專利名稱：：一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法
技術領域：
：本發明涉及一種質粒載體的構建方法。
背景技術：
：釀酒酵母(Saccharaw^cescwevWae)不具備木糖代謝能力，因此無法發酵植物纖維水解液生產乙醇。目前采用代謝工程手段在釀酒酵母中人為建立木糖代謝途徑——木糖還原酶-木糖醇脫氫酶(XR-XDH)途徑或木糖異構酶(XI)途徑。但是經代謝工程改造后的釀酒酵母的木糖利用率仍然很低，而且發酵副產物木糖醇產生量高，導致乙醇得率難以提高。
發明內容本發明的目的是為了解決目前經代謝工程改造后的釀酒酵母木糖利用率仍然很低，且發酵副產物木糖醇產生量高的問題，而提供的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法。表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法按以下步驟進行一、克隆質粒pKT0150中KanR基因；二、克隆釀酒酵母^KW基因；三、克隆質粒pKT0150中ADH1終止子片段；四、克隆釀酒酵母中2.2kbrDNA片段；五、回收、純化步驟一至四制備的基因片段，然后再分別與pGEMTEasy載體在16。C的條件下連接10~12h，得至ljpGMT-KanR、pGMT-XKSl、pGMT-ADHlT和pGMT-rDNA;六、構建質粒pR，以釀酒酵母整合載體p406ADHl為骨架引入有抗性標記的基因KanR;七、構建質粒pRK，將X凡S7基因加入質粒pR;八、構建質粒pRKT，將ADH1終止子片段加入質粒pRK;九、將2.2kbrDNA片段加入質粒pRKT，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5，-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3，，下游引物序列為5'-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3';步驟二中擴增上游引物序列為5'-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3，，下游引物序列為5'-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3，；步驟三中擴增上游引物序列為5，-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3'，下游引物序列為5，-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3，；步驟四中擴增上游引物序列為5，-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3，，下游引物序列為5'-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT畫3'。木酮糖激斷xyliiloldnase，XK)能夠催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖，是木糖代謝的限速步驟之一，處于木糖代謝物進入磷酸戊，途徑(PPP)的節點位置。雖然釀酒酵母自身具有木酮糖代謝的下游酶系，但由^其活性較低限制了木糖代謝流向磷酸戊糖途徑(PPP)，從而導致經代謝工程改造后的釀酒酵母的木糖利用率依然較低，發酵副產物木糖醇產生量高，乙醇得率仍較低。釀酒酵母內源性超表達木酮糖激酶基因Zi^7可以加速木糖代謝流，提高釀酒酵母的木糖利用率和乙醇得率。本發明方法構建了一種攜帶有木酮糖激酶基因義KW的、適合于釀酒酵母工業菌株的多拷貝整合表達載體，該載體可以將超表達木酮糖激酶基因"S7高拷貝整合到釀酒酵母的染色體基因組上，從而實現了木酮糖激酶^X^的超量穩定表達，疏通了釀酒酵母利用木糖產乙醇的木糖代謝流，提高了木糖的利用率，降低了副產物木糖醇的產量。將本發明方法構建的質粒轉入釀酒酵母中，對比發酵試驗證明轉入本發明方法構建質粒的釀酒酵母的乙醇得率比經代謝工程改造后的釀酒酵母的乙醇得率高30%以上，說明本發明方法構建的質粒轉入釀酒酵母后可以消除木糖轉化乙醇代謝途徑上的限制，提高了下游酶系的活性。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法按以下步驟進行一、克隆質粒pKT0150中KanR基因；二、克隆釀酒酵母XX^基因；三、克隆質粒pKT0150中ADH1終止子片段；四、克隆釀酒酵母中2.2kbrDNA片段；五、回收、純化步驟一至四制備的基因片段，然后再分別與pGEMTEasy載體在16'C的條件下連接1012h,得到pGMT-KanR、pGMT-XKSl、pGMT-ADHlT和pGMT-rDNA;六、構建質粒pR，以釀酒酵母整合載體p406ADHl為骨架引入有抗性標記的基因KanR;七、構建質粒pRK，將JOC^基因加入質粒pR;八、構建質粒pRKT，將ADH1終止子片段加入質粒pRK;九、將2.2kbrDNA片段加入質粒pRKT，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5，-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC畫3，，下游引物序列為5，-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3，；步驟二中擴增上游引物序列為5，-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC畫3，，下游弓l物序歹'J為5，-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3，；步驟三中擴增上游弓I物序列為5，國CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3，，下游弓I物序歹U為5，-TCTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG曙3';步驟四中擴增上游弓I物序列為5，-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3，，下游引物序列為5，-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3，。