專利名稱：強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種白腐真菌的發酵方法。
技術背景隨著工農業生產的發展，越來越多的難降解有機物以各種形式被排放到環 境中，對人類的生存環境造成了極大危害，嚴重地威脅著地球生態系統的安全。 目前，處理染料廢水的方法主要分為物理化學方法和生物法。常用的物理化學 技術主要有吸附脫色技術、混凝沉淀技術、化學氧化技術、離子交換技術、超 濾膜脫色技術、光催化技術、熱氧化技術、高壓脈沖電解技術等。物理化學方法對廢水色度的去除率比較高，簡便易行，但COD的去除率比較低，處理費 用高，產生大量廢渣、污泥等副產品會對環境造成二次污染。相比之下，生物 法則是一種既經濟又徹底的方法，而且不會造成二次污染。白腐真菌所分泌的錳過氧化物酶對有機物有很好的降解能力，且被本領域 技術人員所公認。但是，目前白腐真菌分泌(或發酵)錳過氧化物酶的周期長(為6天)，.且錳過氧化物酶產量低(接種量為107/100mL條件下培養6天、 錳過氧化物酶產量低于228 U/L)。
發明內容
'本發明的目的是為了解決目前白腐真菌分泌(或發酵)錳過氧化物酶的周 期長、且錳過氧化物酶產量低的問題，而提供的一種強化白腐真菌分泌錳過氧 化物酶的方法。強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶按以下步驟進行 一、將PDA固體培養 基中生長旺盛的白腐真菌接種于無菌水中，充分振蕩后過濾，再將濾液中的白 腐真菌孢子接種到有泡沫載體的液體強化培養基；二、液體強化培養基用滅菌 封口膜密封，然后置于37士rC、轉速為160r/min的環境中培養3天，即實現 強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶；其中步驟一強化培養基中白腐真菌孢子的接 種量為107/100mL;步驟一中1L液體強化培養基由10g葡萄糖、2g酒石酸銨、 2.0gKH2PO4、0.535gMgSO4、0.1gCaCl2、20mmol乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、0.035g MnS04、 0.07gNaCl、 0.007g CoCl2、 0.007g FeS04.7H20、 0.007g ZnS04'7H20、0.007gCuSO4、 0.7mgAlK(SO4)2.12H2O、 0.7mgNa2Mo04.2H20、 0.7mgH3BO3、 0.105g次氮基三乙酸酯、0.105 mmol藜蘆醇和余量的水組成；步驟一 lOOmL 液體強化培養基中加入有1 1.4g泡沫載體。本發明強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法在白腐真菌培養第3天時 發酵液中出現酶活高峰，比現有白腐真菌發酵錳過氧化物酶的方法提前了 3 天，發酵周期縮短了一半。本發明方法錳過氧化物酶的產量高于900U/L，約 是現有方法產酶量的4倍。
圖1是培養-脫色3天的泡沫載體外表面的25倍掃描電鏡照片，圖2是培 養-脫色3天的泡沫載體外表面的1000倍掃描電鏡照片，圖3是培養-脫色3 天的泡沬載體內部剖面的IOOO倍掃描電鏡照片，具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶按以下步驟 進行 一、將PDA固體培養基中生長旺盛的白腐真菌接種于無菌水中，充分 振蕩后過濾，再將濾液中的白腐真菌孢子接種到有泡沫載體的液體強化培養 基；二、液體強化培養基用滅菌封口膜密封，然后置于37士rC、轉速為160r/min 的環境中培養3天，即實現強化白腐真菌分泌i孟過氧化物酶；其中步驟一強化 培養基中白腐真菌孢子的接種量為107/100mL;步驟一中1L液體強化培養基 由10g葡萄糖、2g酒石酸銨、2.0g KH2P04、 0.535g MgS04、 O.lg CaCl2、 20mmol 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、0.035g MnS04、 0.07g NaCl、 0.007g CoCl2、 0.007g FeS04.7H20、 0.007g ZnS04.7H20、 0.007g CuS04、 0.7mg A1K(S04)2.12H20、 0.7mg Na2MoO4,2H2O、0.7mg H3BO3、0.105g次氮基三乙酸酉旨(Nitrilotriacetate)、 0.105 mmol藜蘆醇和余量的水組成；步驟一 lOOmL液體強化培養基中加入有 1 1.4g泡沫載體。本實施方式中將白腐真菌固定于泡沫載體上(不同于現有技術中白腐真菌 在發酵液中懸浮培養)，泡沫載體上密布的孔隙為白腐真菌菌絲體的生長提供 足夠大的伸展空間，有利于白腐真菌的生長和繁殖；而且白腐真菌菌絲體能牢 固地與泡沫載體獨特的蜂窩狀物理結構纏繞，形成穩定而牢固的微環境，所以 即使在振蕩培養條件下發酵液中的菌絲體量也極少，便于后期錳過氧化物酶的 分離和純化。