專利名稱：一種紅細胞血型的體外改造方法及其專用配套試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種紅細胞血型的體外改造方法及其專用配套試劑。
技術背景輸血安全和血液偏型是全世界輸血界面臨的兩大難題。長期以來，因血型鑒定 錯誤、識別錯誤等主客觀因素引起的輸血事故發生率居高不下，即使在科技發達的美國，錯誤輸血發生率達1例/1.2萬單位之多，其中，由ABO血型不合導致的錯 誤率為1例/ 3.3萬單位，死亡率約1例/ 80萬單位，是輸血事故死亡的首要原因， 比輸血傳播疾病(如HIV、 HBV等)發生率(l例/200萬單位)高得多。由于目 前紅細胞的保存期僅6周，在遇到長節假日、寒暑假等情況時采血量大大減少，很 容易出現某種ABO血型的紅細胞供應告急而其它ABO血型紅細胞過剩的偏型現 象。血液偏型不僅使急需用血的臨床患者無法及時得到寶貴的血液而危及生命安 全，還會由于血液在保質期內未能用于臨床而造成巨大的浪費，美國統計由此原因 造成的浪費達6%之多，這對本來就不充裕的血源來說無疑是雪上加霜。因此，如 何解決上述兩大難題已成為輸血醫學研究的重要課題。人類紅細胞血型系統至少有29種，以ABO和Rh血型系統對輸血安全最為重要。 O型紅細胞不含A或B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地輸給A、 B、 AB 或O型的受血者，因此又被稱為"通用型紅細胞"。應用通用型紅細胞可以極大的 降低因ABO血型不合所致輸血反應的可能性，提高輸血的安全性；能夠有效解決血 液偏型難題，減少血液的浪費；簡化血液采集、儲存和配型程序，提高血站和醫院 輸血科的工作效率，可降低輸血成本近9%，據報道美國每年可節約7億美元，保 守估計我國每年可節約3億元。美國紅十字會血液中心科學主管Garratty預計未 來幾年內有望將A、 B或AB型紅細胞轉變成O型，屆時只儲存和使用O型紅細胞， 這將是輸血醫學的一場革命。此外，在戰爭、恐怖襲擊、巨大災難和其它突發事件 中，及時安全的輸血是救治傷員的一個關鍵因素。應用通用型紅細胞時，無需檢查 受血者的ABO血型，使用簡便、迅速、安全，可增強應急輸血保障能力，提高傷員 的存活率。ABH血型抗原的本質為糖蛋白和糖脂，血型是由其末端糖鏈的種類及排列順序決定的。O型紅細胞僅表達H抗原；B型紅細胞含B抗原和H抗原，B抗原非還原端 比H抗原多一個a -1, 3半乳糖；A型紅細胞較為復雜，主要分為Al和A2兩種亞型。 在Al亞型紅細胞上含有A、 Al和H抗原，而A2亞型紅細胞上僅含有A抗原和H抗 原。A2亞型紅細胞表面的A抗原比H抗原多一個a-1,3-N-乙酰半乳糖胺，而Al 亞型紅細胞表面的A1抗原比A抗原多一個N-乙酰半乳糖胺a 1—3(巖藻糖a 1—2) 半乳糖的三糖結構，我國A1亞型占A型99X以上；AB型紅細胞則含有A、 B兩種 抗原。糖苷水解酶酶解法是目前實現通用型紅細胞最有前途的方法。糖苷水解酶存在 廣泛，種類豐富。國際生物化學和分子生物學聯合會根據作用機制和酶切底物分類， 己正式命名了 150多類糖苷水解酶。這些糖苷水解酶部分來自高等動物、酵母、黑 曲霉等，這些酶都是溶酶體酶，最適pH在3.5 4.5之間，酶比活性一般不超過50 U/mg，反應需要高濃度的酶蛋白(〉3 mg/rnL)和低pH值，酶解不完全，不能滿足 血型改造要求。部分糖苷水解酶來源于產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、肺炎球菌、雙歧 桿菌、空腸彎曲桿菌、黃桿菌、糞球菌等微生物中。a-N-乙酰半乳糖胺酶(ct -N-acetylgalactosaminidase)可分別將A抗原、Al抗原非還原端的N-乙酰半乳 糖胺酶切，生成O型紅細胞表面的H抗原。 發明內容本發明的目的是提供一種紅細胞血型的體外改造方法。本發明所提供的紅細胞血型的體外改造方法，是用a -N-乙酰半乳糖胺酶處理 離體A型或AB型紅細胞，使A型紅細胞改造為O型紅細胞，使AB型紅細胞改造為 B型紅細胞；所述a-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b) 將序列表中序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白質；所述用a -N-乙酰半乳糖胺酶處理離體A型或AB型紅細胞的方法為將A型紅 細胞和AB型紅細胞中的任一種紅細胞和所述a -N-乙酰半乳糖胺酶加入緩沖溶液 中，使所述a-N-乙酰半乳糖胺酶的終濃度為5 20U/ml、所述紅細胞的壓積為40 % 20%;在20。C 26。C,反應30 120 min， A型紅細胞改造為0型紅細胞，AB 型紅細胞改造為B型紅細胞；所述緩沖溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液200 400mM甘氨酸，0 10 mM NaCl;所述緩沖溶液的pH值為6. 6 7. 2。所述a -N-乙酰半乳糖胺酶(a -N-acetylgalactosaminidase)，名稱為a NAGA， 來源于腦膜膿毒性金黃桿菌(C力JTseofecferj'咖/z e/w'y^ose; "c咖)ZYP01 CGMCC No.2198。腦膜膿毒性金黃桿菌(C7zo^eo6acfen.ww mem."gayep"cwm) ZYP01 CGMCC No.2198已于2007年10月17日保藏于位于中國北京市朝陽區大屯路的中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。其中，序列表中的序列3由427個氨基酸殘基組成。為了使(a)中的aNAGA便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基 酸序列組成的蛋白質的N端或C端連接上如表l所示的標簽。表1.標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6 (通常為5個)RRRRRPoly-His2-10 (通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc一myc10EQKLISEEDL上述(b)中的aNAGA可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表 達得到。