專利名稱：：中期因子基因為靶的小干擾rna、載體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及中期因子基因為靶的小干擾RNA(SiRNA)、含有該小干擾RNA的載體，及其在制備抗腫瘤藥物和防治新生血管異常增生的藥物中的應用，屬于生物醫藥領域。
背景技術：
：肝癌是種高侵襲性、高轉移性的實體惡性腫瘤。盡管目前針對肝癌細胞本身進行的手術切除、化療和放療等治療方案日趨完善，但仍難以取得滿意的療效，因此探索新的有效的治療途徑已成為提高肝癌生存率的關鍵。近年研究表明，與其他實體惡性腫瘤一樣，腫瘤血管生成(angiogenesis)是肝癌無限制侵襲生長和轉移的基礎，如果沒有新生血管生成，原發腫瘤的生長不會超過12mm3。腫瘤組織必須依賴從新生血管中獲取營養和排泄代謝產物。因此，以新生血管為靶點，抑制肝癌血管生成，切斷肝癌和轉移的"命脈"，對腫瘤進行生物基因治療己成為近幾年新的研究熱點；它與傳統的以腫瘤細胞為靶點的治療手段相比，具有廣譜、放大的抗腫瘤作用，且毒副作用小，不易產生耐藥性的特點。中期因子(Midkine，MK)是一個新發現的促血管生成因子，其基因最初是在視黃酸(retinoicacid,RA)誘導分化早期的胚胎瘤細胞中被發現的，定位于染色體llq11.2，由5個外顯子和4個內含子組成，故又稱視黃酸反應性肝素結合性生長/分化因子。它是一種具有促細胞轉化、促有絲分裂作用、促血管生成、抗細胞凋亡和增強纖維蛋白溶解等腫瘤形成相關活性的堿性肝素結合性蛋白質，僅在胚胎中期和成年腎臟表達。已有的研究表明，MK能促進內皮細胞分化，對人腦與臍靜脈內皮細胞、PC12細胞、神經外胚層前體細胞和NIH3T3成纖維細胞具有有絲分裂原活性。在軟瓊脂培養中，MK能促進SW13細胞克隆形成，而將經MK轉染的SW13細胞和NIH3T3細胞接種無胸腺裸鼠，則能形成富含血管的腫瘤。在肝癌等許多人類惡性腫瘤組織中MKmRNA及蛋白均呈高度表達，而各種正常組織僅有低水平表達或無表達，并與肝癌的發生、浸潤轉移，血管生成及預后密切相關。因此，MK可能是抗血管生成治療肝癌的理想靶位。近年來的研究表明，一些小的雙鏈RNA(dsRNA)可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾(RNAinterference，RNAi)。其作用機制主要通過dsRNA被核酸酶切割成2125nt的干擾性小RNA片段即siRNA，由siRNA介導識別并耙向切割同源性靶mRNA分子而實現。在哺乳動物細胞中用siRNA能高效阻斷某個特定基因的表達，利用siRNA表達載體，無需像反義核酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期，并能在低于反義核酸幾個數量級的濃度下，使目標基因表達降到極低水平甚至完全"剔除"，從而產生缺失突變體表型，而且比基因敲除技術更快更簡單。該技術可介導哺乳動物細胞特異性基因沉默，可能成為關閉基因的有效手段。在基因功能、基因治療方面已顯示出巨大的應用前景，并且有潛在的藥物研究和開發價值。
發明內容本發明的目的是提供對肝癌腫瘤血管生成促進因子MK基因具有較好抑制活性的小干擾RNA序列及其化學修飾衍生物，為研發特異高效的新型抗肝癌血管生成基因治療的新藥提供基礎。本發明采用的技術方案是中期因子基因為靶的小干擾RNA,其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3，，反義鏈5,-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3'。所述小干擾RNA序列，是根據GenBank中的核酸序列數據庫，選擇NCBI公布的MidkinemRNA參考序列(GenBank序列號24475622)，通過對其進行基于多預測RNA二級結構的計算機輔助設計，根據Ambion公司的設計工具軟件進行設計得到。通過與GenBank聯機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會干擾人類其它正常基因的表達，其中前述序列篩選得到的為最佳序列，其作用于人MKmRNA的第282-302位，3號外顯子，該序列能特異性抑制人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內皮細胞的生長及肝癌腫瘤血管生成促進因子基因MK的表達，具有成為用于抑制MK高表達的肝癌細胞生長及與新生血管形成相關疾病的新型生物工程藥物的潛力。所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端可有26個dT或T修飾。優選的，所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端有2個dT或T修飾。