專利名稱：厭氧反硝化細菌篩選用培養基及篩選厭氧反硝化細菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種反硝化細菌篩選用培養基及篩選反硝化細菌的方法。
技術背景現有厭氧反硝化細菌的分離周期較長，同時不易獲得純菌株，即使獲得了 菌株，也沒有很好的硝酸鹽和亞硝酸鹽的降解效果。 發明內容本發明的目的是為了解決現有的厭氧反硝化細菌分離困難、分離周期長， 最后分離到的菌株反硝化效能低的問題，提供了一種厭氧反硝化細菌篩選用培 養基及篩選厭氧反硝化細菌的方法。本發明厭氧反硝化細菌篩選用培養基分液體篩選用培養基和固體篩選用培養基兩種；每升液體篩選用培養基是由3.0~5.0g KN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01 0.06g MgS04'7H20、 1.0~3.0g K2HP04、8 15g酒石酸鉀鈉、0.5 2g KH2P04、 0.1 2gFeCl2'6H2O、 0.1~2g CaCl2'2H20、 0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水 組成，液體篩選用培養基的pH值為7.5;每升固體篩選用培養基是由3.0 5.0g KN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01~0.06g MgS04'7H20、 1.0 3.0g K2HP04、 8~15g 酒石酸鉀鈉、0.5~2gKH2PO4、 0.1 2gFeCl2.6H2O、 0.1~2g CaCl2.2H20、 10~15g 瓊脂粉、0.05~0.4mL濃度為0.2 0.4g/L的刃天青溶液、0.3~0.8g L-半胱氨酸和 余量的蒸餾水組成，固體篩選用培養基的pH值為7.5。本發明的液體培養基和固體培養基均處于厭氧狀態。本發明厭氧反硝化細菌的篩選方法是按下述步驟實現的 一、配制上述的 厭氧反硝化細菌液體篩選培養基和固體篩選培養基；二、取厭氧去除氮工藝的 污水或活性污泥，在厭氧條件下進行倍比稀釋；三、固體培養基分離將步驟 一配制固體篩選用培養基在沸水浴中融化，然后冷卻至45 55。C，迅速將步驟 二稀釋的污水或活性污泥用注射器注入固體培養基中，采用Hungate厭氧及"滾 管"方法在冷水中混合，然后放入恒溫培養箱中在厭氧、35 38。C條件下培養，直至長出菌落；四、液體培養基富集挑取步驟三培養的單菌落接種到步驟一 配制的液體篩選用培養基，厭氧環境下培養7天 14天；五、分離純化；六、 重復步驟三至五操作進行多分離純化，直至獲得純菌株；七、對步驟六得到的 純菌株性能檢測，選取厭氧反硝化性能優異的菌株，即完成對厭氧反硝化細菌 菌株的篩選。本發明整個篩選過程在厭氧條件下進行。步驟三中冷水的水溫為l(TC。 步驟五中分離純化是對液體培養富集的菌液進行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重 復菌株。本發明采用滾管培養固體篩選用培養基、進行多次的分離純化，在厭氧條 件下，縮短了培養周期，獲得厭氧反硝化細菌菌株的同時減少工作量。本發明 篩選的厭氧反硝化細菌對N(V的最高去除率達到了 47.1%。
圖1是F1菌單株原子力掃描電鏡照片。圖2是F1菌對硝酸鹽的去除率曲 線圖，-"代表NCV的濃度變化，4-代表N03'的濃度變化，-x-代表N(V的去 除率。圖3是F1菌對硫酸鹽的利用率的曲線圖。圖4是具體實施方式
九中Fl 菌株和相近的菌株16S rDNA序列構建的NJ系統發育樹。
具體實施方式
本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式中厭氧反硝化細菌篩選用培養基分液體篩選 用培養基和固體篩選用培養基兩種；每升液體篩選用培養基是由3.0~5.0gKN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01~0.06g MgS04'7H20、 1.0~3.0g K2HP04、 8~15g 酒石酸鉀鈉、0.5~2gKH2PO4、 0.1~2gFeCl2'6H2O、 (U 2gCaCl2'2H20、 0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養基的pH值為7.5;每升固 體篩選用培養基是由3.0~5.0g KN03 、 3.0~5.0g NaN03 、 0.01~0.06g MgS04.7H20、 1.0~3.0gK2HPO4、 8 15g酒石酸鉀鈉、0.5~2gKH2P04、 0.1 2g FeCl2.6H20、 0.1~2g CaCl2.2H20、 10~15g瓊脂粉、0.05~0.4mL濃度為0.2 0.4g/L 的刃天青溶液、0.3 0.8gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選用培養基 的pH值為7.5。本實施方式的液體培養基和固體培養基均處于厭氧狀態。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是每升液體篩選用 培養基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03gMgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 10g 酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2.6H2O、 0.2gCaCl2.2H20、 0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養基的pH值為7.5。 