上述(b)中的aNAGA的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID Nq: l的自 5'末端第52至1332位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子， 和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示 的標簽的編碼序列得到。為了便于蛋白的可溶表達，還可在所述aNAGA的氨基末端添加上信號肽序 列。如添加由序列表中2的自氨基末端第1至17位氨基酸殘基組成的多肽，得到 由序列表中2所示的氨基酸序列組成的蛋白。序列表中的序列2由444個氨基酸殘基組成。自氨基末端(N端)第1-17位氨 基酸殘基為信號肽(signal p印tide)序列。上述a -N-乙酰半乳糖胺酶(a -N-acetylgalactosaminidase)可按照下述方 法表達得到將含有上述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase) 編碼基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)。所述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的編碼基因，具體 可為如下l)或2)或3)的基因1) 其編碼序列是序列表中的序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸 所示的DNA分子；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子；3) 在嚴格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述a-N-乙酰半乳 糖胺酶(a -N-acetylgalactosaminidase)的DNA分子。上述嚴格條件可為在O. 1XSSPE (或0. 1XSSC)， 0.1% SDS的溶液中，在65 "C下與NC膜或PVDF膜雜交并洗滌。序列表中的序列1由1335個脫氧核糖核苷酸組成，自5，末端的第52至1332 位核苷酸為序列3的aNAGA的編碼序列，自5'末端的第1-51位核苷酸為信號肽 的編碼序列。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優 選為大腸桿菌。所述大腸桿菌具體可為BL21(DE3)、 E. coliJM109， E. coli HB101或E. coli T叩IO等。當所述宿主為大腸桿菌時，用于構建所述重組表達載體的出發載體可為現有的 在上述大腸桿菌中表達外源基因的表達載體。所述重組表達載體具體可為將核苷酸序列是序列1的自5'末端的第52至1332 位核苷酸插入pET-22b ( + )的多克隆位點得到的重組表達載體pET-22b-aNAGA。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。培養含有所述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)編碼 基因的宿主細胞的培養基和培養條件，均可為培養出發!k主的培養基和培養條件。上述方法適合于離體Al型或A2型紅細胞向0型紅細胞的改造。為了對紅細胞改造效果進行鑒定，所述方法還包括用抗A抗原抗體、抗A1抗 原抗體和抗H抗原抗體鑒定改造得到的0型紅細胞或B型紅細胞的步驟。所述方法還可包括用生理鹽水和200 400 raM甘氨酸溶液清洗待測紅細胞的步驟。本發明還提供了一種體外改造紅細胞血型的配套試劑，包括a-N-乙酰半乳糖 胺酶和緩沖溶液；所述a-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b) 將序列表中序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白質；所述緩沖溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液200 400mM甘氨酸，0 10 mM NaCl;所述緩沖溶液的pH值為6. 6 7. 2。其中，所述配套試劑還包括下述l)和/或2)的物質1) 用于清洗待測紅細胞的生理鹽水和200 400 raM甘氨酸溶液；2) 用于檢測紅細胞血型的抗A抗原抗體、抗A1抗原抗體和抗H抗原抗體，所 述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。實驗證明，腦膜膿毒性金黃桿菌來源的ct-N-乙酰半乳糖胺酶能夠在中性pH、 室溫下高效、完全酶解人紅細胞表面的A抗原和A1抗原，使之改造為H抗原，說 明a NAGA將Al亞型RBC表面的A抗原和Al抗原最外側的a 1,3GalNAc糖苷鍵 斷裂，將a-N-乙酰半乳糖胺降解掉，使A1和A抗原均轉化為H抗原。本發明的 方法酶用量低，用血型定型試劑、人源O型血清和流式細胞儀檢測血型改造的結果 證明紅細胞血型由A型變為O型。本方法可用于腦膜膿毒性金黃桿菌來源的ci-N-乙酰半乳糖胺酶對全單位紅細胞A型到O型的改造，制備通用型紅細胞。該方法具 有重要的臨床意義和廣闊的市場前景，還可成為糖生物學和酶學研究的一個工具。
圖1為a NAGA的全長基因和基因片段(序列1的自5'末端第52-1332位脫 氧核糖核苷酸)的PCR產物電泳圖譜M: 500 bp DNA Marker, 1: 。NAGA的全長基因，2: aNAGA基因片段(序 列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸)圖2為pMD-18T- a NAGA和pET-22b- a NAGA的PCR鑒定圖譜。M: 500 bp DNA Marker; 1:質粒pMD-18T- a NAGA的PCR結果；2:質粒pET-22b-aNAGA的PCR結果。圖3為SDS-PAGE電泳圖M:蛋白質分子量標準；1: pET-22b-a NAGA/大腸桿菌BL21 (DE3)經0. 4mM IPTG 誘導后的總蛋白；2: pET-22b-aNAGA/大腸桿菌BL21 (DE3)未加IPTG誘導的總蛋 白；3: PET-22b-a NAGA/大腸桿菌BL21 (DE3)經0.4mM IPTG誘導后的細菌上清蛋白經Ni2+鰲合親合層析柱純化所得的蛋白；4:將Ni2+鰲合親合層析柱純化的蛋白 再用陰離子交換層析柱Hitrap Q FF純化所得的蛋白。 