優選的，所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUCtt-3，，反義鏈5'-GAAACCCACGCCGCAAUCCtt-3'。本發明還涉及所述的中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抗腫瘤藥物中的應用。包括有效成分的本發明的反義寡核苷酸或其修飾物以及藥物學可以接受的載體的藥物組合物，本發明的藥物組合物能用于抑制高表達MK的肝癌等惡性腫瘤細胞的生長及與新生血管形成相關的疾病。具體的，是所述中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抑制高表達MK的惡性腫瘤細胞生長的藥物中的應用。更為具體的，是所述中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中的應用。或者，是所述中期因子基因為靶的小干擾RNA在制備抑制高表達MK的惡性腫瘤新生血管生成的藥物中的應用。更為具體的，是所述中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抑制的肝癌新生血管生成的藥物中的應用。所述的中期因子基因為靶的小干擾RNA還可應用于制備預防和治療新生血管異常增生的藥物。本發明還涉及含有所述中期因子基因為靶的小干擾RNA的載體。基于所述中期因子基因為靶的小干擾RNA的特性，所述載體也同樣具有上述用途。本發明的有益效果主要體現在提供了特異性抑制人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內皮細胞的生長及肝癌腫瘤血管生成促進因子基因MK的表達的siRNA序列，為新藥研發提供了基礎。圖1為MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、匿6轉染HepG2后12，24，48，72h時間點的MKmRNA表達水平統計結果。圖2為MK2轉染HepG2細胞后MK蛋白的表達水平；1、2、3、4分別代表MK2濃度5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L和對照組。圖3為MK2轉染HepG2細胞后對細胞增殖的影響。圖4為MK2插入pRNAT-U6.1/Neo的載體圖譜。圖5為MK2-shRNA重組表達質粒插入序列的測序圖譜。圖6為MK2-shRNA轉染對HepG2細胞MKmRNA和蛋白表達的影響；圖中1、2、3、4依次代表對照組、MK2-shRNA濃度5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L組。圖7為MK2-shRNA轉染對HepG2/HUVEC細胞增殖的影響。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例l:耙向MK基因的小干擾序列的設計和篩選1、靶向MK基因小分子干擾序列的設計與合成檢索GenBank中的核酸序列數據庫，選擇NCBI公布的MidkineraRNA參考序列(GenBank序列號24475622)，通過對其進行基于多預測RNA二級結構的計算機輔助設計，根據Ambion公司的工具軟件設計了6對SiRNA。通過與GenBank聯機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會干擾人類其它正常基因的表達。6對SiRNA序列由上海吉瑪公司合成，用150ul的DEPC水稀釋，濃度為20pmol/ul，于-20。C保存。合成的6對SiRNA序列見表l。表l:依據Ambion公司設計軟件設計合成的siRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、耙向MK基因小分子序列的篩選細胞所用試劑人HepG2肝癌細胞系由中科院上海細胞研究所提供，人臍靜脈內皮細胞系(HUVEC)購自美國CascadeBiolgics公司。細胞用含10%小牛血清及100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素的DMEM培養基，置37'C、5%C02孵箱培養。PCR相關試劑(Taq酶、逆轉錄酶、dNTP、OligdT等)；限制性內切酶BamHI、HindIII(TAKARA);T4DNA連接酶(invitrogen);瓊脂糖凝膠回收試劑盒；氨節青霉素(sigma);G418(GIBCO);Trizol〔invitrogen);MMLV(promage)、RPMI1640(GIBCO);胎牛血清(GIBCO);MK抗體(自制)；donkeyanti-rabbit(sc-2317，SANTACRUZ);CellLysis;SupersignalWestFemtokit;PMSF;定影液；顯影液儀器材料低溫高速離心機(Biofbge28RS)，恒溫水浴箱(ModelDK-8D);C02細胞培養箱(MCO-17AC);倒置顯微鏡(XDS-1A);光學顯微鏡；細胞超凈臺(ESCD);6孔細胞培養板，熒光定量PCR儀FTC2000;酶標儀；電泳槽；轉膜儀；電泳儀；轉膜槽；磁力攪拌器；脫色搖床；WS-III型卡片式暗盒；凝膠圖象分析系統BioSenSC300。