抗體滴度增長4倍為陽轉標準，分別計算各組免疫2、3、4、5次后的抗體陽轉率、幾何平均滴度(GMT)及平均增長倍數。表3數據顯示，免疫2次后P1、P2、P3、P4組的陽轉率分別為93.3%、93.3%、73.3°/。和66.7%，免疫4次后的陽轉率分別為100%、100%。93.3%和86.7%。表4免疫小鼠血清Stx2抗體水平<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>如表4所示4組抗Stx2抗體的GMT隨免疫次數的增加呈逐次上升趨勢，第5次免疫后P1、P2、P3、P4的GMT分別為11380、12211、6948、5171，分別是免疫前的113.8倍、122.1倍、69.5倍、5L7倍，而PBS對照組的GMT為1:106僅為免疫前的1.06倍。(表3~4)。以上結果證明4條單一的B細胞表位肽均能刺激小鼠產生特異、有效的體液免疫應答。可以作為肽疫苗組分。Stx2攻毒保護試驗結果顯示小鼠腹腔注入50ng/kg(LDKK))劑量天然Stx2后，各組小鼠均先后出現了較重的中毒癥狀，表現為皮毛蓬松皺摺、活動呆滯、攝食減少、精神委靡嗜睡。尤其以對照組、P2、P3、P4的小鼠中毒癥狀出現快(24h72h)，且呈進行性加重直至死亡，而P1組的小鼠中毒癥狀出現相對較慢(96h)，癥狀出現后有部分小鼠能夠逐漸恢復。各組小鼠具體的存活與死亡情況表5所示表5小鼠免疫后攻毒的保護效果觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*.P<0.01vsPBS組；**.P〉0.05vsPBS組由表5可見，PBS對照組小鼠攻毒后144h內全部死亡，而P1、P2、P3、P4抗原免疫組的部分小鼠能夠耐受致死劑量的Stx2毒素攻擊而得以存活，10天后的存活率分別為70%、20%、10%、10%，經f撿驗分析Pl組與PBS對照組有顯著性差異(PO.Ol)，P2、P3、P4免疫組和PBS對照組無顯著性差異(PX).05)，說明單一的P1B細胞表位肽能夠刺激機體產生中和Stx2的抗體，具有較強的免疫保護作用，而單一的P2、P3、P4B細胞表位肽保護效率差，但不能排除P2、P3、P4B細胞表位肽聯合應用時會產生免疫保護作用。此結果為利用B細胞表位肽制備Stx2中和性單克隆抗體和0157:H7肽疫苗的候選組分提供了有力的實驗依據。雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發明，任何所屬
技術領域：
的技術人員，在不脫離本發明之精神和范圍內，當可作些許之更動與改進，因此本發明之保護范圍當視權利要求所界定者為準。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120〉腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIB表位肽及其應用<130><160>8<170>Pate幽version3.2<210>1<211>28<212>PRT<213>來0腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀^素IIA1亞單位的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>1AspHeArgGlyLeuAspValTyrGinAlaArgPheAspHisLeuArg151015LeulielieGluGinAsnAsnLeuTyrValAlaGly2025<210>2<211>27<212>PRT<213>來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIAl亞單位的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>2ValThrValThrAlaGluAlaLeuArgPheArgGinlieGinArgGlu151015PheArgGinAlaLeuSerGluThrAlaProVal2025<210>3<211>22<212>PRT<213>來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>3LeuGluHislieSerGinGlyThrThrSerValSerVallieAsnHis151015ThrProProGlySerTyr20<210>4<211>15<212>PRT<213>來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIAl亞單位的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>4ValProGlyValThrThrValSerMetThrThrAspSerSerTyr151015<210>5<211>84<212>DNA<213>編碼腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>5'gatatacgagggcttgatgtctatcaggcgcg加gaccatcttcgtctgattattgag60caaaataatttatatgtggccggg84<210>6<211>81<212>DNA<213>編碼腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIAl亞單位的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>6gtcactgtcacagcagaagccttacgcttcaggcagatacagagagaatttcgtcaggca60ctgtctgaaactgctcctgtg81<210>7<211>66<212>DNA<213>編碼腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIAl亞單位的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>7cttgaacatatatctcaggggaccacatcggtgtctgttattaaccacaccccaccgggc60agttat66<210>8<211>45<212>DNA<213>編碼腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>8gtgcccggtgtgacaacggtttccatgacaacggacagcagttat4權利要求1.一種來自腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽，其特征在于具有下述氨基酸序列中的至少一種1)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的氨基酸序列；2)將所述SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列。2.—種編碼權利要求1所述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽的核苷酸序列，其特征在于具有下述核苷酸序列中的至少一種1)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的核苷酸序列；2)與所述SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的核苷酸序列不同但具有相同編碼產物的核苷酸序列。3.權利要求1所述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽在制備預防或治療腸出血性大腸桿菌感染的藥物組合物中的應用。4.權利要求1所述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽在制備單克隆抗體中的應用。5.—種預防或治療腸出血性大腸桿菌感染的藥物，其特征在于包含權利要求1所述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽和藥學上可接受的載體。6.根據權利要求5所述的預防和治療腸出血性大腸桿菌感染的藥物，其特征在于所述的藥學上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。7.—種預防或治療腸出血性大腸桿菌感染的疫苗，其特征在于包含權利要求1所述的來自腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素IIA1亞單位的B細胞表位肽。全文摘要本發明屬于醫藥生物
技術領域：
，涉及來自腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素IIB表位肽及其應用，其中優選的4個多肽來自EHECO157:H7志賀毒素IIA1亞單位(Stx2A1)的B細胞表位本發明所述腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素IIB表位肽可用于制備診斷和治療EHECO157感染及其并發癥方面藥物中。文檔編號C12N15/31GK101314616SQ20081006978公開日2008年12月3日申請日期2008年5月30日優先權日2008年5月30日發明者璐劉,張衛軍,浩曾,毛旭虎,云石,萍羅,鄒全明,剛郭申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學