圖4為緩沖溶液對酶解效果的影響。縱坐標l-ll分別表示生理鹽水、PBS、 50 mM磷酸鈉緩沖液、ACD-A紅細胞 保養液、ACD-B紅細胞保養液、CPD紅細胞保養液、CPDA-1紅細胞保養液、緩沖液 1 (200raM甘氨酸，0 raM NaCl ; pH 6. 8)、緩沖液2 (250 mM甘氨酸，2 mM NaCl ; pH 6.8)、緩沖液3 (300 mM甘氨酸，5 mM NaCl ; pH 6.8)、緩沖液4 (400 mM甘 氨酸，lOmM NaCl ; pH 6. 8)。圖5為溫度和反應時間對酶解效果的影響。圖6為pH值對酶解效果的影響。圖7為紅細胞壓積對酶解效果的影響。圖8為酶量和反應時間對酶解效果的影響。圖9為血型定型試劑檢測酶解紅細胞的結果。A:肉眼法觀測；B:顯微鏡下觀測。a,—a4:酶解前；a5-a8:酶解后。ai、 a5:抗A單克隆抗體檢測結果；a2、 a6:抗Al單克隆抗體檢測結果； a3、 a7:抗H單克隆抗體檢測結果；a4、 a8:抗A單克隆抗體檢測結果。 圖10為血清法檢測酶解紅細胞血型的結果。 A:酶解前；B:酶解后。圖11為流式細胞儀檢測酶解紅細胞血型的結果。A: O型紅細胞A抗原水平；B:酶解前A型紅細胞A抗原水平；C:酶解后A 型紅細胞A抗原水平；D: O型紅細胞H抗原水平；E:酶解前A型紅細胞H抗原水 平；F:酶解后A型紅細胞H抗原水平。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人所編《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照 制造廠商所建議的條件。實施例1、 a-N-乙酰半乳糖胺酶aNAGA編碼基因的克隆與表達1、 a -N-乙酰半乳糖胺酶a NAGA編碼基因的克隆將腦膜膿毒性金黃桿菌(C力iTseoZ acfarz.鵬歷e/ i/7gose;7"c鵬)ZYP01 CGMCC No. 2198菌株接種到培養基(5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/L NaCl， 3g/L K2HP04，其余為水。pH7， 2)中，200rpm， 30。C培養過夜。按照Promega基因組DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，利用上游引物(序 列為5' -ATGGGCGCCTTAATTCCC-3，)和下游引物(序列為: 5， -TTAGTAGTCGTCATTTATTGC-3，)進行PCR。
PCR條件為先95。C預變性5 min; 然后95。C變性30s， 5(TC退火30s， 72。C延伸90s,共30個循環；最后72。C延伸 10min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1335 bp的條帶(圖 l中，泳道l)。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收該片段。將該回收片段與pMD18-T 質粒(Takara公司)連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，根據pMD18-T 載體上的羧卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該 重組質粒載體上的T7和T7終止子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果 表明擴增到的基因由1335個脫氧核糖核苷酸組成(序列表中的序列1)，其開放閱 讀框(ORF)為序列表中序列1的自5'末端第1至1335位脫氧核糖核苷酸，編碼氨 基酸序列是序列表中序列2的蛋白質，自序列表中序列1的5'末端的第1-51位核 苷酸為信號肽的編碼序列。序列表中序列1的自5'末端第52至1335位脫氧核糖 核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白質。將含有序列表中序列1的自5'末端第1-1335位脫氧核糖核苷酸的a NAGA 基因的重組載體命名為PTE- a NAGA。2、 含有a NAGA編碼基因的表達載體pET-22b- a NAGA的構建以pTE-aNAGA為模板，用上游引物(序列為 5' -ATCATATGCCAAAAAAAGTAAGAATTGC-3，(具有NdeI酶切位點))，和下游引物 (序列為5， -TGCTCGAGGTAGTCGTCATTTATTGC-3，(具有Xho I酶切位點)PCR擴 增核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸的a NAGA基因片段。PCR條件為先95。C預變性5 min;然后95。C變性30s, 43。C退 火30s， 72-C延伸90s,共30個循環；最后72。C延伸10 min。對PCR產物進行瓊 脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1300 bp的條帶(圖1中，泳道2)。按照TAKARA公司的操作指南，將PCR產物與pMD-18T載體連接，轉化大腸桿 菌DH5a。挑選陽性克隆，提取質粒，用酶切法、PCR法和測序鑒定構建的質粒， 將含有核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸的a NAGA基因片段的重組載體命名為pMD-18T- a NAGA。其中，pMD-18T- a NAGA 的PCR鑒定結果如圖2中泳道1所示，得到約為1300bp的條帶。按照TAKARA公司的操作指南，用Nde I和Xho I雙酶切質粒pMD_18T- a NAGA， 得到約1300 bp的片段；用Nde I和Xho I雙酶切質粒pET-22b ( + ) (Novagen公 司)，得到長為5364bp的線性質粒，分別切下包含1300 bp和5364bp DNA的瓊脂 糖膠，回收DNA，連接所得產物，轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，提取質粒， 用酶切法、PCR法和測序鑒定構建的質粒，將含有核苷酸序列是序列表中序列1的 自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸的ciNAGA基因片段的重組載體命名為 pET-22b- a NAGA。