專利名稱：：同時檢測多種混合感染病毒的方法
技術領域：
：本發明涉及多種微生物的檢測方法，尤其涉及一種用于寡核苷酸芯片檢測的新型多種混合感染豬病毒核酸擴增方法。技術背景隨著養豬業的發展，豬傳染病的發生和流行成為制約養豬生產的重要因素。目前我國豬傳染病流行的主要特征是多病原混合感染，繁殖障礙性傳染病和呼吸傳染病普遍存在。而病毒性感染在豬繁殖障礙病和豬呼吸道疾病的發生和流行中扮演著重要角色，因此建立相關病毒的有效檢測手段，對制定切實可行的疫病防治措施有重要的意義。目前，病毒核酸的檢測用于豬病毒病診斷具有快速、敏感的特點，在病毒的檢測中越來越受到重視。但這些方法一次試驗只能檢測樣品中一種病毒，盡管人們采用多重RT-PCR/PCR的方法可以對幾種病原生物進行檢測，但是由于PCR方法本身的局限性，目前報道的多重PCR最多只能針對10個靶標，不可能實現對病原生物高通量的檢測，在遇到混合感染和樣品數量較多時，顯得力不從心，不能在短時間內提供檢測結果。因此有必要建立一種同步檢測和鑒別診斷功能的快速、靈敏、高效的診斷方法。基因芯片(genechip)技術在1991年的《科學》(Science)雜志上被首次提出，是20世紀90年代興起的一項前沿生物技術，具有高通量、微型化和自動化的特點，成為后基因組時代基因功能分析的最重要技術之一。基因芯片，又稱DNA芯片，DNA微陣列(DNAmicroarray)或寡核苷酸陣列(Oligonucleotidearray),檢測技術的原理是基于核酸堿基配對的原則，同時基因微陣列檢測技術又結合了類似電子微陣列的集成原理，通常在lcm2的固相支持物上結合成千上萬條探針，然后與標記的樣品靶標分子雜交，通過對雜交信號的檢測分析，明確目標分子的存在與否和濃度，因此基因微陣列技術可同時針對多靶標多點檢測，具有其它技術所無法比擬的優勢。基因芯片技術現在己經廣泛應用于基因組功能研究、基因表達、基因序列分析、藥物篩選、臨床診斷、農業食品衛生和環境監測等領域(Schenaetal.，1995，1998)。作為一種高通量的檢測新技術，可以同時檢測數以萬計的生物分子，在病原生物的監控和診斷尤其是病毒檢測方面顯示了越來越多的應用；如應用于人類病毒乙肝病毒(HBV)(Kawaguchietal.，2003)、人類免疫缺陷病毒(HIV)(Andersonetal.，2000)、流感病毒(Lietal.，2001)嚴重急性呼吸系統綜合征病毒(SARS-cov)(周琦等，2003;Zhangetal.，2005)等醫學診斷，以及應用于動物病毒如口蹄疫、禽流感(楊素等，2004)的檢測和檢疫。目前的基因芯片檢測體系尚不能檢測出未擴增的微量樣品，所以待測樣品DNA或RNA在雜交前一般都要進行PC財廣增，在擴增過程中對靶標分子進行標記。利用基因芯片對同一科或屬內不同種或同一種病原微生物內亞型或亞類的檢測和鑒定相對較為容易，可以在科、屬或種同源性分析的基礎上，在保守區設計通用引物擴增待檢測耙標核酸片段，在其間變異區設計特異性探針以區分不同的屬種或亞型，這方面的研究較多(Anthonyetal.,2000;Parketal.，2001;Zhangetal.，2005;Chanaetal.，2006)。但不同禾斗屬的病原微生物由于不存在共同的保守基因序列，對其進行檢測和鑒定則較為困難。對幾種(少于10種)不同的病毒同時進行擴增，目前一般利用多重PCR方法(Lietal.，2001;Anetal.，2003;Kimetal.，2003;楊銀輝等，2006)，這樣也難以避免PCR的局限性。鑒于生物芯片的平行性特點，許多研究者嘗試進行多種病毒的同時檢測。Wang等(2002)根據多種呼吸道病毒的基因序列設計了長片段(70nt)寡核苷酸探針微陣列，利用隨機引物PCR方法擴增標記樣品中的病毒耙序列，有效地檢測和鑒定了多種病毒，包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、人鼻病毒、Kaposi肉瘤相關皰疹病毒，并能區分病毒的亞型。國內黃巖山等(2004)和孫梅生等(2005)也分別利用此方法對呼吸道病毒進行了檢測，證明此微陣列基因芯片檢測是可行的。隨機引物擴增標記法可同時對多種病原生物進行標記,而不需要針對每種病原生物設計特異性引物，避免了多重PCR的限制(Lietal.，2001;Gharizadehetal.，2003;Cherkasovaetal.，2003;Tallaetal.,2003;Senguptaetal.，2003)，這樣似乎真正解決了高通量檢測技術的瓶頸。