專利名稱：：一種甘草查爾酮合成酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及査爾酮合成酶及其基因與應用，具體涉及到烏拉爾甘草(G/yc^r/^a"ra/e朋^F^c/z)中一個査爾酮合成酶基因及其在提高植物總黃酮含量中的應用，屬于植物分子生物學領域。
背景技術：
：黃酮類化合物在植物界分布很廣，在植物體內大部分與糖結合成苷類或碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。天然黃酮類化合物母核上常含有輕基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基。由于這些助色團的存在，使該類化合物多顯黃色。黃酮類化合物具有廣泛重要的生理功能，是許多中草藥的主要有效成分，普遍被應用于臨床治療和以黃酮類化合物為功能因子的保健食品中。在藥學方面，目前已經有不少以黃酮類化合物起主要作用的中草藥制劑，如安宮寧膠囊、雙黃連注射液、雪蓮注射液、銀杏口服液等。也有黃酮類的提取物單獨使用或添加到其他藥物中發揮作用。如大豆提取物染料木黃酮對前列腺癌的多個細胞系具有明確的抑制作用；沙棘黃酮口服液能降低高脂而且癥患者的總膽固醇、甘油三醇，極高密度脂蛋白含量，對高脂血癥患者的臨床總有效率為90%;橙皮(二氫黃酮苷)具有和蘆丁相同的用途，也有維生素P樣功效，是治療冠心病藥物"脈通"的重要原料之一；杜鵑素(二氫黃酮)是祛痰成分，臨床用于治療慢性支氣管炎。在食品方面，黃酮類化合物可應用于食品中以增加其保健作用。一種是將富含黃酮類的原料直接加工成食品，如以富含黃酮類物質的植物葉部為原料，采用一般茶葉的炒制加工方法，制作出來的沖泡型葉茶銀杏茶、柿葉茶、核桃茶葉、桑葉茶等；或以黃酮類化合物來源的植物為原料制成液體飲料復方沙棘飲料、黑米飲料。另一種是先從原料中提取出黃酮類物質，再把它添加到其它原料中進行加工制成產品。如銀杏葉黃酮芒果汁保健飲料、靈芝杏葉保健飲料、二綠天然保健飲料、山碴酮酒等。甘草是我國重要的傳統中藥，具有清熱解毒、潤肺祛痰、緩急止痛、補氣益脾胃、調和諸藥等功效，被譽為"眾藥之王"。甘草的主要有效次生代謝產物包括三萜類甘草酸和甘草黃酮，甘草黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗潰瘍、抗衰老、保肝等藥理作用，是一類天然抗菌劑和防腐劑。然而甘草野生資源的瀕臨滅絕阻礙了甘草的深入開發利用。隨著生物工程技術的不斷提高，利用毛狀根培養來生產次生代謝產物成為研究熱點，其生長迅速，分支多，不需要外源激素，而且比細胞培養容易放大，是藥用植物資源可持續發展的有效途徑之一。但是甘草毛狀根培養系統仍然存在活性成分低的問題，影響了甘草毛狀根的進一步發展放大和工業化。如張蔭麟等(甘草的發狀根培養，中草藥，19卯，21(12):23—26)報道烏拉爾甘草毛狀根的總黃酮含量為干重的0.39%，遠遠低于生藥根的含量2.38%;杜旻等(甘草毛狀根培養系統的建立及化學成分分析，植物資源與環境學報，2001，10(1)7-10)研究的烏拉爾甘草毛狀根黃酮含量也約為0.39%;王裔惟等(光果甘草毛狀根培養過程中對活性氧清除能力和總黃酮含量的變化，植物資源與環境學報，2004，13(2):6-9)檢測光果甘草毛狀根在生長31(1后總黃酮達到最高含量為0.78%;楊世海等(甘草Ri質粒轉化及不同理化因子對甘草毛狀根生長的影響，中國中藥雜志，2006,131(11):875-878)檢測了烏拉爾甘草毛狀根中各種不同黃酮的含量，其總黃酮的含量約為O.15%。甘草黃酮類化合物為次生代謝產物總黃酮的混合物，整個代謝途徑十分復雜(StefanM.,AxelM.(2005),Flavonesandflavonesynthases.Phytochemistry,66:2399-2407.)。^^而在]t匕生物合成途徑中，其下游的各種類型黃酮均來源于上游的同一骨架，即查耳酮。l分子4一香顯酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下產生査耳酮(苯基苯乙烯酮)。因此，查耳酮合酶是將苯丙垸類代謝途徑引向黃酮類合成的第一個酶。