紅景天及紅景天苷在干細胞定向分化為肝系細胞中的應用的制作方法

            文檔序號:564498閱讀:233來源:國知局
            專利名稱:紅景天及紅景天苷在干細胞定向分化為肝系細胞中的應用的制作方法
            技術領域
            本發明涉及紅景天尤其是紅景天苷在誘導干細胞定向分化為肝系細 胞中的應用。(二) 背景技術紅景天系景天(CrowM/ace"e)科紅景天屬(i^oJ/o/fl丄.)才直物,為多 年生草本或亞灌木植物,主要分布在北半球的喜馬拉雅山區、亞洲西北部 和北美洲海拔在1,600 4,000米的地區。紅景天藥用歷史悠久,素有"黃 金人參""神仙草,,之稱。藥典記載紅景天為景天科植物大花紅景天的干燥 根及根莖,其性甘、苦、平,益氣活血、通脈平喘,可用于氣虛血瘀、胸 痹心痛、中風偏癱和倦怠氣喘。現代藥理研究表明,紅景天的生物活性與 其所含的多種化學成分密不可分。紅景天苷(sa/^Y^Vfe)是從紅景天中分離提純的天然產物,為一種 單體化合物,是紅景天的有效成分之一,部分相關科屬中藥也含紅景天苷, 其化學結構式為oh ( I )紅景天苷單體的分離純化方法紅景天粉為原料,以水為溶劑用微波 法提取紅景天苷。最佳工藝參數為液固比20: 1,浸泡時間1.5h,低功率農吏波處理60s,磁力攪拌15min,提取2次,提取率可達90%(參見 微波輔助提取紅景天苷,趙武奇殷涌光梁歧等,食品與發酵工業,2004, 30 (2), 19 22)。 藥理作用提高和改善抗各種高原反應能力。抗缺氧、抗疲勞作用。研究表明它通過維持5-HT含量正常化起到了 抗中樞疲勞的作用。抗衰老。具有抗氧化作用及體外清除羥自由基和超氧陰離子自由基的 能力。抑制大鼠腎小管上皮細胞及間質細胞向肌成纖維細胞轉化,有效緩解 腎間質損傷,防治腎間質纖維化。抗肝纖維化作用。紅景天苷可明顯抑制乙醛刺激的HSC增殖及膠原 基因的表達,在體外有顯著的抗肝纖維化作用。對心腦血管的保護作用。紅景天苷可抑制大鼠缺血再灌注引起的白細 胞介素1(3表達的增加,減少腦缺血再灌注后腦組織中TNF-a的表達起到保 護腦血管的作用;通過抑制血管ACE的表達,在一定程度上可抗心肌缺血。提高機體免疫能力、抗腫瘤、抗病毒。抗輻射。紅景天苷有防護X射線輻射損傷機體組織和細胞膜的作用。 提高記憶力和防治老年癡呆,保護神經細胞。紅景天苷可抑制缺氧缺 糖損傷所致的線粒體膜電位和活性的降低,從而具有穩定線粒體膜電位的 作用,抑制神經細胞凋亡的發生;體外促進神經千細胞向神經元方向分化 為紅景天藥物用于相關神經系統疾病的臨床治療提供了實驗依據。 降血糖和改善蛋白質、脂肪代謝。目前還未有紅景天及紅景天苷具有誘導成體干細胞定向分化為肝系細胞的作用纟艮道。
            發明內容本發明目的是提供紅景天及紅景天苷的新用途,即紅景天及紅景天苷 誘導干細胞定向分化為肝系細胞的應用。本發明的技術方案是紅景天在制備誘導干細胞定向分化為肝系細胞誘導劑中的應用,如利 用紅景天誘導干細胞定向分化為肝系細胞(如肝細胞,膽管細胞等)。本發明推薦以紅景天中的有效成份紅景天苷作為誘導成體干細胞定 向分化為肝系細胞的誘導劑。紅景天苷具有擬肝細胞生長因子 (Hepatocyte grow factor, HGF )樣作用。通常的,本發明所述的干細胞為成體干細胞,所述的成體干細胞包括 除造血干細胞外的骨髓間充質干細胞以及多種祖細胞,優選為骨髓間充質 干細月包。本發明所述應用為將紅景天苷與細胞生長因子FGF-4組合作為誘 導劑用于誘導骨髓間充質干細胞定向分化為肝系細胞。