本實施方式步驟五用上海華舜生物工程有限公司生產的DNA膠回收試劑盒(GelExtractionMiniKit)進行回收。步驟五中的四組連接體系均為10pL，均由lpL純化的基因片段、lpL的pGMT-easy、l|tiL10xT4DNA連接緩沖液、lpLT4DNA連接酶和余量重蒸餾水的組成。本實施方式步驟五得到的連接產物pGMT-KanR、pGMT-XKSl、pGMT-ADHIT和pGMT-rDNA可以轉化￡.eo//DH5a進行保存擴增。本實施方式步驟一上游引物中加入Ndel的識別位點(加下劃線部分)，步驟一下游引物中加入AatII的識別位點(加下劃線部分)；步驟二上游引物中加入SpeI的識別位點(加下劃線部分)，步驟二下游引物中加入SalI的識別位點(加下劃線部分)；步驟三上游引物中加入SalI的識別位點(加下劃線部分)，步驟三下游引物中加入EagI的識別位點(加下劃線部分)；步驟四上游引物中加入NdeI的識別位點(加下劃線部分)，步驟四下游引物中加入EagI的識別位點(加下劃線部分)。本實施方式步驟四克隆的2.2kb的rDNA片段用于構建質粒同源重組位點，其中含有質粒用于線性轉化的HpaI單酶切位點。本實施方式質粒pKT0150購自于Addgene公司，釀酒酵母基因組DNA利用天凈沙公司的真菌基因組DNA提取試劑盒得到。本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態細胞和質粒等均容易購得，若無特殊要求則濃度為產品標注濃度。本實施方式步驟五至九參見試劑盒使用操作手冊。本實施方式步驟五至九各步驟得到的質粒經PCR驗證后可轉化入五.coh-DH5a中保存和擴增。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟六中的抗性標記為G418(遺傳霉素)。其它步驟及參數與實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟一中PCR反應體系為10^iL,由l|iL10xPCRbuffer、0.8piL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lixL濃度為lpmol/nL的上游引物、lpL濃度為lpmol/^iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL質粒pKT0150、0.2^iL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C2min，變性94°Clmin,退火45。Clmin，延伸72°C2min,共30個循環，延伸72。C7min。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中PCR反應體系為10pL，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、lpL濃度為lpmol/^iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2^L釀酒酵母基因組DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C5min，變性94。Clmin，退火55°Clmin，延伸72°C2min，共30個循環，延伸72。C10min。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg2+。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟三中PCR反應體系為10pL，由l^iL10xPCRbuffer、0.8|iL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^iL濃度為lpmol/nL的上游引物、l^iL濃度為lpmol/^iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL質粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C2min，變性94°Clmin，退火50°Clmin，延伸72°C2min，共30個循環，延伸72。C7min。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四中PCR反應體系為10^L，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/^L的上游引物、1&濃度為lpmol/^L的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2^iL釀酒酵母基因組DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C2min，變性94。Clmin,退火53。Clmin,延伸72。C2.5min，共30個循環，延伸72°C7min。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟六中用限制性內切酶NdeI和AatlI對p406ADHl和pGMT-KanR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pR。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式步驟六參見試劑盒使用操作手冊進行操作。.具體實施方式八本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟七中用限制性內切酶SpeI和SalI對質粒pR和pGMT-XKSl分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRK。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式步驟七參見試劑盒使用操作手冊進行操作。