實驗方法細胞培養和轉染方法肝癌細胞株HepG2或HUVEC細胞培養于含10%小牛血清的RPMI1640中，生長呈對數期狀態備用。細胞接種于6孔細胞培養板中。培養過夜后，用01igofectamine2000轉染劑將SiRNA導入細胞。在1.5ml的eppendorf管中將7.5ul的oligofectamine加入10.5ul的RPMI1640中，混勻室溫放置5~10分鐘，分別將一定量的6種SiRNA加入到RPMI1640至體積102ul，再混合兩種溶液，室溫放置20分鐘；棄盡細胞孔的培養基，加入480ul含10X小牛血清的RPMI1640，然后加入制備好的上述轉染試劑，空白組僅用轉染試劑，一式三份，混勻，置細胞培養箱中。RNA提取用Trizol試劑提取總RNA。棄盡培養液后，每孔加入0.5ml的Trizol試劑，反復吹打，轉移至1.5ml的eppendorf管中，加入0.2倍體積的氯仿，振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘后,4'C條件下15000g離心15分鐘，吸上清至另一eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，4。C條件下15000g離心10分鐘，棄上清，沉淀加75%乙醇，7500g離心5分鐘洗滌，次，室溫放置10分鐘左右，加入10ul的0.1。/。DEPC水溶解，260nm測光密度，用40ug/ml/OD計算RNA濃度，然后用0.1%DEPC水調節濃度至200ng/ul，-20°C保存備用。RT-PCR檢測MKmRNA方法cDNA合成用Invetrogen公司所提供的SuperscripTM逆轉錄試劑盒進行，其過程簡述如下取10ul上述RNA，加入lul的50uMligodT，7(TC變性10分鐘，立即置冰上2分鐘，離心。然后加入9ul混合試劑4ul5X1Strandbufer、2ul0.1MDTT、MdN(A,T，C,G)TP、lulRNaseinhibitor、0.5ulSSTR2、0.5ul1%DEPC水，在42°C水浴52分鐘，然后7(TC水浴15分鐘終止反應，再加入水80ul，置冰箱保存。實時定量PCR方法50ul反應體系中含有MK基因上游引物(5，-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3，)、下游引物(5'-CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3')各0.3uM、探針(5，-CCAGGAGACCATCCGCGTCCC-3，)0.2uM;2.5ul20XHmnanGAPDH;25ul2xPCRmastermix(PE公司)；10ul上述cDNA;加水補足體積。然后在定量PCR反應儀7700(PE公司)進行，反應條件為5(TC預變性2分鐘；95"C變性10分鐘；95'C變性30秒；6(TC退火1分鐘，擴增40個循環。然后以內參照GAPDH基因相對定量MK基因表達。WesternBlot檢測MK蛋白表達提取孔中培養的HepG2細胞或HUVEC細胞，用預溫PBS洗滌一次，加入200^1/孔CellLysis，冰上放置10min，用細胞刮刮下細胞，4。C低溫離心U000轉/minxlOmin，吸取上清到新鮮Eppendorf管中。用蛋白定量試劑盒定量，取120昭蛋白作電泳并轉膜。兔抗MK抗體作為一抗，工作濃度為I:IO，Anti-rabbit為二抗，濃度為1:4000;按以下步驟操作①灌膠10%聚丙烯酰胺凝膠。②樣品處理加入6x加樣緩沖液，10(TC煮沸5min。③電泳80V電泳45min，150V電泳85min。轉膜:轉膜前10min將硝酸纖維膜和濾紙浸泡在轉膜緩沖液中，恒定電壓100V轉膜60min。⑤春紅染色2min，去離子水漂洗，將Marker條帶標記好。⑥用脫脂奶粉阻斷，室溫阻斷23h(或4。C過夜)。⑦加一抗，室溫結合2h(或4。C過夜)。⑧TBST洗滌3xl0min。⑨加二抗，室溫結合lh。⑩TBST洗滌3xl0min。(11)加底物顯色，結合lmin，將膜速封，放入X光片盒。(12)曝光，在暗室中放入X光膠片lmin，使膠片與膜接觸曝光。(13)把膠片放入顯影液1min，清水漂洗，放入定影液中，透明為止。(14)吹干，分析。MTT法分析細胞生長抑制轉染后48小時的細胞的OD值(A4卯).根據公式抑制率-[(A對照一A用藥)/A對照]xl00。/。計算出細胞抑制率。再根據抑制率計算半抑制濃度IC50。