其中，pET-22b- a NAGA的PCR鑒定結果如圖2中泳道2所示， 得到約為1300 bp的條帶。3、 aNAGA的表達和純化將質粒pET-22b-aNAGA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過酶切法、PCR法和 測序鑒定，篩選得到轉入pET-22b-aNAGA的陽性細胞，所得的陽性細胞即為可以 表達目的蛋白的遺傳工程宿主細胞。將該陽性菌稱為pET-22b-a NAGA/大腸桿菌 BL21 (DE3)。將pET-22b- a NAGA/大腸桿菌BL21 (DE3)劃線接種于LB固體培養基(含氨芐 青霉素100嗎/ml)培養過夜，挑取單個菌落接種于3mlLB液體培養基(含氨芐青霉 素100嗎/ml)培養過夜，以1 : 100的體積比稀釋過夜培養菌液于LB液體培養基(含 氨芐青霉素100ug/ml)中，于37"C 250轉/分鐘培養至菌液0D600達到0.8時，加 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.4腿ol/L，于30。C誘導表達12h。 4。C離心收 集菌體。每克濕菌體加入10ml結合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，500raM NaCl， 20raM 咪唑，pH 7.4)，加入0. 2mg/ml溶菌酶，20ug/ml DNAse， lmM MgCl2， lmM PMSF， 室溫下攪動30min，反復凍融5次。10000rpm離心20min，取上清液。將上清液上 樣至已經平衡的N:^+鰲合親合層析柱(Histrap FF crude層析柱，lmL， Pharmacia 公司，11一0004—58)，用IO倍柱體積的結合緩沖液洗滌，用洗脫緩沖液(20raM 磷酸鈉緩沖液，0.5MNaCl， 500 mM咪唑，pH7.4)洗脫目的蛋白。將洗脫蛋白上樣 至陰離子交換層析柱Hitrap Q FF (Hitrap Q FF層析柱，5mL， Pharmacia公司， 17-5156-01)上，洗滌緩沖液為20mMTris緩沖液，pH 8. 2;洗脫緩沖液為20mMTris 緩沖液，1MNaCl， pH8.2。洗脫產物進行SDS-PAGE電泳，電泳結果如圖3所示，表明得到50 kDa的aNAGA。洗脫下的目的蛋白用酶解緩沖液(200mM甘氨酸，3mM NaCl， p服.8)用超濾管超濾(AmiconUltra—15離心管，15ml，截留分子量50 kDa， 貨號UFC900508， Millipore公司)，用HPLC檢測酶溶液純度為98%，使用BCA 蛋白定量試劑盒(pierce公司，貨號23225)確定濃度為800嗎/ml。將經該超濾純化得到的蛋白溶液按照如下方法測定酶活在25'C， pH6.8時， 每分鐘酶解1 pmol對硝基苯酚-N-乙酰-a -D-半乳糖胺(Sigraa，貨號N0257)生成1 umol對硝基苯酚的酶量定義為1 U。結果表明，該超濾純化得到的蛋白溶液的比 活力為3.36 U/嗎。實施例2、 a -N-乙酰半乳糖胺酶最佳酶解條件的確定1.適宜緩沖溶液的確定取IO份新鮮的Al型紅細胞(儲血號分別為0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陜 西省血液中心)，用0.9%氯化鈉洗滌1次，每份A1型紅細胞分別用下述ll種中的 任一種緩沖溶液洗滌2次并在下述任一種緩沖溶液中進行酶解反應，其中酶解用緩 沖液與洗滌用緩沖溶液相同生理鹽水、PBS、 50raM磷酸鈉緩沖液、ACD-A紅細胞 保養液、ACD-B紅細胞保養液、CPD紅細胞保養液、CPDA-1紅細胞保養液、緩沖液 1 (200 mM甘氨酸，OmM NaCl ; pH 6.8)、緩沖液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8)、緩沖液3 (300 mM甘氨酸，5raM NaCl ; pH 6.8)、緩沖液4 (400 mM甘 氨酸，lOraM NaCl ; pH 6.8)。酶解反應體系共1 mL:紅細胞壓積40%，實施例1 的a -N-乙酰半乳糖胺酶的終濃度為10 U/ml反應體系，溶劑為上述任一種緩沖溶 液。在25'C下進行酶解，期間每隔15 min搖勻1次，酶解1 h后用0. 9%氯化鈉 洗滌2次，用抗A血型定型試劑(長春博德生物技術公司，目錄號sl0960081，批號 20060809)檢測不同緩沖溶液的酶解效果。結果表明在緩沖液l、緩沖液2、緩沖液 3和緩沖液4這4組緩沖溶液中酶解的10份Al型紅細胞均和抗A抗體混合后不凝 集，而在生理鹽水、PBS、 50慮磷酸鈉緩沖液、ACD-A紅細胞保養液、ACD-B紅細 胞保養液、CPD紅細胞保養液和CPDA-1紅細胞保養液這7組緩沖溶液中酶解的10 份A1型紅細胞均和抗A抗體混合后強凝集(結果見圖4)。圖4中的凝集程度為10 份A1型紅細胞的平均凝集程度。其判別標準參考李勇、馬學嚴主編《實用血液免 疫學血型理論和實驗技術》(2006年10月科學出版社出版)第19章"紅細胞輸血 血型相容性試驗"(第345頁)。4:紅細胞凝集成一個結實的凝集塊，無游離紅細胞，背景清晰透明。 3:紅細胞凝集成幾個大凝塊，無游離紅細胞，背景尚清晰。 2:紅細胞大凝塊處于小凝塊之間，無游離紅細胞。 1:肉眼可見許多小凝塊，以游離紅細胞為背景。0.5:細胞懸液中有幾個肉眼可見的弱凝集顆粒，顯微鏡下見無數凝集。 鏡下可見肉眼觀察陰性，鏡下可見多數視野中有6 8個細胞凝集 可疑鏡下觀察，偶有凝集。 0:紅細胞全部游離，無細胞凝集。2. 適宜溫度和時間的確定取10份新鮮的Al型紅細胞(儲血號分別為0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陜 西省血液中心)，用0.9%氯化鈉洗漆1次，用緩沖液2 (250mM甘氨酸，2mMNaCl ; pH 6.8)洗滌2次后在緩沖液2 (250 raM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6. 