査耳酮形成后經異構化反應轉變成黃烷酮(Flavanone)，再經過不同的催化反應和修飾產生不同類型的黃酮類化合物包括黃酮(Flavone)、異黃酮(Isoflavone)、黃酮醇(Flavonol)、花青素(Anthocyanidin)(JBHarborneHBaxterTheHandbookofNaturalFlavonoidsJohnWiley&SonsChichester,1999〃P)等，因此查耳酮骨架的形成決定了其下游各種黃酮類化合物的合成，是一個極其重要的限速步驟。也因此査耳酮合成酶(CHS)是整個代謝過程中最重要的關鍵酶。隨著現代分子生物學的飛速發展，應用基因工程技術，分離克隆次生代謝產物生物合成途徑中關鍵酶基因，并將其轉化到目的植物基因組中，達到提高植物中次生代謝活性成分已被證明是一條十分有效的途徑。Seo等人(SeoJW,JeongJH,ShinCG,etal.(2005)，OverexpressionofsqualenesynthaseinEleutherococcussenticosusincreasesphytosterolandtriterpeneaccumulation.Phytochemistry.66(8):869)把來自人參的鯊烯合成酶(squalenesynthase,SS)以農桿菌介導轉入剌五加中，結果表明該酶的活性比對照增強了3倍，其下游產物植物甾醇類和三萜皂苷類的水平提高了2-2.5倍。2006年，Lunkenbein等將35S啟動子驅動反義查耳酮合成酶基因導入草莓，獲得的25個轉基因株系中，9個株系CHSmRNA積累比未轉化植株減少50%以上，以查耳酮為前體的花青素、黃酮醇、原花青素的積累減少(LunkenbeinS,CoinerH,deVosCH,SchaartJQBooneMJ,KrensFA,SchwabW，SalentijnEM.(2006)，Molecularcharacterizationofastableantisensechalconesynthasephenotypeinstrawberry(Fmgariaxananassa).JAgricFoodChem.54(6):2145-53)。反義轉化結果表明，査耳酮合成酶調控下游黃酮類化合物的合成，是關鍵酶。在甘草中，査爾酮合成酶基因的克隆還沒有見到報道。
發明內容本發明的第一個目的是提供一個甘草查爾酮合成酶及其編碼基因。本發明所提供的査爾酮合成酶，來源于烏拉爾甘草(Gi[ycy/T/^"wra/ea^F/"/z)，是下述蛋白質(i)或(ii):(i)具有序列表中的SEQIDNO:1的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一至十個氨基酸殘基且具有相同功能的由(i)衍生的蛋白質。序列表中的SEQIDNO:1氨基酸序列由389個氨基酸殘基組成，將具有該氨基酸序列的蛋白命名為CHS7G;所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。對氨基酸殘基進行取代、缺失或添加的方法均是本領域技術人員所熟知的，通常是利用基因工程的手段對其編碼基因進行突變，然后通過檢測該突變基因在植物中超表達后是否能夠有效提高植物中總黃酮含量，可以判斷發生這些變化后的蛋白是否還具有査爾酮合成酶的功能。編碼本發明來源于甘草的查爾酮合成酶的基因C/iS7G，既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；或者是與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，例如序列表中SEQIDNO:2的DNA序列。含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增C/K7G中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。本發明的第二個目的是提供一種提高植物中總黃酮含量的方法。本發明發現，査爾酮合成酶基因的超表達能夠有效提高植物中總黃酮含量。本發明所提供的提高植物總黃酮含量的方法，是將編碼本發明甘草査爾酮合成酶基因或者是與該基因具有卯X以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列導入植物組織、細胞或器官，植物總黃酮含量獲得提高。在上述提高植物總黃酮含量的方法中，本發明中甘草査爾酮合成酶基因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進行分離和/或修飾和/或設計得到的。