但由于上述樣品擴增引物是隨機引物，在擴增時沒有特異性，就靈敏度而言，不如采用特異引物擴增的傳統芯片技術靈敏度高，也必然導致擴增效率低，因此檢測靈敏度也會相應下降，而且為彌補個別探針的交叉反應或假陽性，每種病毒一般需5—10種探針，實驗復雜性增加。Busti等(2002)設計了一種特異性的連接酶檢測反應(ligasedetectionreaction,LDR)探針(引物)，其中每一對探針由鑒別寡核酸和通用探針組成。前者的5'端用熒光染料Cy3，后者的3'端連接有cZipCode(complementaryZipCode);通用芯片(universalchip)上固定了與cZipCode互補的Zip探針，當檢測到特定的細菌16SrDNA時，LDR的兩探針在連接酶作用下連接成一條寡核苷酸探針，其5'標記有Cy3，3'端為cZipCode，則3'端再與通用芯片上相應的Zip探針雜交就能在待定位置檢測到Cy3的信號，該方法能有效地分辨各菌種間16SrDNA單個堿基的差別。不過該方法在LDR之前需對多靶序列進行多次PCR擴增，因此僅適用于科屬內病原物的鑒定。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種用于寡核苷酸芯片檢測多種混合感染病毒的新型核酸擴增方法，使用該方法能對任何的不同科、屬和種的病原物進行檢測和鑒定。為了解決上述技術問題，本發明提供一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，包括以下步驟1)、獲取待檢測病毒的核酸序列，利用相應軟件對每種病毒的各個株系的核酸序列進行序列比對，從而獲得每種病毒的保守區；再分別在每種病毒的保守區內設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針，即上游鑒別探針和下游鑒別探針，上游鑒別探針和下游鑒別探針是一對首尾相連并與各自的靶序列互補的寡聚核苷酸；2)、設計通用引物以及完全互補的ZipCode和cZipCode,通用引物由上游通用弓1物和下游通用引物組成ZipCode和通用引物均是根據大小和空間結構設計的彼此相互之間以及與靶序列均無同源性且不形成穩定空間結構(如發夾結構和二聚體)的20個核苷酸左右的寡聚核苷酸；cZipCode5'連接下游鑒別探針，上游通用引物連接上游鑒別探針的5'端，組稱上游探針；下游通用引物連接cZipCode的3'端，組稱下游探針；ZipCode和cZipCode用于檢測通用引物擴增的連接產物；3)、將上游探針和下游探針與待檢樣品耙標核酸一起進行連接酶檢測反應，得連接產物；4)、用互補上游通用引物和下游通用引物擴增并標記連接產物，純化后與通用基因芯片在5(TC雜交2小時；5)、雜交后用芯片掃描儀掃描，經軟件分析獲得雜交信號強度，從而得知混合感染病毒情況。作為本發明的同時檢測多種混合感染病毒的方法的改進上游通用引物為5，>CTCGACCGTTAGCAGCATGA<3，，下游通用引物為5，>CCGAGATGTACCGCTATCGT<3，；互補上游通用引物為與上游通用引物互補的序列。作為本發明的同時檢測多種混合感染病毒的方法的進一步改進ZipCode為以下任意一種-1)、5，>TCGCCGTTGGTCTGTATGCA<3，；2)、5，>CGTTCCTAAAGCTGAGTCTG<3';3)、5，>ATGCAGCGTAGGTATCGACT<3，；4)、5，>TCCCGAATGACAAGGCACGA<3';5)、5，>ATTAACTCGACTGCCGCGTG<3';6)、5，>CTTCGTGGCTAGTCTGTGAC<3';7)、5，>GTCACGTATGGTTCGCTGCT<3';8)、5，>TGTGATAATTTCGACGAGGC<3';9)、5，>AATGCTCACATCGCAGGTAC<3，；10)、5，>GCACTAACTGGTCTGGGTCA<3，；11)、5，>ACTCCAGTGCCAAGTACGAT<3，；12)、5，>CTGAATCCTCCAACCGGGTT<3，；13)、5，>TTTCGGCACGCGCGGGATCA<3，陰性對照；為與上述cZipCode1)12)無同源性的一段序列；cZipCode為與ZipCode互補的對應序列。作為本發明的同時檢測多種混合感染病毒的方法的進一步改進采用醛基修飾的載玻片做為固相載體，分別向其上固定每種病毒所對應的ZipCode,作為通用基因芯片。