具體實施方式九本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟八中用限制性內切酶SalI和EagI對質粒pRK和pGMT-ADHIT分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRKT。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式步驟八參見試劑盒使用操作手冊進行操作。具體實施方式十本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟九中用限制性內切酶NdeI、EagI對質粒pRKT和pGMT-rDNA分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式步驟九參見試劑盒使用操作手冊進行操作。具體實施方式十一本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟五中抗性標記為G418;步驟一中PCR反應體系為lOpL，由1^L10xPCRbuffer、0.8nL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、l^L濃度為lpmol/pL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2^L質粒pKT0150、0.2^iL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C2min，變性94°Clmin,退火45°Clmin,延伸72°C2min,共30個循環，延伸72t:7min;步驟二中PCR反應體系為10^L,由l^iL10xPCRbuffer、0.8|jL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l|iL濃度為lpmol/|iL的上游引物、lpL濃度為lpmol/pL的下游引物、0.8mL濃度為25mmol/l的MgCl2、2jaL釀酒酵母基因組DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C5min,變性94°Clmin,退火55°Clmin，延伸72°C2min,共30個循環，延伸72。C10min;步驟三中PCR反應體系為10pL，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^L濃度為lpmol/j^L的上游引物、lpL濃度為lpmol/|iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、21iL質粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94i:2min，變性94。Clmin，退火50°Clmin,延伸72°C2min，共30個循環，延伸72°C7min;步驟四中PCR反應體系為10pL，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^L濃度為lpmol/pL的上游引物、l^L濃度為lpmol/nL的下游引物、0.8^L濃度為25mmol/L的MgCl2、2^L釀酒酵母基因組DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94。C2min,變性94°Clmin,退火53。Clmin，延伸72。C2.5min，共30個循環，延伸72。C7min;步驟六中用限制性內切酶NdeI和AatII對p406ADHl和pGMT-KanR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pR;步驟七中用限制性內切酶SpeI和SalI對質粒pR和pGMT-XKSl分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRK;步驟八中用限制性內切酶Sall和EagI對質粒pRK和pGMT-ADHlT分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRKT;步驟九中用限制性內切酶NdeI、EagI對質粒pRKT和pGMT-rDNA分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。將釀酒酵母菌劃線接種于不同G418濃度的YPD平板上，在30。C條件下培養72h，篩選出高拷貝的轉化子。然后將活化的釀酒酵母W5挑取單菌落接種于YPD液體培養基中，在30°C、200r/min條件下培養48h，再取lOOmL培養菌液在3500r/min條件下離心5min，棄去上清液后加入40mLlxTE清洗菌體，然后再在3500r/min條件下離心5min，棄上清液并加入2mLlxLiAc/0.5xTE,室溫放置10min，制成酵母菌感受態細胞。將已用Hpal線性化的本實施方式構建的表達木酮糖激酶基因的質粒、10.7nL魚鮭精DNA、100pL酵母菌HDY-01感受態細胞和700pLlxLiAc/40PEG-4000/lxTE混合，在3(TC條件下反應30min，之后加入88pLDMSO原液均勻混合，置于40'C水浴中熱激7min，然后13000r/min離心10s，棄上清液再加入lmLlxTE清洗2次，13000r/min離心10s，棄上清液后再加入50100pLlxTE，涂布于含G418的YPD平板培養基上，在3(TC條件下培養48h，得到高拷貝轉化子W-XK。將高拷貝轉化子W-XK接種40mL梯度稀釋的YEPD液體培養基(非選擇性壓力下)中搖瓶培養60世代(每24h為10世代)，每隔10世代，平板計數菌落數進行穩定性測定按公式計算，結果顯示60世代后的穩定性為99%,表明在非選擇性壓力下，整合于釀酒酵母染色體上的外源基因片段具有良好的遺傳穩定性，能適合用于工業生產的粗放環境。[質粒穩定性計算公式穩定性(％)=(帶有整合質粒的菌落數—總菌數)x100%]將轉化子W-XK在選擇壓力培養基(含G418的YEPD培養基)中培養至對數生長期，離心收集菌體并用100mmol/L磷酸緩沖液洗滌2次，然后溶于新配制的裂解緩沖液(100mmol/L磷酸緩沖液，0.5mmol/LEDTA，0.5mmo1/LDTT，lmmol/LPMSF，pH7.0)中，菌懸液加入玻璃珠(直徑為0.5mm)，在細胞破碎儀最大速度下處理3050s，在冰浴5min，破碎重復35次，再在10000g條件下離心10min，收集上清，即為粗酶液用于酶活性測定分析。