具體的,所述應用為取大鼠骨髓間充質干細胞進行傳代培養,取穩 定傳代的骨髓間充質干細胞于誘導培養基中,進行誘導培養,獲得成熟肝 細胞樣細胞;所述誘導培養基為添加有紅景天苷與細胞生長因子FGF-4 的基礎培養基,所述基礎培養基中紅景天苷與細胞生長因子FGF-4添加 量為紅景天苷終濃度為1 5^M(優選為2pM),細胞生長因子FGF-4 終濃度為5 20ng/mL (優選為10ng/mL)。優選的,所述的應用為取大鼠骨髓間充質干細胞,進行傳代培養,取第3代的骨髓間充質干細胞,接種于MSC培養基,37°C、 5%(302條件 下培養至細胞匯合率大于90%,將細胞培養基更換為添加有2(iM紅景天 苦與10 ng/mL細胞生長因子FGF-4的基礎培養基,誘導培養14天,得 到成熟肝細胞樣細胞。所述MSC培養基本領域常見適用于骨髓間充質干細胞培養的培養 基,本發明中選用含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、 100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的低糖DMEM培養基。所述基礎培養基為本領域常見適用于骨髓間充質干細胞誘導培養的 基礎培養基,本發明中釆用含2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM 2_[4_(2_輕乙基)-l-哌。秦]乙磺酸(Hepes )、 1 x胰島素—轉鐵蛋白-硒、200昭/L 地塞米松、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養基。一種誘導干細胞定向分化為肝系細胞的誘導劑,所述的誘導劑含有紅 景天,本發明所述的誘導劑特別是指誘導劑中含紅景天苷,或者含有紅景 天苷的同分異構體,或基團被修飾的單體化合物;另外,經實驗驗證,紅 景天苷元(即紅景天香去掉糖基,結構式如式(II )所示),也具有類似 的作用,也可以作為誘導劑用于誘導干細胞定向分化為肝系細胞。進一步 本發明所述的誘導劑為紅景天苷或紅景天苷元與細胞生長因子FGF-4的 組合物,具體應用時在基礎培養基中添加量為紅景天苦終濃度2yM, 細胞生長因子FGF-4終濃度10 ng/mL,或者在基礎培養基中添加量為 紅景天香元終濃度2 ju M,細胞生長因子FGF-4終濃度10 ng/mL。1% 2%;步驟為(1) 、將硫酸先溶解到甲醇中,然后將油脂或脂肪酸和硫酸甲醇一起加入到低壓反應釜中,反應壓力0.2 0.3MPa,反應溫度為80~95°C,催化劑硫酸占油 脂或脂肪酸重量的1% 2%,醇油重量比為0.8:1 1.2:1,反應時間為16~20h;(2) 、將步驟(l)所得反應混合物回收甲醇,然后將剩余物靜置分層,上層主 要為生物柴油,下層主要為甘油和硫酸;(3) 、將步驟(2)中的上層液體用60 7(TC溫水洗滌,洗至分層后下層水相呈中性,取上層油相經真空干燥脫水得到粗生物柴油;(4) 、將步驟(3)中的粗生物柴油經減壓蒸餾,在高于-0.1MPa真空條件下收 集17(TC 19(TC餾分,即為生物柴油制品。本發明的有益效果本發明提供了低酸催化制備生物柴油的新工藝,該工 藝具有原料適應范圍廣,酸添加量低,是帶壓反應,可以縮短反應時間,降低 能耗,產物轉化率高,工藝簡單,同時減少了三廢污染的產生,降低了生物柴 油的生產成本。
            具體實施方式