本發明的同時檢測多種混合感染病毒的方法，具有如下優點本發明設計的用于寡核苷酸芯片檢測的新型多種混合感染豬病毒核酸擴增方法，一次擴增可以對多種不同科、屬、種和亞種的病毒進行檢測，而不需通過多重PCR擴增樣品；新型LDR寡核苷酸芯片是一種通用芯片，使用了通用ZipCode探針，不會產生非特異性雜交，極大地簡化了雜交條件優化過程，是真正意義上的快速、準確、高通量檢測芯片，可以很好地用于多種豬病毒或病原微生物的高通量檢測。下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖l是本發明的同時檢測多種混合感染病毒的方法的原理示意圖。具體實施方式本發明的同時檢測多種混合感染病毒的方法，具體實施方案包括以下步驟1)、分別對病豬的樣品進行檢測，確定樣品感染病毒的種類。公知常見有12種豬病毒病，分別為豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒(SIV)、豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬水皰性口炎病毒(VSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV);從NCBI網站下載待檢測病毒的核酸序列，并且用ClusterW軟件對每一種病毒的各個株系的核酸序列進行序列比對，尋找保守區，利用Primer5.0和DNAstar軟件在保守區內設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針(一對首尾相連并與各自的靶序列互補的25bp左右的寡聚核苷酸)；2)、設計ZipCode、cZipCode(和ZipCode完全互補)和通用引物ZipCode和通用引物是彼此以及與靶序列沒有同源性的寡聚核苷酸。cZipCode5'連接下游鑒別探針，上游通用引物連接上游鑒別探針的5'端，組稱上游探針；下游通用引物連接cZipCode的3'端，組稱下游探針，ZipCode和cZipCode用于檢測互補通用引物擴增的連接產物，檢測原理和過程如圖1所示；3)、將上游探針和下游探針與待檢病毒核酸一起進行連接酶檢測反應(ligasedetectionreaction,LDR);只有當檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處堿基完全匹配，連接反應才能進行，下游的鑒別探針和cZipCode才能進而被互補上游通用引物和下游通用引物標記擴增，然后與通用基因芯片上相應3'連接(dAUNH2的ZipCode探針雜交；反之則不能形成連接產物，下游的鑒別探針和cZipCode不能被擴增；4)、用互補上游通用引物和下游通用引物擴增并標記連接產物，標記擴增樣品采取在PCR過程中摻入熒光素Cy5-dCTP方法(參見，獸醫微生物學1998年，中國農業科學學院哈爾濱獸醫研究所編著中國農業科學出版社出版690頁)。純化后與通用基因芯片在5(TC雜交2小時，隨后分別在0.2XSSC和0.1XSSC中沖洗5分鐘，吹干；5)、雜交后用芯片掃描儀掃描，雜交結果的檢測采用本領域公知的方法。采用激光聚焦掃描儀(GenPixPersonal4100A，AxonInstruments)掃讀，得到Cy5圖像文件，通過圈點確定雜交范圍，過濾背景噪聲，提取雜交的熒光信號強度值，用以下兩個條件作為雜交陽性的標準。Cy5陽性點的熒光信號平均值大于陰性點2倍以上；陰性熒光信號值小于800。經軟件分析獲得雜交信號強度，從而得知病豬樣品混合感染病毒情況。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例1、一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，分別對IOO例病豬的樣品進行檢測，確定樣品感染的病毒種類，公知常見有12種豬病毒病，分別為豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒(SIV)、豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬水皰性口炎病毒(VSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV);本發明方法具體依次進行如下步驟1)、從NCBI網站下載上述病毒的核酸序列，并用ClusterW軟件對每一種病毒的各個株系的核酸序列進行序列比對，尋找保守區；再利用Primer5.0和DNAstar軟件分別在每種病毒的保守區內設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針，具體如表l所示。