8)中進行酶解 反應，酶解反應體系共lmL:紅細胞壓積40%，實施例l的a-N-乙酰半乳糖胺酶 的終濃度為IO U/ml反應體系，溶劑為緩沖液2。分別在4。C、 15°C、 25匸和37°C 酶解，期間每隔15 min搖勻l次。酶解適當時間后取樣用0.9%氯化鈉洗滌2次， 用抗A血型定型試劑(長春博德生物技術公司，目錄號s10960081，批號20060809) 檢測不同溫度下的酶解效果。檢測結果顯示，25'C和37'C組酶解10 min時10份 Al型紅細胞均和抗A抗體混合后不凝集，15。C組紅細胞酶解60 rain時10份Al型 紅細胞均和抗A抗體混合后才不凝集，4"C組紅細胞酶解120 min時10份Al型紅 細胞均和抗A抗體混合后才不凝集。說明25。C和37t:酶解效果好。室溫條件(20 26'C)既能有效酶解，又具有對實驗環境要求低的優點，是酶解的理想溫度(圖5)。 圖5中縱坐標的0-4表示凝集程度，其判別標準同步驟1。圖5中的凝集程度為10 份A1型紅細胞的平均凝集程度。3. 適宜pH值的確定取10份新鮮的Al型紅細胞(儲血號分別為0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陜 西省血液中心)，分別用0.9%氯化鈉洗滌1次，再分別用下述七種緩沖溶液中的任 一種緩沖溶液洗滌2次并在下述任一種緩沖溶液中進行酶解反應，其中酶解用緩沖 液與洗滌用緩沖溶液相同緩沖液2-l (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6. 0)，緩沖液2-2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6. 3)，緩沖液2-3 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.6)，緩沖液2-4 (250 mM甘氨酸，2raM NaCl ; pH 6.9)，緩沖液2-5 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 7.2)，緩沖液2-6 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH7.5)，緩沖液2-7 (250mM廿氨酸，2mMNaCl ; pH 7. 8)。酶解反應體系共1 mL: 紅細胞壓積40%，實施例1的a -N-乙酰半乳糖胺酶的終濃度為10 U/ml反應體系， 溶劑為上述任一種緩沖溶液。在25。C酶解10 min后取樣，用0. 9%氯化鈉洗滌2次， 用抗A血型定型試劑(長春博德生物技術公司，目錄號sl0960081，批號20060809) 檢測不同pH下的酶解效果。檢測結果顯示，p朋.6、 pH 6. 9和pH7. 2組酶解的10 份A1型紅細胞均和抗A抗體混合后不凝集，而pH 6.0、 6.3、 7.5、 7. 8組酶解的 IO份AI型紅細胞均和抗A抗體混合后弱凝集，凝集程度均為0.5。說明pH7.0左 右(pH 6.6 7.2)是酶解的最適pH(圖6)。圖6中縱坐標的0-4表示凝集程度，其 判別標準同步驟1。圖6中的凝集程度為IO份AI型紅細胞的平均凝集程度。4. 適宜的紅細胞壓積取10份新鮮的Al型紅細胞(儲血號分別為0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陜 西省血液中心)，分別用0. 9%氯化鈉洗滌1次，再分別用緩沖液2 (250 mM甘氨酸， 2raM NaCl ; pH 6. 8)洗滌2次后在緩沖液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8) 中進行酶解反應。酶解反應體系共l mL:紅細胞壓積分別為10。％、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和90%，實施例1的a -N-乙酰半乳糖胺酶的終濃 度為IO U/ml反應體系，溶劑為緩沖液2。在25。C酶解1 h后取樣用0.9X氯化鈉 洗滌2次，用抗A血型定型試劑(長春博德生物技術公司，目錄號sl0960081，批號 20060809)檢測不同紅細胞壓積下的酶解效果。檢測結果顯示，壓積等于或低于40 %組的10份Al型紅細胞均和抗A抗體混合后不凝集，而壓積等于或大于50%組的 IO份AI型紅細胞均和抗A抗體混合后凝集。20% 40%壓積時既能夠使紅細胞有 效酶解，又有利于節約試劑和簡化操作，是酶解的最佳紅細胞壓積(圖7)。圖7 中縱坐標的0-4表示凝集程度，其判別標準同步驟l。圖7中的凝集程度為10份 Al型紅細胞的平均凝集程度。5. 適宜酶量和反應時間的確定取IO份新鮮的Al型紅細胞(儲血號分別為0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陜西省血液中心)，用0. 9%氯化鈉洗滌1次，再分別用緩沖液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8)洗滌2次后在緩沖液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8)中進 行酶解反應。酶解反應體系共lmL:紅細胞壓積40%，實施例l的a-N-乙酰半乳 糖胺酶的終濃度分別為5U/ml、 10U/ml、 20 U/ml反應體系，溶劑為緩沖液2。在 25'C酶解適當時間后取樣，用0.9%氯化鈉洗滌2次，用抗A血型定型試劑(長春博 德生物技術公司，目錄號sl0960081，批號20060809)檢測不同酶量和不同時間下 的酶解效果。檢測結果顯示，5 U/ml、 10 U/ml、 20 U/ml組各酶解5 min時10份 Al型紅細胞均和抗A抗體混合后凝集程度依次為1、 0.5、 0.5;各組酶解IO min 后10份Al型紅細胞和抗A抗體混合后凝集程度依次為0. 5、 0、 0;各組酶解30 min 后10份Al型紅細胞和抗A抗體混合后各組均不凝集(圖8)。說明5 U/ml、 10 U/ml、 20 U/ml等組酶解30 min可使A型紅細胞呈現0型紅細胞的免疫學特征，為了更加 充分的酶解可能剩余的痕量A抗原，同時不影響紅細胞的功能，也可以將酶解時間 延長到120 min。圖8中縱坐標的0-4表示凝集程度，其判別標準同步驟1。