本領域的技術人員應該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會導致該基因效能的降低或者加強，而且在一些應用(例如，反義或共抑制技術)中，部分序列經常會和全長序列同樣有效地發揮作用。基因序列變化或縮短的方法，以及測試這些發生變化的基因的有效性的方法均是本領域技術人員熟知的。本發明甘草查爾酮合成酷基因或其同源序列可通過植物表達載體導入植物組織、細胞或器官；用于構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種可用于根瘤農桿菌或發根農桿菌轉化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin系列載體(如pBinl9等)、pBI系列載體(如pBI101等)、Gateway系列載體(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達載體，所述出發載體還可為可在原核生物中復制的載體，如pENTER-TOPO、pUC系列載體或pBluescript系列載體等。使用本發明中甘草査爾酮合成酶基因或其同源序列構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子。所述組成性表達啟動子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actinl啟動子等；所述組織特異性表達啟動子可為根特異性表達啟動子、葉片特異性表達啟動子、維管特異性表達啟動子、種子特異性表達啟動子、花特異性表達啟動子或花粉特異性表達啟動子，如2S1啟動子(GenBank號NM_118848.2，GI:30687489)和NapinA(GenBank號M64633.1，GI:349405)啟動子等；所述誘導型啟動子可為受乙烯、乙醇等誘導的啟動子。上述啟動子可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子和/或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因、慶大霉素標記物或卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進行篩選，含潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由潮霉素進行篩選。經上述方法進行篩選后還可采用Southern、PCR或點雜交等分子檢測手段對轉基因植株進行檢測，以確定其是否轉化有目的基因。本發明的一個具體實施方式是以pXQ-35s(pCambial301敲除GUS基因之后而得)為出發載體，構建含有本發明甘草査爾酮合成酶基因的植物表達載體pXQ-35s-CHS7G。攜帶有本發明甘草査爾酮合成酶基因或其同源序列的植物表達載體可通過使用原生質體-化學介導法(Ca2+、PEG)、Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、花粉管導入、微注射、電激、基因槍、農桿菌介導等常規生物學方法中的任何一種或幾種方法的組合轉化植物細胞、組織或器官，培養總黃酮合成提高的植物細胞系、組織或器官，還可以進一歩將轉化的植物細胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、根、莖尖、葉片和種子等。黃酮類化合物廣泛存在于植物的各個部位，尤其是花、葉部位，主要存在于蕓香料、唇形科、豆科、傘形科、銀杏科與菊科中。因此本發明的方法對多種植物均適用，所述被轉化的植物細胞、組織或器官來源廣泛，包括雪蓮、葛根、甘草、苜蓿等多種植物。本發明首次克隆了甘草查爾酮合成酶的基因，并利用發根農桿菌轉化技術，成功將査爾酮合成酶基因轉化到甘草毛狀根中，改變甘草次生代謝產物積累方式，大幅提高了甘草發根中總黃酮含量。實驗證明，本發明克隆的甘草査爾酮合成酶基因轉化到甘草毛狀根中后，査爾酮合成酶基因表達增強，相應的甘草毛狀根中總黃酮含量較沒有轉化的毛狀根最高可以提高2.5倍左右。査耳酮合成酶是植物體內黃酮類化合物代謝途徑中的第一個關鍵酶。因此，本發明提供的甘草査爾酮合成酶基因(Ci/S7G)為基因工程改良植物體內黃酮類化合物的合成提供了一種有效的技術手段，具有廣泛的應用前景和極大的經濟價值，特別是可使甘草在醫藥、保健品、食品及化妝品領域得到更廣泛的應用，將帶來巨大的經濟效益和社會效益，意義深遠。