            下面結合具體實施例對本發明作進一步說明,以助于理解本發明的內容。 實施例l:向低壓反應釜中加入100g麻瘋果油(酸價3.8) , 2g濃硫酸, 100 g甲醇,硫酸先溶解在甲醇中再加入到反應釜中,反應壓力0.2 0.3MPa, 反應溫度85。C,反應時間18h。反應結束后通過甲醇蒸餾塔真空回收甲醇,然 后將產物靜置分層2小時,上層主要為脂肪酸甲酯,下層主要為甘油和硫酸。 將上層產物用約30 mL 60 7(TC熱水洗滌,靜置分層,重復2次后下層水相呈 中性,取上層油相經真空干燥脫除水分得到粗生物柴油產品95 g,通過生成的 甘油測得甲酯的轉化率為94.4%。得到的粗甲酯經減壓蒸餾塔減壓蒸熘,真空 度高于-0.1MPa,取17(TC 19(TC之間的餾分,為生物柴油最終產品。實施例2:向低壓反應釜中加入100g麻瘋果油(酸價3.8) , 1.5g濃硫 酸,80g甲醇,硫酸先緩慢滴加到甲醇中再加入到反應釜中,反應壓力 0.2 0.3MPa,反應溫度95。C,反應時間19 h。反應結束后通過甲醇蒸餾塔真空 回收甲醇,然后將反應產物靜置分層2小時,上層主要為脂肪酸甲酯,下層主 要為甘油和硫酸。將上層產物用約30mL60 7(TC熱水洗滌,靜置分層,重復 2次后下層水相呈中性,取上層油相經真空干燥脫除水分得到粗生物柴油產品 96 g,通過生成的甘油測得甲酯的轉化率為95.3%。得到的粗甲酯經減壓蒸餾 塔減壓蒸餾,在真空度高于-0.1MPa條件下取170。C 19(TC之間的餾分,為最 終生物柴油產品。實施例3:向低壓反應釜中加入100g麻瘋果油(酸價3.8) , 1 g濃硫酸, 100g甲醇,硫酸先溶解在甲醇中,再將硫酸甲醇溶液加入到反應釜中,反應肝損傷及中晚期肝臟疾病領域的深入研究,為新藥開發提供了基礎。(四)


            圖1為呈梭形的骨髓間充質干細胞;圖2為呈漩渦狀生長的骨髓間充質干細胞;圖3為不同誘導條件下甲胎蛋白(AFP)的表達;A:紅景天苷+FGF-4 聯合誘導組;B: FGF-4單獨誘導組;C: HGF+FGF-4聯合誘導組;D: HepG2陽性對照;圖4為不同誘導條件下CK18的表達;A:紅景天苷+FGF-4聯合誘導組; B: FGF-4單獨誘導組;C: HGF+FGF-4聯合誘導組;D: Hela細胞陽性 對照組;圖5為不同誘導條件下糖原合成情況;A: FGF-4單獨誘導組;B: HGF+FGF-4聯合誘導組;C:紅景天苷+FGF-4聯合誘導組; 圖6為不同誘導條件下谷丙轉氨酶(ALT)分泌情況; 圖7為不同誘導條件下谷草轉氨酶(AST)分泌情況; 圖8為不同誘導條件下尿素氮分泌情況。
            具體實施方式
            下面結合具體實施例對本發明進行進一 步描述,但本發明的保護范圍 并不僅限于此實施例1: 試劑及材料4周齡SD大鼠浙江省醫學科學院實驗動物中心;紅景天苷及紅景天苷元中國藥品生物制品檢定所;Percoll: Pharmacia公司;低糖DMEM培養基GIBCO公司;高糖DMEM培養基GIBCCV〉司;胎牛血清GIBCO公司;Hepes (2-[4-(2-羥乙基)-l-哌嗪]乙磺酸)Amresco公司;胰島素/轉鐵蛋白/竭Sigma公司;地塞米+>: Sigma ^>司;HGF: Pepro Tech公司;FGF-4: Pepro Tech公司。實驗步驟(1 )骨髓干細胞的獲取及其支持培養乙醚麻醉后頸推脫臼法處死SD大鼠(4周齡),無菌取脛骨和股骨, 剪開兩端骨骺,不含血清的MSC培養液(即低糖DMEM培養基添力。2mM 谷氨酰胺、10mM Hepes和各100U/ml的青、鏈霉素)反復沖洗骨髓腔,400m 篩網過濾,收集骨髓細胞。配制密度為1.073 kg/L的Percoll溶液(先用9份 密度為1.077kg/L的Percoll原液與1份8.5。/oNaCl或1.5M PBS混合達到生理 性滲透壓,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS )稀釋至Percoll濃 度為60%,即可得密度為1.073 kg/L的Percoll溶液),密度梯度離心,收 集中間的白膜層細胞即大鼠骨髓單個核細胞,以3xl0Vcm2密度接種于培 養瓶中,MSC培養液(為低糖DMEM培養基添加10。