本實施方式方法發酵過程中泡沫載體處于半浸沒狀態，大部分菌絲體暴露于空氣中，增大了白腐真菌與空氣的接觸面積，提高了氧及營養物質 的傳質效率，更有利于白腐真菌利用液體強化培養基中的營養元素，使白腐真 菌的次生代謝提前，加快發酵周期。液體強化培養基中的泡沫載體內部由于固、液、氣之間的表面張力使得泡 沫載體孔隙內并不完全被液體培養基充滿，而是固、液、氣三相同時存在并處于動態平衡，有利于白腐真菌的生長；由于泡沫載體孔徑的相對均一，白腐真 菌可均勻分布于泡沫載體，提高了液體強化培養基的利用率。本實施方式方法發酵培養3天，在泡沫載體表面形成厚厚的一層白色粉末 狀菌體，說明白腐真菌生長旺盛。.圖1是培養-脫色3天的泡沫載體外表面的 掃描電鏡照片(X25倍)，圖2是培養-脫色3天的泡沬載體外表面的掃描電鏡 照片(X 1000倍)，圖3是培養-脫色3天的泡沫載體內部剖面的掃描電鏡照片 (X1000倍)，從圖1 3上可以看出泡沫載體的孔隙內布滿了白腐真菌菌絲 體(猶如蜘蛛網一般)。對比試驗結果證明暴露在空氣中的白腐真菌比浸沒于培養液中的白腐真 菌生長更為旺盛、錳過氧化物酶的產量也更高。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中的 白腐真菌為黃孢原毛平革菌。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式中選用的黃孢原毛平革菌(/Vw"erac/2wfe c/7oww/ oWMm,簡稱 A C7zo^w;x^"m)是一種常用生物研究材料。"根癌農桿菌介導的白腐絲狀真 菌——黃孢原毛平革菌的轉化"(《微生物學報》2005年45巻5期784-787頁) 及"黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)對3種酚酸物質的降解作 用"(《安全與環境學報》2006年6巻5期8-10頁)中都選用了黃孢原毛平革 菌作為生物材料。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中用 雙層紗布進行過濾。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一濾液 中白腐真菌孢子在37士rC條件下培養至650nm紫外光吸光度值為0.5，再接種 到液體強化培養基。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式650nm紫外光吸光度值為0.5時濾液中白腐真菌孢子數為 2.5xl06/mL。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中的 泡沬載體為三棱柱狀。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一或五的不同點是步驟一 中的泡沫載體為聚氨酯泡沫。其它步驟及參數與實施方式一或五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六的不同點是步驟一中的聚氨酯泡沬的孔徑為0.31mm，密度為0.039g/cm3，聚氨酯泡沫的體積為l.Ocm3。 其它步驟及參數與實施方式六相同。本實施方式中聚氨酯泡沫橫截面是底邊長為lcm，高為lcm的等腰三角形。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一 100mL液體強化培養基中加入有1.2g泡沫載體。其它步驟及參數與實施方式 一相同。
具體實施方式
九本實施方式強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶按以下步驟 進行 一、將PDA固體培養基中生長旺盛的白腐真菌接種于無菌水中，充分振蕩后過濾，再將濾液中的白腐真菌孢子接種到有三棱柱狀聚氨酯泡沫載體的液體強化培養基；二、液體強化培養基用滅菌封口膜密封，然后置于37°C、 轉速為160r/min的環境中培養3天，即實現強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶； 其中步驟一強化培養基中白腐真菌孢子的接種量為107/100mL;步驟一中1L 液體強化培養基由10g葡萄糖、2g酒石酸銨、'2.0gKH2PO4、 0.535gMgSO4、 0.1gCaCl2、 20mmol乙酸-乙酸鈉纟j沖溶液、0.035gMnSO4、 0.07gNaCl、 0.007g CoCl2、 0.007g FeS04'7H20、 0.007g ZnS04'7H20 、 0.007g CuS04 、 0.7mg A1K(S04)2'12H20、 0.7mgNa2MoO4.2H2O、 0.7mgH3BO3、 0.105g次氮基三乙酸 酉旨(Nitrilotriacetate)、 0.105 mmol藜蘆醇和余量的水組成；步驟一 lOOmL液體強化培養基中加入有1.2g聚氨酯泡沫載體；步驟一濾液中白腐真菌孢子在37'C條件下培養至650nm紫外光吸光度值為0.5，再接種到液體強化培養基。 本實施方式方法分泌(發酵培養)3天，然后將液體強化培養基取出(擠 壓泡沫載體，得到泡沬載體中的液體強化培養基)進行檢測，液體強化培養基 中錳過氧化物酶的產酶量為915.62 U/L，是現有方法發酵培養6天產酶量的4 倍以上。