圖8 中的凝集程度為IO份AI型紅細胞的平均凝集程度。實施例3、用a-N-乙酰半乳糖胺酶將A型紅細胞改造為O型紅細胞以下實驗操作除特殊說明外，均在室溫(25°C)進行。一、酶解1. 取l個單位(100ml)Al型濃縮紅細胞(儲血號0768424X，陜西省血液中心)， 加入150 ml生理鹽水，輕輕顛倒混勻，2000轉/分離心8 min，棄盡上清；2. 加入150ml 250 mM甘氨酸(pH 6.8)溶液，輕輕顛倒混勻，2000轉/分離心 8 min，棄盡上清；3. 重復步驟2—次；4. 加入150 ml 250 raM甘氨酸(pH 6.8)溶液，總體積約為250 mL，輕輕顛倒 混勻，再加入1. 86 ml實施例1中濃度為2688 U/ml的a -N-乙酰半乳糖胺酶溶液， 輕輕顛倒混勻，使紅細胞壓積為40%左右，a -N-乙酰半乳糖胺酶的終濃度約為20 U/ml。室溫酶解lh，期間每隔15 min混勻一次；5. 2000轉/分離心8 min，棄盡上清；6. 加入150ml生理鹽水，輕輕顛倒混勻，2000轉/分離心8 min，棄盡上清；7. 重復步驟6三次；8. 加入25mlMAP紅細胞保養液，混勻后4"C放置備用，得到酶解后的紅細胞。二、酶解后的全單位濃縮紅細胞血型鑒定1. 用血型定型試劑檢測紅細胞血型取步驟一中酶解前的新鮮Al型紅細胞(儲血號0768424X，陜西省血液中心)禾口 酶解后紅細胞各40 |il，分別加入等量(40 pl)的抗A單克隆抗體(長春博德生物技 術公司，目錄號s10960081，批號20060809)、抗Al單克隆抗體(加拿大DBL公司， 貨號0131—0015，批號AL18001A)和抗H單克隆抗體(加拿大DBL公司，貨號0141， 批號HL13701)，充分混勻，5min后肉眼觀察結果，結果表明未酶解的Al型紅細 胞和抗A抗體、抗A1抗體混勻后強凝集(凝集程度為4),未酶解的A1型紅細胞 和抗H抗體凝集程度為1;酶解后的紅細胞和抗A抗體、抗A1抗體混勻后不凝集， 和抗H抗體凝集增強(凝集程度為3)(圖9A)。取步驟一中酶解前的新鮮Al型紅細胞(儲血號0768424X，陜西省血液中心)和 酶解后紅細胞各20 ^，與20 pl抗A抗體混合，1500轉/分離心1 min后用手指將 細胞輕輕彈散，顯微鏡下觀察，結果表明酶解前的A1型紅細胞強凝集(凝集程度 為4)，酶解后的紅細胞不凝集，細胞形態正常(圖9B)。2. 用人源O型血清檢測紅細胞血型取步驟一中酶解前的新鮮A1型紅細胞(儲血號0768424X，陜西省血液中心)和 酶解后紅細胞各40 nl，分別加入5份等量(40 ul)的人源O型血清(儲血號 0778381X， 0783386X， 0778626X、 0767277X、 0778618X,陜西省血液中心)，參考 李勇、馬學嚴主編《實用血液免疫學血型理論和實驗技術》(2006年10月科學出 版社出版)第30章"血型血清學實驗方法"(第586 701頁)，采用鹽水法、聚 凝胺法和抗人球蛋白法進行主側配血試驗，顯微鏡下觀察，結果表明酶解前的A1 型紅細胞與上述5份人源0型血清凝集(凝集程度為l)(圖10A)，酶解后的紅細 胞與上述5份人源0型血清不凝集(凝集程度為O)，細胞形態正常(圖IOB)。3. 用流式細胞儀檢測紅細胞血型分別取步驟一中酶解前的新鮮Al型紅細胞(儲血號0768424X，陜西省血液中心) 和酶解后紅細胞200， 000個，用生理鹽水洗滌2次，加入1 : 50稀釋的FITC標記 的抗A單抗(美國BD公司，貨號550807)或抗H單抗(美國sigma，目錄號L9006) 100 UL， 25X:避光放置l h，生理鹽水洗滌4次，用流式細胞儀(Facscalibur，美國 BD)檢測，每次檢測分選10，000個細胞。結果表明，酶解后，A1型紅細胞A抗原基 本消失，H抗原增加，免疫學特征和O型紅細胞一致(圖11)。序列表<160>3<210〉1<211〉1335<212〉DNA〈213〉月畝膜胺毒'性金黃桿菌(CAr7se。Z 3cte_r_z'MZ7 /He"2y7gose/ ticw歷) <400〉1atgggcgccttaattccctcgagctcattattcaacattttcgattttaatccaaaaaaa60gta_ag3a_ttgcttttatagcagttggtttacgcggacagactcacgt3ga_3Mcatggcg120卿CgCg3tgacgt卿ggttgtggcttttgc鄉tccgg3tccgt3catggt鄉ccgt180gcgcaggaaatcctgaaaaag感ggc卿aaacctgct3aagtttttggaaacggaaat240tacgactacataaagataaaaatatcgatgctgtttttgtatcctctcca300tgggaatggcaccatgaacatggtgtagcagccatgaaagctggtaaaattgtcggaatg360geiggtttgtggtgctttaac肌tgg3tg2lgtgctgggattatgtaaaagtttccgagcag420acaggagttccgttaatggctttgg33犯tgtatgttacagacgcg3tattatggctgtc480cttaacatggtaagaaaagacatgttcggagaattaattcgcggaacgggaggctaccag540cacgatctcagaccagttcttttcaatagcggaatcaacggtaaaaacgg卿tggtgtt600gagtttggtgacaaagccttC3gtg犯gCga^3tggagei3ccaaccattataaaaacaga660aacgggg肌ctctaccctactcacggtttaggcccattacacacaatgatggatattaac720cgcggg肌cagattattaagattatcatcttttgcttcca肌gca卿ggtttacataaa780tatgtcgtgg3t犯gggCggggaaagccatccaaatgcaaaagtagaatggaaac肌gg3840gat3ttgt朋ccactcagatccagtgt犯cctattgtattaaccc3cgait■accagcctgcaaagaccatataacctgggattcaaagttcagggtactgaaggtctttgg960g33g3ttttggctgggg卿tgC3gC3C犯ggatttatttacttcgsg3a1020cattctcacagatgggatggttcsga^aa^tggatgaaagcccgatgtgg1080aacagaaagctgttggtgCElggtcatggcggaatggattacttccttgat1140aatacttttatcgagtgtatcaaacgaaatgaagcattcccgctggatgtttacgertctg1200gcgacgtggtattccattacacctcttagtgaa^gtct3ttgctgaaaacggtgccgtt1260caggaaerttcctgattctacaaacggtaaatggaaaactgctaaaaatacatttgcaata1320aatgacgact