表l、12種病毒寡核苷酸鑒別探針病毒上游鑒別探針(5，-3')下游鑒別探針(5'-3')TGEVGTGTGGTTCTGAAAGTAGCGGCGTTGGAGATTGGACTGGSVDVAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATVSVAGGGTACTGTGGGATGACTGGGCTCCATATGAAGACGTGPEDVAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTJEVATGCAGGCTGAAAATGGACAAACTGGCTCTGAAGGGCACFMDVCGGAACATGCTTATGAGAACAAACGCATTGTTGTTGAGGPRVGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGSIVCTAATCAGGCACGAGAACAGAATGGTAATAGCCAGCACAACAPRRSVCAATGTCCCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTCGGTGGTCPCV2TGATTATTTTATTGTTGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGCSFVACAGACACGGAACTGAAAGAAATACAGGGAATGATGGATGCPPVAACCTACCACAGAAGGAGACCAACACCCAGGAACACTACCA2)、設計通用引物以及完全互補的ZipCode和cZipCode:通用引物由上游通用引物5，>CTCGACCGTTAGCAGCATGA<3，和下游通用引物5，〉CCGAGATGTACCGCTATCGT<3，組成。所設計的ZipCode具體為1)、5，>TCGCCGTTGGTCTGTATGCA<3，；2)、5，>CGTTCCTAAAGCTGAGTCTG<3';3)、5，>ATGCAGCGTAGGTATCGACT<3';4)、5，>TCCCGAATGACAAGGCACGA<3';5)、5，>ATTAACTCGACTGCCGCGTG<3，；6)、5，>CTTCGTGGCTAGTCTGTGAC<3';7)、5，>GTCACGTATGGTTCGCTGCT<3，；8)、5，〉TGTGATAATTTCGACGAGGC〈3,;9)、5，>AATGCTCACATCGCAGGTAC<3，；10)、5，>GCACTAACTGGTCTGGGTCA<3';11)、5，>ACTCCAGTGCCAAGTACGAT<3';12)、5，>CTGAATCCTCCAACCGGGTT<3'13)、5，>TTTCGGCACGCGCGGGATCA<3，Negativecontrol,為與上述cZipCode無同源性的一段序列；cZipCode具體為1)、5，>TGCATACAGACCAACGGCGA<3，；2)、5，>CAGACTCAGCTTTAGGAACG<3,;3)、5，>AGTCGATACCTACGCTGCAT<3,;4)、5，>TCGTGCCTTGTCATTCGGGA<3';5)、5，>CACGCGGCAGTCGAGTTAAT<3，;6)、5，>GTCACAGACTAGCCACGAAG<3，;7)、5,>AGCAGCGAACCATACGTGAC<3，；8)、5，>GCCTCGTCGAAATTATCACA<3，；9)、5，>GTACCTGCGATGTGAGCATT<3，；10)、5，>TGACCCAGACCAGTTAGTGC<3';11)、5，>ATCGTACTTGGCACTGGAGT<3';12)、5，>AACCCGGTTGGAGGATTCAG<3，；cZipCode5'連接下游鑒別探針，上游通用引物連接上游鑒別探針的5'端，組稱上游探針；下游通用引物連接cZipCode的3'端，組稱下游探針。3)、將上述步驟2)所得的12種上游探針和下游探針分別與上述100例樣品DNA或RNA—起進行連接酶檢測反應(LDR)，95°C30秒，64°C4分鐘，進行40個循環；得連接產物。4)、先制備通用基因芯片，具體內容如下采用醛基修飾的載玻片做為固相載體，分別向其上固定本發明所選12種病毒對應的3'連接(d化。NH2的ZipCode，作為通用基因芯片。