(酶粗液蛋白質含量的測定按照蛋白質含量測定試劑盒操作說明進行。)本實施方式采用連續監測法測定木酮糖激酶酶活，選擇線性反應期來計算酶活力，測定原理如下d-木釅糖+atp木鵬糠激,(xk)>d_木酮糖5磷酸+ADp磷酸烯醇式兩,酸+adp糊酸激,(PK)>丙,酸+atpnadh+h+(LDH)>乳酸+nad+以上偶聯反應達到平衡后，木酮糖激酶(XK)轉化底物D-木酮糖的速度與反應體系中NADH的減少速度相等，通過測定NADH的減少速度可計算木酮糖激酶(XK),的活性。木酮糖激酶酶活單位定義在給定實驗條件下，每分鐘催化轉化lMmolNADH的酶量為一個酶活單位(即IU)。-!~X纖,/，)=#fi—22x10-^x10■公式中，S.22xl03:NADH的摩爾消光系數(l-mor1'^);^A140:/廁刻待漏櫸品在34Qnm被長tt光吸收；/廁劇待灑樣品在34Qnm波長的光吸收；fith1mm賴S飾粆數《s》；々、&R潘漏定過濯中所取的時f0l點tt鼸液的蛋白濃度(mgfe￡>，0.1;反您體系中加入的糧酶液fltf缽積(mL);ICh耱酶灌稀釋的修數。按表1中數據配制粗酶液中木酮糖激酶酶活測定反應體系，體積為0.9mL。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>木酮糖激酶酶活測定反應體系在室溫條件下平衡15min，加入稀釋10倍的粗酶液O.lmL，漩渦振蕩器振蕩混勻，以蒸餾水為空白對照，測量OD^，并使用自動記錄式分光光度計記錄樣品OD34。隨時間的變化。選取線性反應期，計算粗酶液中木酮糖激酶活性。酶活測定結果顯示，本實施方式方法構建的表達木酮糖激酶基因的質粒所轉化的釀酒酵母重組菌W-XK的木酮糖激酶活力較出發菌株W5大幅提高，出發菌株W5的酶活力為0.31U/mg，重組菌株W-XK的酶活力為2.8U/mg，酶活力提高了9倍，表明本實施方式方法構建的質粒載體轉化釀酒酵母后實現了木酮糖激酶基因的高效穩定表達。序列表<110>黑龍江大學〈120>—種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法〈歸8<210>1〈211>26<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223>根據質粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因在質粒中的相對位置設計的PCR擴增上游引物。<400>1ttccatatgtctgtttagcttgcctc26<210>2〈211>27<212>DNA<213>人工序列<220>〈223>根據質粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因在質粒中的相對位置設計的PCR擴增下游引物。〈400>2cttgacgtctatcatcgatgaattcga27〈210>3〈211>29<212>腿〈213>人工序列〈220〉<223>根據釀酒酵母Zfi:W的基因序列設計的PCR擴增上游引物。〈400>3cggetctaigtctcaatcttcagcaagcgac29<210>4〈211>28〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉根據釀酒酵母義/^/的基因序列設計的PCR擴增下游引物。<400>4cgcgtcgacaacggggaacaa3atgatg28<210〉5<211>31<212〉腿〈213>人工序列〈220>〈223>根據質粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1終止子片段在質粒中的相對位置設計的PCR擴增上游引物。<柳>5cgcgtcgacatttgttactgctgctggtatt31〈210>6〈211>26〈212〉<213〉人工序列<220〉〈223>根據質粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1終止子片段在質粒中的相對位置設計的PCR擴增下游引物。<400>6ctcggccgccctgttatccctagcgg26〈210〉7<211>29〈212>DNA<213>人工序列<220><223>根據釀酒酵母rDNA的基因序列設計的擴增2.2kb的rDNA片段的上游引物。<400〉7ttccatatgggaacctctaatcattcgct29<210>8〈211>29〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉根據釀酒酵母rDNA的基因序列設計的擴增2.2kb的rDNA片段的下游引物。〈400〉8tctcggccgaacgaacgagaccttaacct29權利要求1、一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法按以下步驟進行一、克隆質粒pKT0150中KanR基因；二、克隆釀酒酵母XKS1基因；三、克隆質粒pKT0150中ADH1終止子片段；四、克隆釀酒酵母中2.2kbrDNA片段；五、回收、純化步驟一至四制備的基因片段，然后再分別與pGEMTEasy載體在16℃的條件下連接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、構建質粒pR，以釀酒酵母整合載體p406ADH1為骨架引入有抗性標記的基因KanR；七、構建質粒pRK，將XKS1基因加入質粒pR；八、構建質粒pRKT，將ADH1終止子片段加入質粒pRK；九、將2.2kbrDNA片段加入質粒pRKT，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列為5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步驟二中擴增上游引物序列為5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列為5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步驟三中擴增上游引物序列為5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列為5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步驟四中擴增上游引物序列為5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列為5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。