本實施方式的液體培養基處于厭氧狀態。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是每升固體篩選用 培養基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5gK2HPO4、 10g 酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2'6H2O、 0.2gCaCl2.2H20 、 12g瓊脂粉、 0.1mL濃度為0.2g/L的刃天青溶液、0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固 體篩選用培養基的pH值為7.5。本實施方式的固體培養基處于厭氧狀態。
具體實施方式
四本實施方式中厭氧反硝化細菌的篩選方法整個篩選過程 在厭氧條件下進行，方法是按下述步驟實現的 一、配制如權利要求l所述的 厭氧反硝化細菌液體篩選培養基和固體篩選培養基；二、取厭氧去除氮工藝的 污水或活性污泥，在厭氧條件下進行倍比稀釋；三、固體培養基分離將步驟 一配制固體篩選用培養基在沸水浴中融化，然后冷卻至45 55"C，迅速將步驟 二稀釋的污水或活性污泥用注射器注入固體培養基中，采用Hungate厭氧及"滾 管"方法在冷水中混合，然后放入恒溫培養箱中在厭氧、35 38"C條件下培養， 直至長出菌落；四、液體培養基富集挑取步驟三培養的單菌落接種到步驟一 配制的液體篩選用培養基，厭氧環境下培養7天 14天；五、分離純化；六、 重復步驟三至五操作進行多分離純化，直至獲得純菌株；七、對步驟六得到的純菌株性能檢測，選取厭氧反硝化性能優異的菌株，即完成對厭氧反硝化細菌 菌株的篩選。本實施方式步驟一中采用蒸煮方法配制液體培養基，在蒸煮過程中通入高純氮氣(高純氮氣中氧氣濃度^2ppm)以驅除氧氣，同時向培養基中加入還原 劑(L-半胱氨酸)，利用其還原作用去除氧，降低氧化還原電位，使氧化還原 電位(ORP)低于-100mV，由此液體培養基處于厭氧狀態。本實施方式在步 驟一中采用蒸煮方法配制固體培養基，在煮沸之前，需不斷攪拌，防止瓊脂凝 固在鍋底。在煮沸之前加入0.2%的刃天青溶液(指示劑)待培養基煮沸后，加入L-半胱氨酸0.5g，通入高純氮氣驅氧30min，然后在12rC條件下滅菌 20min。本實施方式中將厭氧工藝的污水或活性污泥的水樣注入到經滅菌的含有 高純氮氣的厭氧管中；水樣需在4'C下保存。根據樣品的具體情況可以進行厭 氧的倍比稀釋。經檢測，本實施方式對NO,最高去除率達到了47.in/c)。而且本實施方式 篩選的菌株不進行硫酸鹽還原。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟三中菌落的 培養溫度為36'C。其他與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟三中菌落的培養溫度為37°C具體實施方式
七:本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟三中冷水的水溫為10°C。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟五中分離純化是對液體培養富集的菌液進行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重復菌株。
具體實施方式
九本實施方式污水選取大慶油田四廠杏九聯合污水處理站。微生物分子生態學手段證實污水中有厭氧反硝化功能細菌，進行厭氧管的采樣。采用具體實施方式
四中方法進行篩選。將本實施方式的篩選菌株標號為F1，對其進行下述試驗 1、對F1菌株形態和生理生化鑒定本實施方式篩選的厭氧反硝化細菌菌體大小為寬0.20 0.4|imx長 3.0 4.0^m;菌體形態短桿，極生鞭毛；生長溫度為20 40°C,生長pH值為 7.5，葡萄糖氧化發酵發酵產酸:平板菌落呈白色、圓形且表面隆起；水處理除污菌株生理生化指標接觸酶 + 淀粉水解 -油脂水解 +乙酰甲基醇 -甲基紅+明膠液化產u引哚+尿素水解檸檬酸鹽利用+葡萄糖發酵硝酸鹽還原+果糖發酵產硫化氫+乳糖發酵產氨試驗+蔗糖發酵革蘭氏染色G-乙醇發酵，石蕊牛奶檢測石蕊還原、牛奶凝固。2、 Fl菌株的系統發育分析，基于F1菌株和相近的菌株16S rDNA序列 構建的NJ系統發育樹如圖4所示，經測序后獲得1398bp的16S rDNA序列， GenBank登錄號為DQ450463，采用鄰接法(NJ)構建系統進化樹。系統發育樹 15個菌株的平均遺傳距離為0.085。系統進化表明，Fl菌株的16SrDNA序列 與C7o^n^wm 6wOWcww(AY442812)的相似性為99°/。，結合菌株的形態學和生 理學特性，初步鑒定C7o欲Wwm ^0/n'cwm Fl。3、對本實施方式篩選的厭氧反硝化細菌對N02—、 N(V、 SC^濃度變化 的影響以及對N(V去除率的驗證，驗證方法如下室內配置改良的篩選用培養基，在接種量為5%的條件下每2411取樣，離 子色譜測量N(VN02-和SO^的濃度，由圖2(Fl菌對硝酸鹽的去除率曲線圖) 可知本實施方式篩選的菌株的N03'濃度變化范圍是從初始的6220.87mg/L，降 低到3290.82mg/L，在第3天的時候，去除率有了大幅增加，為39.17%。最高 去除率達到了47.1%。而N(V濃度變化不大，整個過程中最高為580.32mg/L。 可知本實施方式篩選的菌株具有反硝化功能。由圖3 (Fl菌對硫酸鹽的利用率 的曲線圖)可知菌株在反硝化過程中，篩選用培養基中SO^的濃度變化范圍 從25.73mg/L到31.38m^L，可認為本實施方式篩選的菌株不進行硫酸鹽還原。 可以確定該菌株應該是厭氧反硝化細菌。