然后用具體為互補上游通用引物5，>TCATGCTGCTAACGGTCGAG<3，和下游通用引物5，>CCGAGATGTACCGCTATCGT<3'PCR擴增標記連接產物，PCR擴增條件如下95°C30秒，55°C30秒，72°C30秒，進行30個循環。純化后經真空濃縮溶于10u1雜交液中，與通用基因芯片5CTC雜交2小時，隨后分別在0.2XSSC和0.1XSSC中沖洗5分鐘；吹干后用芯片掃描儀掃描。經軟件分析，結果如下在100個樣品中，檢測出病毒PCV2的有26例，PRRSV有11例，PRV有15例，PEDV有3例，CSFV有7例，PPV有8例，TGEV有2例，其中PCV2和PRRSV混合感染的6例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有4例。實施例2、一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，分別對80例病豬的樣品進行檢測，確定樣品感染的病毒種類。公知常見有12種豬病毒，分別為豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒(SIV)、豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬水皰性口炎病毒(VSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV);本發明方法具體依次進行如下步驟1)、同實施例l。2)、同實施例l。3)、將上述步驟2)所得的12種上游探針和下游探針分別與上述80例樣品DNA或RNA—起進行連接酶檢測反應(LDR)，95°C30秒，64°C4分鐘，進行40個循環；得連接產物。4)、同實施例l。經軟件分析，結果如下在80個樣品中，檢測出病毒PCV2的有27例，PRRSV有14例，CSFV有11例，PRV有9例，PPV有6例，PEDV有5例，SIV有2例，TGEV有1例，其中PCV2和PRRSV混合感染的7例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有2例。為了充分證明本發明方法的優越性，發明人作了如下的對比實驗1、對照例1:采用傳統PCR為基礎的基因芯片方法，分別對100例與實施例1相同的病豬樣品進行檢測，確定樣品感染的病毒種類。公知常見有12種豬病毒，分別為豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒(SIV)、豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬水皰性口炎病毒(VSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)的PCR擴增(參見，葉春艷等人，2004年中國獸醫科技第30巻第7—10頁)，豬圓環病毒2(PCV2)的PCR擴增(參見，Huang等人，2004年，VeterinaryMicrobiology,第101巻209—214頁)，豬瘟病毒(CSFV)的PCR擴增(參見，Li等，2007年JournalofVirologicalMethordst第143巻16—22頁)，豬細小病毒(PPV)的PCR擴增(自行設計參見，李小康等人，2007年，中國預防獸醫學報，第29巻227—230頁)、豬偽狂犬病毒(PRV)的PCR擴增(參見，李小康等人，2007年，中國預防獸醫學報，第29巻227—230頁)，豬流感病毒(SIV)的PCR擴增(參見，楊煥良等人，2007年，動物醫學進展第28巻42—45頁)，豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)的PCR擴增(參見，崔奕杰等人，2006年，動物醫學進展，第27巻第59—62頁)，豬口蹄疫病毒(FMDV)的PCR擴增(參見，祁會彩等人，傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的PCR擴增(陳芳等人，2005年，中國2006年中國動物檢疫第23巻24—27)，豬水泡病病毒(SVDV)的PCR擴增(參見，鐘金棟等人，2006年中國農學通報第22巻25—27)，豬水皰性口炎病毒(VSV)的PCR擴增(參見，祁會彩等人，2006年中國動物檢疫第23巻24_27)，豬獸醫學報第25巻第9一12頁)，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的PCR擴增(陳芳等人，2005年，中國獸醫學報第25巻第9_12頁)。