2、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟六中的抗性標記為G418。3、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟一中PCR反應體系為10nL，由l|iL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/(iL的上游引物、1^iL濃度為lpmol4iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL質粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94。C2min，變性94°Clmin,退火45。Clmin,延伸72°C2min,共30個循環，延伸72。C7min。4、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟二中PCR反應體系為lOpL，由l!xL10xPCRbuffer、0.8^iL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l|iL濃度為lpmol/pL的上游引物、l|xL濃度為lpmol/pL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL釀酒酵母基因組DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C5min，變性94°Clmin，退火55°Clmin，延伸72°C2min,共30個循環，延伸72"C10min。5、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟三中pcr反應體系為IOmL，由lpL10xPCRbuffer、0.8^l濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、lpL濃度為lpmol/jxL的下游引物、0.8jiL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL質粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94°C2min,變性94°Clmin，退火50°Clmin,延伸72°C2min，共30個循環，延伸72。C7min。6、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟四中PCR反應體系為10pL，由lnL10xPCRbuffer、0.8^L濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、l^iL濃度為lpmol/jiL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL釀酒酵母基因組DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成；PCR反應條件預變性94。C2min，變性94。Clmin,退火53。Clmin,延伸72°C2.5min,共30個循環，延伸72"C7min。7、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟六中用限制性內切酶Ndel和AatII對p406ADHl和pGMT-KanR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pR。8、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟七中用限制性內切酶SpeI和SalI對質粒pR和pGMT-XKSl分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRK。9、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟八中用限制性內切酶SalI和Eagl對質粒pRK和pGMT-ADHlT分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRKT。10、根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟九中用限制性內切酶NdeI、Eagl對質粒pRKT和pGMT-rDNA分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒。全文摘要一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，它涉及一種質粒載體的構建方法。它解決了目前經代謝工程改造后的釀酒酵母木糖利用率仍然很低，且發酵副產物木糖醇產生量高的問題。構建方法先克隆KanR基因、XKS1基因、ADH1終止子片段、釀酒酵母中2.2kbrDNA片段；然后回收、純化基因片段與pGEMTEasy載體連接；再依次構建質粒pR、質粒pRK和質粒pRKT；最后將2.2kbrDNA片段加入質粒pRKT。本發明方法所構建的載體可以將XKS1基因高拷貝整合到釀酒酵母的染色體基因組上，實現XKS1的超量穩定表達，疏通了釀酒酵母利用木糖產乙醇的木糖代謝流，提高了木糖的利用率，降低了副產物木糖醇的產量。文檔編號C12N15/66GK101302535SQ20081006483公開日2008年11月12日申請日期2008年6月30日優先權日2008年6月30日發明者凌宏志,剛宋,平文祥,曹喜生,杜春梅,葛菁萍,丹趙,高冬妮申請人:黑龍江大學