權利要求
1、厭氧反硝化細菌篩選用培養基，其特征在于厭氧反硝化細菌篩選用培養基分液體篩選用培養基和固體篩選用培養基兩種；每升液體篩選用培養基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸鉀鈉、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養基的pH值為7.5；每升固體篩選用培養基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06gMgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸鉀鈉、0.5～2g KH2PO4、0.1～2gFeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、10～15g瓊脂粉、0.05～0.4mL濃度為0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選用培養基的pH值為7.5。
2、 根據權利要求1所述的厭氧反硝化細菌篩選用培養基，其特征在于每 升液體篩選用培養基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 lOg酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5g FeCl2'6H20、 0.2g CaCl2'2H20、 0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養基的pH值為7.5。
3、 根據權利要求1所述的厭氧反硝化細菌篩選用培養基，其特征在于每 升固體篩選用培養基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 lOg酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2'6H2O、 0.2gCaCl2.2H20 、 12g瓊脂粉、0.1mL濃度為0.2g/L的刃天青溶液、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸 餾水組成，固體篩選用培養基的pH值為7.5。
4、 利用權利要求1所述篩選用培養基的厭氧反硝化細菌的篩選方法，整 個篩選過程在厭氧條件下進行，其特征在于厭氧反硝化細菌的篩選方法是按下 述步驟實現的 一、配制如權利要求1所述的厭氧反硝化細菌液體篩選培養基 和固體篩選培養基；二、取厭氧去除氮工藝的污水或活性污泥，在厭氧條件下 進行倍比稀釋；三、固體培養基分離將步驟一配制固體篩選用培養基在沸水 浴中融化，然后冷卻至45 55。C，迅速將步驟二稀釋的污水或活性污泥用注射 器注入固體培養基中，采用Hungate厭氧及"滾管，，方法在冷水中混合，然后放 入恒溫培養箱中在厭氧、35 38。C條件下培養，直至長出菌落；四、液體培養 基富集挑取步驟三培養的單菌落接種到步驟一配制的液體篩選用培養基，厭氧環境下培養7天 14天；五、分離純化；六、重復步驟三至五操作進行多分 離純化，直至獲得純菌株；七、對步驟六得到的純菌株性能檢測，選取厭氧反 硝化性能優異的菌株，即完成對厭氧反硝化細菌菌株的篩選。
5、 根據權利要求4所述的厭氧反硝化細菌的篩選方法，其特征在于步驟 三中菌落的培養溫度為36°C。
6、 根據權利要求4所述的厭氧反硝化細菌的篩選方法，其特征在于步驟 三中菌落的培養溫度為37。C。
7、 根據權利要求4所述的厭氧反硝化細菌的篩選方法，其特征在于步驟 三中冷水的水溫為l(TC。
8、 根據權利要求4所述的厭氧反硝化細菌的篩選方法，其特征在于步驟 五中分離純化是對液體培養富集的菌液進行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重復菌 株。
全文摘要
厭氧反硝化細菌篩選用培養基及篩選厭氧反硝化細菌的方法，它涉及一種反硝化細菌篩選用培養基及篩選反硝化細菌的方法。本發明解決了現有的厭氧反硝化細菌分離困難、分離周期長，最后分離到的菌株反硝化效能低的問題。厭氧反硝化細菌篩選用培養基分液體篩選用培養基和固體篩選用培養基兩種。菌株的篩選一、取污水或活性污泥；二、配制篩選用培養基；三、固體培養基分離；四、液體富集；五、重復三至四的操作；六、功能驗證；選取性能優異的菌株即可。本發明篩選的菌株能去除硝酸鹽，且去除率高。篩選用培養基的針對性強。本發明方法簡單有效、分離快速、培養周期短、工作效率高，并篩選出目前篩選不到的污水處理性能優異的菌株。
文檔編號C12Q1/04GK101402990SQ200810064948
公開日2009年4月8日 申請日期2008年7月18日 優先權日2008年7月18日
發明者呂曉磊, 偉 孫, 博 王, 放 馬, 利 魏 申請人:哈爾濱工業大學