12種病毒的常規PCR方法檢測用引物具體如表2所示。從NCBI網站下載上述12種病毒的核酸序列，在上述每一種病毒PCR擴增引物區間設計3條不同探針(表3，探針1-3)，共計36條探針，3'連接(dA)1QNH2，點制于醛基化修飾的載玻片基質上，然后與10iilPCR擴增標記Cy5的樣品5(TC雜交2小時，隨后分別在0.2XSSC和0.1XSSC中沖洗5分鐘，吹干；雜交后用芯片掃描儀掃描，經軟件分析，結果如下在100個樣品中，檢測出病毒PCV2的有26例，PRRSV有11例，PRV有15例，PEDV有3例，CSFV有7例，PPV有8例，TGEV有2例，其中PCV2和PRRSV混合感染的6例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有4例。與實施例l比較，對照例1采用傳統的PCR為基礎的基因芯片方法，上述實施例l的檢測結果，與現有技術之PCR方法檢測結果符合率1009&，但PCR—次只檢測一種病毒，檢測100個樣品、12種病毒需1200次PCR，操作費時長，試劑消耗多，因而對照例l的方法操作費時長(20小時)，試劑消耗多(37100Y)，，而本發明一次能同時檢出多種病毒，操作總費時短(6小時)，試劑消耗少(3200Y)，具有明顯的優越性。表2、12種病毒的常規PCR方法檢測用弓I物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2、對照例2:采用隨機擴增為基礎的基因芯片方法，分別對100例與實施例1相同的病豬樣品進行檢測，確定樣品含有的病毒種類。公知常見有12種豬病毒，分別為豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒(SIV)、豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬水皰性口炎病毒(VSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。從NCBI網站下載上述12種病毒的核酸序列，并且用ClusterW軟件對每一種病毒的各個株系的核酸序列進行序列比對，尋找保守區，利用Primer5.0和DNAstar軟件在保守區內設計5條寡核苷酸鑒別探針(表3)，共計60條探針，3，連接(dA)10NH2，點制醛基化修飾的載玻片基質上；病毒核酸采用RoundABC隨機引物擴增、標記(參照，Wang等，2002，ProcNatlAcadSci第99巻:15687-15692)。A步驟隨機引物序列為5'—GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN-3'，B步驟引物為5'-GTTTCCCAGTAGGTCTC-3'，C步驟用熒光染料Cy3或Cy5直接摻入標記，具體步驟詳見參考文獻(Wang等，2002，ProcNatlAcadSci第99巻15687-15692)。標記產物純化后經真空濃縮溶于IOlil雜交液中，把雜交混合物小心滴加到制備好的微陣列矩陣上，覆蓋雜交用蓋玻片，置于雜交艙中，42。C水浴避光雜交68h。隨后分別在0.2XSSC和0.1XSSC中沖洗5分鐘，吹干；雜交后用芯片掃描儀掃描，經軟件分析，結果如下在100個樣品中，檢測出病毒PCV2的有22例，PRRSV有9例，PRV有13例，PEDV有2例，CSFV有6例，PPV有6例，TGEV有2例，其中PCV2和PRRSV混合感染的6例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有3例。與實施例l比較，對照例2采用隨機擴增為基礎的基因芯片方法。雖然隨機引物擴增標記法可同時對多種病原生物進行標記，不需要針對每種病原生物設計特異性引物，避免了多重PCR或多次PCR的不足，但由于上述樣品擴增引物是隨機引物，在擴增時沒有特異性，導致擴增效率低，靈敏度不如采用特異引物擴增的傳統芯片技術高,而且為彌補個別探針的交叉反應或假陽性每種病毒一般需5—10種探針，實驗復雜性增加。上述對照例2的檢測結果，病毒檢出率低于新型多種混合感染豬病毒核酸擴增方法13.6%。對照例2采用為基礎的基因芯片方法，與對照例2比較，實施例l的方法靈敏度既高(16%),實驗又簡單。