權利要求
1、強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特征在于強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶按以下步驟進行一、將PDA固體培養基中生長旺盛的白腐真菌接種于無菌水中，充分振蕩后過濾，再將濾液中的白腐真菌孢子接種到有泡沫載體的液體強化培養基；二、液體強化培養基用滅菌封口膜密封，然后置于37±1℃、轉速為160r/min的環境中培養3天，即實現強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶；其中步驟一強化培養基中白腐真菌孢子的接種量為107/100mL；步驟一中1L液體強化培養基由10g葡萄糖、2g酒石酸銨、2.0g KH2PO4、0.535gMgSO4、0.1g CaCl2、20mmol乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、0.035g MnSO4、0.07g NaCl、0.007g CoCl2、0.007g FeSO4·7H2O、0.007g ZnSO4·7H2O、0.007g CuSO4、0.7mgAlK(SO4)2·12H2O、0.7mg Na2MoO4·2H2O、0.7mg H3BO3、0.105g次氮基三乙酸酯、0.105mmol藜蘆醇和余量的水組成；步驟一100mL液體強化培養基中加入有1～1.4g泡沫載體。
2、 根據權利要求1所述的強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特 征在于步驟一中的白腐真菌為黃孢原毛平革菌。
3、 根據權利要求1所述的強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特 征在于步驟一中用雙層紗布進行過濾。
4、 根據權利要求1所述的強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特 征在于步驟一濾液中白腐真菌孢子在37士rC條件下培養至650nm紫外光吸光 度值為0.5，再接種到液體強化培養基。
5、 根據權利要求1所述的強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特 征在于步驟一中的泡沬載體為三棱柱狀。
6、 根據權利要求1或5所述的強化白腐寘菌分泌錳過氧化物酶的方法， 其特征在于步驟一中的泡沫載體為聚氨酯泡沬。
7、 根據權利要求6所述的強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特 征在于步驟一中的聚氨酯泡沫的孔徑為0.31mm，密度為0.039g/cm3，聚氨酯 泡沫的體積為1.0 cm3。
8、 根據權利要求1所述的強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，其特 征在于步驟一 lOOmL液體強化培養基中加入有1.2g泡沫載體。
全文摘要
強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法，它涉及一種白腐真菌的發酵方法。它解決了目前白腐真菌分泌(或發酵)錳過氧化物酶的周期長、且錳過氧化物酶產量低的問題。方法1.將PDA固體培養基中生長旺盛的白腐真菌接種于無菌水中，充分振蕩后過濾，再將濾液中的白腐真菌孢子接種到有泡沫載體的液體強化培養基；2.液體強化培養基用滅菌封口膜密封，然后置于37±1℃、轉速為160r/min的環境中培養3天，即實現強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶。本發明強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶的方法在白腐真菌培養第3天時發酵液中出現酶活高峰，比現有白腐真菌發酵錳過氧化物酶的方法提前了3天，發酵周期縮短了一半。本發明方法錳過氧化物酶的產量高于900U/L，約是現有方法產酶量的4倍。
文檔編號C12N1/14GK101260388SQ20081006433
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月18日 優先權日2008年4月18日
發明者曾永剛, 紅 梁, 高大文 申請人:東北林業大學