下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步說明。圖l為表達載體pXQ-35s—CHS7G的構建過程示意圖。圖2為甘草査爾酮合成酶基因C7/S7G通過發根農桿菌A4的介導轉化甘草毛狀根的Southern雜交結果。圖3為甘草查爾酮合成酶基因(CHS7G)在轉基因甘草毛狀根系中的表達模式圖，上方為RT-PCR結果，下方為內參actinRT-PCR結果。具體實施方式下述實施例中所使用的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆實驗指南》(第三版)，本申請發明人克隆到了烏拉爾甘草中査爾酮合成酶基因的cDNA，并確定了其堿基序列。實施例1、查爾酮合成酶基因CHS7GcDNA的分離1、植物材料準備、總RNA的分離將烏拉爾甘草(G/j^/r/z&"wra/m^)的成熟種子消毒后于l/2MS培養基上萌發，在25。C恒溫與16小時光照周期的培養室中無菌培養20天左右，植株生長健壯，準備用于總RNA提取。用Invitrogen公司的Trizolreagent進行材料的總RNA提取，整個操作過程保證無RNA酶污染并嚴格按照Trizol試劑的RNA提取流程說明，將提取的RNA分裝成小份，凍存在一80。C下備用。2、CHS7G基因序列的獲得根據大豆査爾酮合成酶基因CHS7(GenBankAccessionNo.M98871)序列設計引物Gmchs7F:5'-AGGAAAGATGGTTAGCGTAGC-3'Gmchs7R:5'-CTCAGATGGCCACACTATGCA-3'應用首鏈cDNA合成試劑盒(Femiantas)合成cDNA。條件如下總RNA0.1-5.0|ug(4(al)Oligo(dT)18引物0.5ngDEPCH20補充到總體積12|al輕輕混勻，瞬時離心到管底，7(TC水浴中反應5min后冰上放置冷卻，離心收集反應液體至管底。在冰上按順序加入以下組分5xreactionbuffer4plRiblockRibonucleaseinhibitor1^tldNTP(10mM)mix2(il輕輕混勻，37'C反應5min。力口入M-MLVReverseTranscriptase總體積為20(J，42。C反應lh后，70°C，用于PCR。反應體系及參數如下cDNA2xPCR緩沖液dNTP(10mM)正向引物(lOpM)反向引物(lOpM)Taq酶(2,5U/pl)H20(滅菌超純水)反應條件94°C3min;94°C3min，55°COsec，1^110min終止反應。冰上放置。其cDNA產物2pl0.4|td0，0.5^10.4nl15.2pl72。C1min30次循環；72。C1Omin。PCR擴增得到的產物經過電泳跑膠回收后連接到pGEM-Teasy載體上(購自promega公司)，命名為pGEM-Tl，并轉化co//DH5a，用于測序。使用3730DNASequencer(Invitrogen公司)測定，所確定的堿基序列如序列表SEQIDNO:2所示，將其命名為實施例2、表達載體構建并通過發根農桿菌A4介導轉化甘草毛狀根。1、植物表達載體pXQ-35s—CHS7G的構建將甘草查爾酮合成酶基因Cfffi7G利用酶切位點Xbal/SacI從T載體上切下，與帶有35s啟動子和nos終止子的植物表達載體pXQ-35s同樣用Xbal/SacI酶切后(pCambial301敲除GUS基因之后而得)連接，構建表達載體pXQ-35s—CHS7G(如圖l所示)。2、將重組質粒pXQ-35s-CHS7G采用凍融法轉化到發根農桿菌A4中A、取2-3(J質粒(濃度lng/pl)轉化剛制好的發根農桿菌A4感受態細胞，冰上放置30min;B、浸入液氮中5min，37。C水浴5min，加入500(^1空YEB(牛肉浸膏5g/L，酵母膏lg/L;蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，七水合硫酸鎂4g/L，pH7.4)，28°C，150-160rpm搖3-5h;C、涂板，28'C培養箱中培養2-3天；D、挑取單克隆進行菌落PCR鑒定。3、發根農桿菌轉化甘草毛狀根將攜帶外源C/^7G基因的發根農桿菌先涂布于固體YEB培養基，28'C培養2天后，選取單克隆菌斑于液體YEB培養基中，28'C振蕩培養至一定濃度，再取少量菌液至YEB培養基中擴大培養至OD,-0.5-0.7，然后，將菌液離心收集，去上清，加入同體積的MS液體培養基混勻。