表3、12種豬病毒檢測基因芯片使用的探針<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image>aatgctcacatcgcaggtacSEQIDNo:12gcactaactggtctgggtcaSEQIDNo:13actccagtgccaagtacgatSEQIDNo:14ctgaatcctccaaccgggttSEQIDNo:15tttcggcacgcgcgggatca權利要求1、一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，其特征在于包括以下步驟1)、獲取待檢測病毒的核酸序列，利用相應軟件對每種病毒的各個株系的核酸序列進行序列比對，從而獲得每種病毒的保守區；再分別在每種病毒的保守區內設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針，即上游鑒別探針和下游鑒別探針，所述上游鑒別探針和下游鑒別探針是一對首尾相連并與各自的靶序列互補的寡聚核苷酸；2)、設計通用引物以及完全互補的ZipCode和cZipCode，所述通用引物由上游通用引物和下游通用引物組成所述ZipCode和通用引物均是根據大小和空間結構設計的彼此相互之間以及與靶序列均無同源性且不形成穩定空間結構的寡聚核苷酸；cZipCode5′連接下游鑒別探針，上游通用引物連接上游鑒別探針的5′端，組稱上游探針；下游通用引物連接cZipCode的3′端，組稱下游探針；3)、將上游探針和下游探針與待檢樣品靶標核酸一起進行連接酶檢測反應，得連接產物；4)、用互補上游通用引物和下游通用引物擴增并標記連接產物，純化后與通用基因芯片在50℃雜交2小時；5)、雜交后用芯片掃描儀掃描，經軟件分析獲得雜交信號強度，從而得知混合感染病毒情況。2、根據權利要求l所述的一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，其特征在于所述上游通用引物為5，>CTCGACCGTTAGCAGCATGA<3'，所述下游通用引物為5，>CCGAGATGTACCGCTATCGT<3，；所述互補上游通用引物為與上游通用引物互補的序列。3、根據權利要求1或2所述的一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，其特征在于所述ZipCode為以下任意一種1)、5，>TCGCCGTTGGTCTGTATGCA<3';2)、5，>CGTTCCTAAAGCTGAGTCTG<3';3)、5，>ATGCAGCGTAGGTATCGACT<3，；4)、5，>TCCCGAATGACAAGGCACGA<3，；5)、5，>ATTAACTCGACTGCCGCGTG<3';6)、5，>CTTCGTGGCTAGTCTGTGAC<3，；7)、5，〉GTCACGTATGGTTCGCTGCT<3';8)、5，>TGTGATAATTTCGACGAGGC<3，；9)、5，>AATGCTCACATCGCAGGTAC<3，；10)、5，>GCACTAACTGGTCTGGGTCA<3';11)、5，>ACTCCAGTGCCAAGTACGAT<3，；12)、5，>CTGAATCCTCCAACCGGGTT<3，；13)、5，>TTTCGGCACGCGCGGGATCA<3，陰性對照，為與上述cZipCode1)12)無同源性的一段序列；所述cZipCode為與ZipCode互補的對應序列。4、根據權利要求3所述的一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，其特征在于采用醛基修飾的載玻片做為固相載體，分別向其上固定每種病毒所對應的ZipCode,作為通用基因芯片。全文摘要本發明公開了一種同時檢測多種混合感染病毒的方法，包括以下步驟1)獲取待檢測病毒的核酸序列，再分別在每種病毒的保守區內設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針；2)設計通用引物以及完全互補的ZipCode和cZipCode；3)將上游探針和下游探針與待檢樣品靶標核酸一起進行連接酶檢測反應，得連接產物；4)用互補上游通用引物和下游通用引物擴增并標記連接產物，純化后與通用基因芯片在50℃雜交2小時；5)雜交后用芯片掃描儀掃描，經軟件分析獲得雜交信號強度，從而得知混合感染病毒情況。使用本發明的方法能對任何的不同科、屬和種的病原物進行檢測和鑒定。文檔編號C12Q1/70GK101230404SQ20081005959公開日2008年7月30日申請日期2008年2月4日優先權日2008年2月4日發明者丁先鋒,商晗武,姜永厚,輝徐,竺錫武,趙靈燕,陳偉杰申請人:浙江理工大學;浙江省畜牧獸醫局