actaa 1335<210〉 2<211〉 444<212> PRT<213〉 腦膜膿毒性金黃桿菌(CAr7seo/ sct6Tii/邁/z e/7i77《ose/^'c鵬)<400> 2 Met Gly AlaLeu lie Pro Ser Ser Ser Leu Phe Asn lie Phe Asp Phe 5 10 15Asn Pro Lys Lys Val Arg lie Ala Phe lie Ala Val Gly Leu Arg Gly 20 25 30Gin Thr His Val Glu Asn Met Ala Arg Arg Asp Asp Val Glu Val Val3540 45Ala Phe Ala Asp Pro Asp Pro Tyr Met Val Gly Arg Ala Gin Glu lie5055 60Leu Lys Lys Asn Gly Arg Lys Pro Ala Lys Val Phe Gly Asn Gly Asn6570 75 80Tyr Asp Tyr Lys Asn Met Leu Lys Asp Lys Asn lie Asp Ala Val Phe 85 90 95Val Ser Ser Pro Trp Glu T卬His His Glu His Gly Val Ala Ala Met 100 105 110Lys Ala Gly Lys lie Val Gly Met Glu Val Cys Gly Ala Leu Thr Met115120 125Asp Glu Cys Trp Asp Tyr Val Lys Val Ser Glu Gin Thr Gly Val Pro130135140Leu Met Ala Leu Glu Asn Val Cys Tyr Arg Arg Asp lie Met Ala Val 145 150 155 160Leu Asn Met Val Arg Lys Asp Met Phe Gly Glu Leu lie Arg Gly Thr 165 170 175Gly Gly Tyr Gin His Asp Leu Arg Pro Val Leu Phe Asn Ser Gly lie 180 185 190Asn Gly Lys Asn Gly Asp Gly Val Glu Phe Gly Asp Lys Ala Phe Ser 195 200 205Glu Ala Lys Trp Arg Thr Asn His Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Glu Leu 210 215 220Tyr Pro Thr His Gly Leu Gly Pro Leu His Thr Met Met Asp lie Asn 225 230 235 240Arg Gly Asn Arg Leu Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ala Ser Lys Ala Arg 245 250 255Gly Leu His Lys Tyr Val Val Asp Lys Gly Gly Glu Ser His Pro Asn 260 265 270Ala Lys Val Glu Trp Lys Gin Gly Asp lie Val Thr Thr Gin lie Gin 275 280 285Cys Asn Asn Gly Glu Thr lie Val Leu Thr His Asp Thr Ser Leu Gin 290 295 300Arg Pro Tyr Asn Leu Gly Phe Lys Val Gin Gly Thr Glu Gly Leu Trp 305 310 315 320<formula>formula see original document page 20</formula>Thr His Val Glu Asn Met Ala Arg Arg Asp Asp Val Glu Val Val Ala 20 25 30Phe Ala Asp Pro Asp Pro Tyr Met Val Gly Arg Ala Gin Glu lie Leu 35 40 45Lys Lys Asn Gly Arg Lys Pro Ala Lys Val Phe Gly Asn Gly Asn Tyr 50 55 60Asp Tyr Lys Asn Met Leu Lys Asp Lys Asn lie Asp Ala Val Phe Val 65 70 75 80Ser Ser Pro Trp Glu Trp His His Glu His Gly Val Ala Ala Met Lys 85 90 95Ala Gly Lys lie Val Gly Met Glu Val Cys Gly Ala Leu Thr Met Asp 100 105 110Glu Cys Trp A印Tyr Val Lys Val Ser Glu Gin Thr Gly Val Pro Leu 115 120 125Met Ala Leu Glu Asn Val Cys Tyr Arg Arg Asp lie Met Ala Val Leu 130 135 140Asn Met Val Arg Lys Asp Met Phe Gly Glu Leu lie Arg Gly Thr Gly 145 150 155 160Gly Tyr Gin His Asp Leu Arg Pro Val Leu Phe Asn Ser Gly lie Asn 165 170 175Gly Lys