實驗基本操作方法HepG2肝癌細胞或HUVEC細胞經培養至對數生長期，接種至培養板孔中，轉染siRNA或shRNA至細胞中，接下來分二方面來操作1、用MTT法來評價轉染48h后的siRNA或shRNA對細胞生長的抑制情況；2、提取RNA，用RT-PCR來評價MKmRNA的量，用WesternBlot來評價MK蛋白表達水平，根據圖片和結果數據，Bio-rad圖像分析系統檢測，再與對照組比較分析的出結論。細胞培養、轉染、RNA提取、RT-PCR、WesternBlot、MTT在上述已列出，試驗中培養基和轉染劑及試劑的用量及操作的要求按實驗目的和效果來定。6條siRNA抑制HepG2肝癌細胞MK表達的最佳siRNA及時間效應評價HepG2肝癌細胞經培養為對數生長期，接種于6孔培養板中，轉染6種相同濃度siRNA后，進行培養，分別在轉染后12h、24h、48h、72h四個時間段收集細胞，抽提mRNA。然后經RT-PCR檢測MKmRNA的量及對MK的抑制率，與空白載體組對照，Bio-rad圖像分析系統檢測，從而可以評價哪種siRNA對MK的抑制作用最強，將其篩選出。MK-2siRNA作抑制HepG2肝癌細胞生長情況及劑量效應評價HepG2肝癌細胞經培養為對數生長期，接種于96孔培養板中，轉染不同濃度MK-2siRNA后，進行培養，48h后，每孔加入10ul5mg/mL的MTT液，37°C、5。/。C02細胞培養箱孵育4小時，棄去培養液，每孔加入150ulDMSO，37。C振蕩10min，使結晶充分溶解，酶標儀在測量波長570nm、參考波長為630nm條件下測量各孔的吸光度OD值。轉染后48小時的細胞的OD值(A490).根據公式抑制率呵(A對照一A用藥)/A對照]xlO()n/。計算出細胞抑制率。MK-2siRNA抑制MKmRNA和蛋白表達水平情況及劑量效應評價HepG2肝癌細胞經培養為對數生長期，接種于6孔培養板中，轉染不同濃度MK-2siRNA后，進行培養，24h后，收集細胞，分別抽提mRNA和蛋白，RT-PCR檢測MKmRNA，WesternBlot檢測MK蛋白表達。RT-PCR、WesternBlot在前面論述己經列出，同上。結果1.耙向MKmRNA的shRNA的設計與合成根據MKmRNA的計算機模擬二級結構，設計了6條siRNA。根據Ambion公司的設計工具軟件設計，上海吉瑪公司合成，序列見表l。各用150ul的DEPC水稀釋，濃度為20pmol/ul，于-2(TC保存。2.6條SiRNA轉染對HepG2細胞MK表達的影響RT-PCR法檢測MK1、MK2、MK3、Mk4、MK5、MK6轉染HepG2細胞后，轉染后不同時間點HepG2細胞中MK的表達水平，統計如下，與對照組相比，MK1、MK2、MK3、Mk4、MK5、MK6分別不同程度的抑制了HepG2細胞MK基因的表達，其中MK2在同一時間點抑制效率均高于MK1、MK3、Mk4、MK5、MK6的抑制水平，且在轉染后24h檢測點的抑制水平達到9615/。(圖1)。進一步轉染不同濃度的MK2siRNA入HepG2細胞，檢測轉染后24hHepG2細胞MKmRNA和MK蛋白的表達水平。故篩出MK2-siRNA進行進一步的實驗研究。結果顯示，MK2-siRNA轉染24h對MKmRNA的抑制率為5nmol/L的抑制率為42.5%,50nmol/L的抑制率為96%,500nmol/L的抑制率為99%;故釆用50nmol/L的轉染工作濃度進行進一步的實驗研究。3.MTT法檢測MK2-SiRNA轉染對HepG2細胞生長的影響轉染48小時后，不同濃度的MK2-SiRNA均有效抑制HepG2細胞的增殖，且具有劑量依賴效應。這與不同濃度的MK2-SiRNA轉染后對MK蛋白的抑制水平基本保持平衡，兩者具有很好的相關性。結果統計見圖3。實施例2:MK2-siRNA重組表達質粒的構建及其活性驗證1.構建重組質粒載體MK2-shRNA:取上述抑制效率最高的MK2-SiRNA構建shRNA，選擇的載體為美國genscript公司的pRNAT-U6.1/Neo，U6啟動子下游作表達的兩個酶切位點分別為BamHI禾BHindIII，構建MK2-shRNA重組表達質粒。先化學合成R7-l:5'-gatcccGGATTGCGGCGTGGGTTTCttgatatccgGAAACCCACGCCGCAATCCttttttccaaa-3，禾tlR7-2:5，-agcttttggaaaaaaGGATTGCGGCGTGGGTTTCcggatatcaaGAAACCCACGCCGCAATCCgg-3，，兩條單鏈復性成雙鏈，將目的片段與載體PRNAT-U6.1/neo分別用BamHI和HindIII進行雙酶切，并用凝膠回收試劑盒回收。酶切后，載體和片段用T4DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化到DH5(x巾，涂于氨芐陽性板中，挑取陽性克隆并增菌，抽提質粒進行鑒定。用測序法測序基因序列準確性，測序序列Forward:5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3'。