/。胎牛血清、2mM谷 氨酰胺、10mMHepes、各100U/ml青、鏈霉素),37。C飽和濕度、5%C02 孵箱培養24h后換液,去除懸浮細胞。以后每3天換液1次,此時可見細胞 呈梭型且呈旋渦狀生長(圖l、圖2)。當細胞達60%~70%融合后采用不同的接種密度進行常規傳代培養。(2)紅景天苦誘導骨髓干細胞定向分化為肝細胞取培養第3代的MSCs,以5xl0Vcm2密度接種于細胞培養亞(低糖 DMEM培養基添加10。/。胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、各 100U/ml的青、鏈霉素),37。C飽和濕度、5%(302孵箱培養;細胞匯合率 大90%時,換成基礎培養基(為高糖DMEM培養基添加2。/。胎牛血清、2mM 谷氨酰胺、10mM 2-[4-(2-羥乙基)-l-哌溱]乙磺酸(Hepes )、 1 x胰島素-轉 鐵蛋白-竭、200(ig/L地塞米松、100U/ml青鏈霉素和100U/ml鏈霉素);分 為3個誘導組,在基礎培養基中分別添加FGF-4單獨誘導組生長因子FGF-4 10ng/ml;HGF+FGF-4聯合誘導組生長因子FGF-4 10ng/ml, HGF 20ng/ml; 紅景天香+FGF-4聯合誘導組生長因子FGF-4 10ng/ml,單體化合物 紅景天苷2jiM;每3天換液1次,并觀察細胞形態的變化。于第7、 14、 21天分別收獲 細胞,提取蛋白檢測甲胎蛋白(AFP)和CK18的表達情況(圖3、圖4); 于第14天后Periodicacid-Schiff法檢測細胞內糖原合成(圖5 )。 實驗結果及結論從紅景天苦誘導骨髓干細胞定向分化為肝細胞的特異性蛋白(AFP, CK18)表達情況來看,誘導時間和物質表達情況之間具有明顯的時效關 系。在誘導的第4天,AFP開始表達,在誘導的第7天達到高峰,接近陽性 對照,在14天白蛋白表達,AFP已成陰性;CK18在第10天開始表達,第 14天達到高峰,紅景天香+ FGF-4組已經接近陽性對照組;糖原染色顯示, 紅景天芬+ FGF-4組糖原陽性率明顯已經超過FGF-4單獨誘導組及HGF+FGF-4聯合誘導組。(3)紅景天芬衍生物(以紅景天苷元為代表)誘導骨髓干細胞定向 分化為肝細胞取培養第3代的MSCs,以5xl0Vcm2密度接種于細胞培養皿,培養條 件同上實施例2;分為3個誘導組,在基礎培養基中分別添加FGF-4單獨誘導組生長因子FGF-4 10ng/ml;HGF+FGF-4聯合誘導組生長因子FGF-4 1 Ong/ml, HGF 20ng/ml;紅景天苷元+FGF-4聯合誘導組生長因子FGF-4 10ng/ml,單體化合 物紅景天苷元2pM;每3天換液1次,并觀察細胞形態的變化。于第14、 21及28天分別收獲 細胞,取上清檢測肝細胞特異性生化指標一 —谷丙轉氨酶(ALT)(圖6 ) 及谷草轉氨酶(AST)(圖7 )及尿素氮(圖8 )的分泌情況。 實驗結果及結論從紅景天香元誘導骨髓干細胞定向分化為肝細胞的生化指標(ALT、 AST和BUN)情況來看,誘導時間和物質表達情況之間具有明顯的時效關 系。ALT、 AST和BUN隨著誘導時間的延長,在誘導的第3、 4周達到正常 肝細胞的分泌水平。由此推測紅景天苷及其衍生物均具有誘導骨髓干細胞 定向分化為肝細胞的作用。利用紅景天苷及其衍生物紅景天苷元(或者其它同分異構體及其基團 被修飾的紅景天苷)可以誘導骨髓干細胞定向分化為肝細胞,如果將其成 功引入急慢性肝損傷以及晚期肝臟疾病(如肝衰竭),通過大量增殖逐步恢 復肝臟的正常功能,這將為治療難治性肝臟疾病提供組織細胞來源;同時 通過此法大量擴增肝細胞,可以進一步進行組織工程學等方面的研究。本發明所公開的內容,可以滿足本研究領域技術人員的應用,同時, 在閱讀了本發明的上述內容之后,本領域技術人員可以對本發明作出各種 改動或者修改,這些基于本發明的操作同樣落于本發明所限定的范圍。