將萌發3—4天后的甘草無菌苗的子葉節外植體，在其中浸泡20分鐘后，取出，用無菌濾紙吸干，接入共培養培養基，共培養2天后(暗培養)，以無菌水沖洗后轉入無激素的MS固體培養基(含500mg/L的頭孢噻肟鈉)。4天后即有發根出現，得到的甘草發根轉接入無激素的MS固體培養基中(250mg/L的頭孢噻肟鈉)繼代生長。繼代4一5次除菌完全后，將其轉入液體培養(不含頭孢噻肟鈉，含有卡那霉素20mg/L)，進行抗性篩選。實施例3、轉基因毛狀根系的分子檢測隨機選取實施例2中經過抗性篩選后得到的7個甘草發根株系，用CTAB法提取總DNA(參照《分子克隆實驗指南》)；使用Roche公司的DIGDNALabelingandDetectionkit,以地高辛標記的CHS7G基因片段作探針，進行Southern雜交。全部操作過程嚴格按照該試劑盒的說明進行。雜交結果如圖2所示。圖2中，M為DNA分子量標準(XDNA/歷wdin);十為陽性對照重組質粒pXQ-35s-CHS7G;fkl為陰性對照非轉化外源基因的野生型毛狀根；其它為抗性篩選后得到的7個甘草發根株系。雜交結果顯示所選的轉基因毛狀根根系中所有7個均為陽性的，且均為多拷貝插入。陽性對照的雜交信號最強，陰性非轉基因的野生型毛狀根沒有雜交的信號。實施例4、CHS7G在轉基因甘草毛狀根系中的表達模式將經過分子檢測為陽性的毛狀根準確稱量O.l克，并立即用液氮速凍，置于-80。C冰箱中用于總RNA的分離。總RNA的提取方法同實施例1。使用上海申能博采公司的反轉錄試劑盒，以(3-actin做為內參利用所選的毛狀根分析CHS7G基因在不同轉基因毛狀根系中的表達情況，結果如圖3所示。結果顯示所選的轉基因毛狀根系中，CHS7G基因表達較沒有轉化外源基因的野生型毛狀根的要強，而且表達增強的趨勢與總黃酮含量提高的趨勢基本一致。然而，89-1根系中CHS7G基因的表達較野生型(ck)的要低，推測為轉化的外源基因與內源基因產生了共抑制所致。實施例5、轉基因毛狀根系的總黃酮含量檢測1、甘草毛狀根中總黃酮的提取將經過分子檢測為陽性的毛根收集、晾干后6(TC烘烤過夜至恒重，研缽研磨破碎后過60目的篩子，稱重O.lg，用4ml的甲醇浸泡過夜后40Hz、30min超聲提取，離心10min后吸取上清；收集殘渣再用4ml甲醇重復提取合并續濾液，定容至10ml。2、采用紫外分光光度計進行黃酮含量的測定以柚皮苷為標準品，配制成1.0mg/ml的標準品溶液。精密吸取4pl、8pl、12^1、16pl、20^1、24pl標準品溶液分別加入10%的KOH(W/V，g/ml)溶液500^1，然后以甲醇補充總體積至2ml，以分光光度計在420.5nm處測量其吸收值(ABS)。以濃度為橫座標，吸收值為縱座標得出標準曲線和對應的回歸方程。紫外分光光度計檢測所選毛狀根的總黃酮含量，結果如表l所示。其中，Fxl為非轉化外源基因的野生型毛狀根系；生藥根為藥店購買的甘草飲片；其余的為經過分子檢測為陽性的毛狀根系。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表l可以看出，轉基因的毛狀根系中總黃酮含量較野生型的要高，而且提高的趨勢與RT-PCR檢測的基因表達情況基本一致。盡管為說明目的公開了本發明的具體實施例和附圖，其目的在于幫助理解本發明的內容并據以實施，但是本領域的技術人員可以理解在不脫離本發明及所附的權利要求的精神和范圍內，各種替換、變化和修改都是可能的。因此，本發明不應局限于最佳實施例和附圖所公開的內容。序列表(SEQUENCELISTING)<110〉北京未名凱拓農業生物技術有限公司<120>—種甘草查爾酮合成酶及其編碼基因與應用<130>JSP080024<160>2<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>389<212>PRT<213>烏拉爾甘草(G7>^y/r/^z"wra/em7JW^//)<400>1MetValSerValAlaGlulieArgLysAlaAsn工leLeuAla工leGlyThr20GinSerLysThr50lieLysProAsnThr35GluLyslieMetValValAla工lePheCys130ThrLys145GinGinTyi:LeuArgCysVal1〇〇LysGlu115ThrThrProAspPheLysTyrAla85GluTrpSerGluMet70TyrLeuLeuGlyGlyCysSer165Lys55TyrGlyLeu150AlaTyr40PheAla25