2.MK2-shRNA轉染到HepG2細胞，檢測MK抑制情況HepG2肝癌細胞經培養為對數生長期，接種于6孔培養板中，將shRNA轉染到細胞中，同時設立空質粒組和脂質體組，進行培養，用RT-PCR檢測MKmRNA表達。轉染MK2-shRNA(分三組，濃度分別為5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L)后，繼續培養24h收集細胞，抽提mRNA和蛋白，RT-PCR和WesternBlot具體操作同上。3.MTT法檢測MK2-shRNA轉染對HepG2/HUVEC細胞增殖的影響HepG2/HUVEC細胞處于對數生長期，接種96孔板，培養過夜，轉染MK2-shRNA(5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L)，轉染后48h，MTT法檢測細胞增殖水平，方法同上。結果1.構建MK2的重組表達質粒取上述抑制效率最高的MK-2構建shRNA，選擇的載體為genscript的pRNAT-U6.1/Neo，U6啟動子下游作表達的兩個酶切位點分別為Bamffl和HindIII。先化學合成R7-l:5'-gatcccGGATTGCGGCGTGGGTTTCttgatatccgGAAACCCACGCCGCAATCCttttttccaaa-3，禾tlR7-2:5，-agcttttggaaaaaaGGATTGCGGCGTGGGTTTCcggatatcaaGAAACCCACGCCG-CAATCCgg-3'，兩條單鏈復性成雙鏈，將目的片段與載體PRNAT-U6.1/neo分別用BamHI和HindIII進行雙酶切，并用凝膠回收試劑盒回收。酶切后，載體和片段用T4DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化到DH5a中，涂于氨芐陽性板中，挑取陽性克隆并增菌，抽提質粒進行鑒定。載體質粒圖譜見圖4。用測序法測序基因序列準確性，測序序列Forward:5，-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3，。序列分析軟件分析結果顯示，所插入序列與目的序列MK2-SiRNA同源性100n/n，測序結果見圖5。2.RT-PCR和western-blot法檢測MK2-shRNA轉染對HepG2細胞MKmRNA和蛋白表達的影響MK2-shRNA轉染24小時后，收集細胞提RNA和總蛋白，供RT-PCR和western-blot實驗。檢測結果表明，MK2-shRNA轉染有效抑制HepG2細胞MKmRNA和蛋白的表達，并具有劑量依賴效應，結果見圖6。3.MTT法檢測MK2-shRNA轉染對HepG2/HUVEC細胞增殖的影響MK2-shRNA轉染48小時后，不同濃度的MK2-shRNA均有效抑制HepG2/HUVEC細胞的增殖，且具有劑量依賴效應。這與不同濃度的MK2-shRNA轉染后對MKmRNA和蛋白表達的抑制水平基本一致，兩者具有很好的相關性。結果統計見圖7。序列表.ST25.UtSEQUENCELISTING<110〉湖州中心醫院<120>中期因子基因為靶的小千擾RNA、載體及其應用<130><160〉18<170〉Patentlnversion3.2<210〉1<211>19<212〉RNA<213〉Unknown〈220〉<223>人工序列<400〉1cugg卿卿gaguuuggei<210>2<211>19〈212>腿<213>Unknown〈220〉〈223〉人工序列〈400〉2uccaaacuccuucuuccag19〈210〉3<211〉19<212>廳<213〉Unknown<220>〈223〉人工序列<400〉3ggauugcggcguggguuuc<210〉4<211>19〈212〉RNA<213〉Unknown<220><223〉人工序列<400>4gaaacccacgccgcaaucc19<210>5〈211>19<212〉RNA<213>Unknown〈220〉<223>人工序列<400〉5guacaaguuugagaacugg19<210>6<211〉19<212>RNA序列表.ST25.txt<213>Unknown<220〉<223>人工序列<400>6ccaguucuc3aacuuguac19<210>7<211>19<212〉RNA〈213〉Unknown<220><223>人工序列<400>7g83ggcgcgcuacaaugcu19<210>8<211>19<212>腿<213>Unknown<220><223>人工序列〈400>8agc肌uguagcgcgccuuc19<210>9<211〉19<212>艦<213>Unknown<220><223〉人工序列<400>9gacca肌gcaaaggccaaa19〈210>10<211>19<212〉RNA<213〉Unknown〈220〉<223>人工序列<400>10uuuggccuuugcuuugguc19<210〉11<211〉19〈212>RNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400〉11sggcca33gcC33gaaagg19<210〉12<211>19<212>RNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400〉12ccuuucuuggcuuuggccu序列表.ST25.txt19<210><211〉〈212〉〈213〉1319DNAUnknown<220〉<223〉人工序列<400>13gcgcgctacaatgctcagt19<210><211〉<212〉<213>1420■Unknown<220〉<223〉人工序列<400〉14cccttccctttcttggcttt20<210>15<211〉21<212>醒〈213>Unknown<220>〈223〉人工序列<400>15ccaggagaccatccgcgtccc21〈210〉16<211>65<212〉DNA<213〉Unknown<220><223>人工序列<400>16gatcccggattgcggcgtgggtttcttgatatccggaaacccacgccgcaatcctttttt60cca犯65<210〉17〈211>65<212>DNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400>17agcttttggaaaaaaggattgcggcgtgggtttccggatatcaag站acccacgccgcaa60tccgg65<210>18〈211〉23〈212〉隱<213>Unknown序列表.ST25.txt<220><223>人工序列<400>18tacg8tacaaggctgtt3gagsg2權利要求1、中期因子基因為靶的小干擾RNA，其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5’-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3’，反義鏈5’-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3’。2、如權利要求1所述的中期因子基因為靶的小干擾RNA，其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端有26個dT修飾。3、如權利要求2所述中期因子基因為靶的小干擾RNA，其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端有2個dT修飾。4、權利要求13之一所述的中期因子基因為靶的小干擾RNA在制備抗腫瘤藥物中的應用。5、如權利要求3所述的應用，其特征在于所述中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抑制高表達MK的惡性腫瘤細胞生長的藥物中的應用。6、如權利要求4所述的應用，其特征在于所述中期因子基因為靶的小十擾RNA在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中的應用。7、如權利要求3所述的應用，其特征在于所述中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抑制高表達MK的惡性腫瘤新生血管生成的藥物中的應用。8、如權利要求7所述的應用，其特征在于所述中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備抑制的肝癌新生血管生成的藥物中的應用。9、權利要求13之一所述的中期因子基因為耙的小干擾RNA在制備預防和治療新生血管異常增生的藥物中的應用。10、含有如權利要求1或2所述中期因子基因為靶的小干擾RNA的載體。全文摘要本發明提供了中期因子基因為靶的小干擾RNA，所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5’-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3’，反義鏈5’-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3’。本發明的有益效果主要體現在提供了特異性抑制人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內皮細胞的生長及肝癌腫瘤血管生成促進因子基因MK的表達的siRNA序列，為新藥研發提供了基礎。文檔編號C12N15/11GK101407810SQ20081005936公開日2009年4月15日申請日期2008年1月25日優先權日2008年1月25日發明者行姚,戴利成,楊水新,翔王申請人:湖州市中心醫院