            權利要求
            1.紅景天在制備誘導干細胞定向分化為肝系細胞誘導劑中的應用。
            2. 如權利要求1所述的應用,其特征在于紅景天中提取的紅景天苷在制備誘導干細胞定向分化為肝系細胞誘導劑中的應用。
            3. 如權利要求2所述的應用,其特征在于所述的干細胞為成體干細胞。
            4. 如權利要求3所述的應用,其特征在于所述成體干細胞為骨髓間充質 干細胞。
            5. 如權利要求4所述的應用,其特征在于所述應用為紅景天苷與細胞 生長因子FGF-4組合作為誘導劑用于誘導骨髓間充質干細胞定向分化 為肝系細胞。
            6. 如權利要求5所述的應用,其特征在于所述應用為if又大鼠骨髓間充 質干細胞進行傳代培養,取穩定傳代的骨髓間充質干細胞于誘導培養 基中,進行誘導培養,獲得成熟肝細胞樣細胞;所述誘導培養基為添 加有紅景天苷與細胞生長因子FGF-4的基礎培養基,所述基礎培養基 中紅景天苷與細胞生長因子FGF-4添加量為紅景天苷終濃度為1 5 U M,細胞生長因子FGF-4終濃度為5 20 ng/mL。
            7. 如權利要求6所述的應用,其特征在于所述的應用為取大鼠骨髓間 充質干細胞,進行傳代培養,取第3代的骨髓間充質干細胞,接種于 MSC培養基,37°C、 5。/。C02條件下培養至細胞匯合率大于90%,將細 胞培養基更換為添加有2jaM紅景天苷與10 ng/mL細胞生長因子 FGF-4的基礎培養基,誘導培養14天,得到成熟肝細胞樣細胞。
            8. 如權利要求7所述的應用,其特征在于所述MSC培養基為含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、 100U/ml青霉素、100U/ml鏈 霉素的低糖DMEM培養基;所述基礎培養基為含2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、 1 x胰島素-轉鐵蛋白-硒、200 ia g/L地塞米松、100U/ml青霉素、100U/ml 鏈霉素的高糖DMEM培養基。
            9. 一種誘導干細胞定向分化為肝系細胞的誘導劑,其特征在于所述的誘 導劑含有紅景天。
            10. 如權利要求10所述的誘導劑,其特征在于所述的誘導劑含紅景天苷元 或紅景天苷。
            全文摘要
            本發明提供了紅景天及紅景天苷在誘導干細胞定向分化為肝系細胞中的應用,尤其是紅景天苷與細胞生長因子FGF-4組合作為誘導劑用于誘導骨髓間充質干細胞定向分化為肝系細胞。本發明開拓了紅景天苷的新用途,即體外誘導骨髓干細胞等干細胞定向分化為肝系細胞;提供了紅景天及紅景天苷在誘導成體干細胞定向分化為肝系細胞中的作用,有利于體內干細胞移植治療急慢性肝損傷及中晚期肝臟疾病領域的深入研究,為新藥開發提供了基礎。
            文檔編號C12N5/071GK101225374SQ20081005951
            公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月25日 優先權日2008年1月25日
            發明者喬洪翔, 吳理茂, 李連達, 歐陽競鋒 申請人:浙江大學
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