PheGinAla10Asn二ysArgMetAlaProValProArgGlyGin135ArgPro120AspLeu105LysSer9〇GlySerMetProGinArgAlaGluProProAsnLeuThrGluProTyrValGlyGlyThrVal170工leMetGlu75Leu二ysLysGlyLys155LeuThrAsn45CysAsp60lieLeuAspAlaGluAlalieThr125AlaAsp140ArgTyrCys30SerLysLysArgAla110HisGly15ValArgLeuAlaLys175ProAspGluHisSerMetGluGin95ValAsn80AspLysLeulieTyrGinLeuMetMetTyr160AspProLeu290GlyGly305ProGluMetSerSerAlaLeuValValCysSerGlu190AspThrHisLeuAspSer205AlaAlaAlaVallieVal220Pro工lePheGluLeuVal235240GluGlyAla工leAspGly255LeuLeuLysAspValPro270LeuThrGluAlaPheGin285PheTrplieAlaHisPro300GinLysLeuAla!LeuLys315320LysMetLysAlaThrArgAspValLeuSerAspTyrGlyAsn325330335SerAlaCysValLeuPhe工leLeuAspGluMetArgLysLys340345350GinAspGlyLeuLysThrThrGlyGluGlyLeuGluTrpGly35536〇365PheGlyPheGlyProGlyLeuThrlieGluThrValValLeu375380LeuAlaGluAsnAsnLysGly180lieThrAlaValThrPheArg195LeuValGlyGinAlaLeuPhe210215GlySerAspProValProG丄u225230TrpThrAlaGinThr工leAla245HisLeuArgGluValGlyLeu260GlylieValSerLysAsnlie275Gly工leSerAspProAla工le!Leu310AlaTyr295AspThrAlaArgVal185GlyProThr200GlyAspGlylieGlu!LysProAspSer250ThrPheHis265AspLysAla280AsnSer工leGinValGluVa丄Leu370HisSerValAlalie385<210>2<211>1170<212>DNA<213>烏拉爾甘草(G7r///z"wra/ew^i^c/z)<400>2stggttsgcgtagctgssattcgcasagctgccattggtsctgcsastccsccaasttgttttaag3tC5Lcaatacagtgagcacaiagacccassgggcsg3aggccctgc33acatcttg60gttgatcaaagtacttatcctgatttttac120gagcttatsggeissMtttcsgcgc己tgtgt180g3C333tCt3tscct33cgg33gsgstttt240CCt33C3tttgcgcttst3tggc3ccttctttggstgctsggtggtcgts300gsggtgcctsgsctsgggssggs3gctgcggtcssggct3t3333g33tggggcc33ccs36033gtc333g3tt3CCC3Cttssttttttgcactactagcggtgtggscstgcctggcgct420gsttaccssctt3Ct333Ctcttgggtcttcgcccat3tg七3tgstgt3c徹c3gc33gggtgttctgcaggtggcscggtgcttcgcttggccassgscttggcsgsgsac540ctcgtgtgctsgttgtttgttctgs33ttsctgcagtcacstttcgtggc600cct3C3g3tsctc3cttgg3tsgccttgtggg3C33gc3tt3tttggsgstggsgcsgct660gcagtcattgttggttctgscccagtscctg333ttgsg33gcctatstttgsgttggtt720tggscggcactccagatagtgssggsgccsttgstggtc3ccttcgtgs3780gttgggctc3C3tttcatcttcttassgstgttcccgggat3gtctC3S3gsacattgat840333gcsctgsctgaggc3ttCC33CC3tt3ggcatatctg3tt3C33CtCastcttttgg9003ttgc3csccC3ggtgggcctgcaattcttgsccssgttgsgctttg333則tsgggstgtgctt3gtgsttgtcssgtgca1〇2〇tgtgttctsttcstcttggstgagatgagactcssgstgg1080actggcgssggsctcgsstggggtgtattattcggctttggscctggacttscc3tcg331140sctgttgttttgcatsgtgtggccatctgs1170權利要求1.如下蛋白質(i)或(ii)(i)具有序列表中SEQIDNO1的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一至十個氨基酸殘基且具有查爾酮合成酶活性的由(i)衍生的蛋白質。2.編碼權利要求l所述蛋白質的基因。3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:2的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNO:2限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有査爾酮合成酶活性的蛋白質的核苷酸序列。4.權利要求1所述蛋白質及其編碼基因在提高植物總黃酮含量中的應用。5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于將權利要求2或3所述的基因導入植物細胞、組織或器官，獲得總黃酮合成提高的植物細胞系、組織、器官或轉基因植物。6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述基因通過植物表達載體導入植物細胞、組織或器官，用于構建所述植物表達載體的出發載體是一種可用于根瘤農桿菌或發根農桿菌轉化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體，或者是可在原核生物中復制的載體。7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于用所述基因構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前加上一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子。8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于用所述基因構建植物表達載體時添加翻譯增強子和/或轉錄增強子。9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于在所述植物表達載體中加入選擇性標記基因，所述選擇性標記基因包括但不限于可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶的基因、發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物和抗化學試劑標記基因。10.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述植物為雪蓮、葛根、甘草或苜蓿。全文摘要本發明公開了一個來源于烏拉爾甘草的查爾酮合成酶及其編碼基因。實驗證明，本發明的甘草查爾酮合成酶基因轉化到甘草毛狀根中后，查爾酮合成酶基因表達增強，相應的甘草毛狀根中總黃酮含量較沒有轉化的毛狀根最高可以提高2.5倍左右。查耳酮合成酶是植物體內黃酮類化合物代謝途徑中的第一個關鍵酶，本發明提供的甘草查爾酮合成酶基因為基因工程改良植物體內黃酮類化合物的合成提供了一種有效的技術手段，具有廣泛的應用前景和極大的經濟價值，特別是可使甘草在醫藥、保健品、食品及化妝品領域得到更廣泛的應用。文檔編號C12N9/00GK101220353SQ200810057268公開日2008年7月16日申請日期2008年1月31日優先權日2008年1月31日發明者劉敬梅,驊周,勉夏,張海超,毅李申請人:北京未名凱拓農業生物技術有限公司