Asn Gly Asp Gly Val Glu Phe Gly Asp Lys Ala Phe Ser Glu 180 185 190Ala Lys Trp Arg Thr Asn His Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Glu Leu Tyr195200205Pro Thr His Gly Leu Gly Pro Leu His Thr Met Met Asp lie Asn Arg 210 215 220Gly Asn Arg Leu Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ala Ser Lys Ala Arg Gly 225 230 235 240Leu His Lys Tyr Val Val Asp Lys Gly Gly Glu Ser His Pro Asn Ala 245 250 255Lys Val Glu Trp Lys Gin Gly Asp lie Val Thr Thr Gin lie Gin Cys 260 265 270Asn Asn Gly Glu Thr lie Val Leu Thr His Asp Thr Ser Leu Gin Arg 275 280 285Pro Tyr Asn Leu Gly Phe Lys Val Gin Gly Thr Glu Gly Leu Trp Glu 290 295 300Asp Phe Gly Trp Gly Asp Ala Ala Gin Gly Phe lie Tyr Phe Glu Lys 305 310 315 320lie Met Asn His Ser His Arg Trp Asp Gly Ser Glu Lys Trp Met Lys 325 330 335Glu Tyr Asp His Pro Met Trp Lys Lys His Glu Gin Lys Ala Val Gly 340 345 350Ala Gly His Gly Gly Met Asp Tyr Phe Leu Asp Asn Thr Phe lie Glu 355 360 365Cys lie Lys Arg Asn Glu Ala Phe Pro Leu Asp Val Tyr Asp Leu Ala 370 375 380Thr Trp Tyr Ser lie Thr Pro Leu Ser Glu Lys Ser lie Ala Glu Asn 385 390 395 400Gly Ala Val Gin Glu lie Pro Asp Ser Thr Asn Gly Lys Trp Lys Thr 405 410 415Ala Lys Asn Thr Phe Ala lie Asn Asp Asp Tyr 420 42權利要求
1、一種紅細胞血型的體外改造方法，是用α-N-乙酰半乳糖胺酶處理離體A型或AB型紅細胞，使A型紅細胞改造為O型紅細胞，使AB型紅細胞改造為B型紅細胞；所述α-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白質；所述用α-N-乙酰半乳糖胺酶處理離體A型或AB型紅細胞的方法為將A型紅細胞和AB型紅細胞中的任一種紅細胞和所述α-N-乙酰半乳糖胺酶加入緩沖溶液中，使所述α-N-乙酰半乳糖胺酶的終濃度為5～20U/ml、所述紅細胞的壓積為40％～20％；在20℃～26℃，反應30～120min，A型紅細胞改造為O型紅細胞，AB型紅細胞改造為B型紅細胞；所述緩沖溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液200～400mM甘氨酸，0～10mM NaCl；所述緩沖溶液的pH值為6.6～7.2。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的ct-N-乙酰半乳糖胺酶， 是由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述離體A型紅細胞為A1型或A2 型紅細胞。
4、 根據權利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述方法還包括用抗A抗 原抗體、抗Al抗原抗體和抗H抗原抗體鑒定改造得到的0型紅細胞或B型紅細胞的 步驟。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述抗體為多克隆抗體或單克隆 抗體°
6、 一種體外改造紅細胞血型的配套試劑，包括a -N-乙酰半乳糖胺酶和緩沖溶液; 所述a-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下U)或(b)的蛋白質(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b) 將序列表中序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白質；所述緩沖溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液200 400 mM甘氨酸，0 10 mM NaCl;所述緩沖溶液的pH值為6. 6 7. 2。
7、 根據權利要求6所述的配套試劑，其特征在于所述配套試劑中還包括生理鹽水和200 400 mM甘氨酸溶液。
8、 根據權利要求6或7所述的配套試劑，其特征在于所述配套試劑中還包括 抗A抗原抗體、抗A1抗原抗體和抗H抗原抗體。
9、 根據權利要求8所述的配套試劑，其特征在于所述抗體為多克隆抗體或單 克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種紅細胞血型的體外改造方法及其專用配套試劑。該紅細胞血型的體外改造方法是用α-N-乙酰半乳糖胺酶處理離體A型或AB型紅細胞，使A型紅細胞改造為O型紅細胞，使AB型紅細胞改造為B型紅細胞；用α-N-乙酰半乳糖胺酶處理離體A型或AB型紅細胞的方法為將A型紅細胞和AB型紅細胞中的任一種紅細胞和α-N-乙酰半乳糖胺酶加入緩沖溶液中，使α-N-乙酰半乳糖胺酶的終濃度為5～20U/ml、紅細胞的壓積為40％～20％；在20℃～26℃，反應30～120min，A型紅細胞改造為O型紅細胞，AB型紅細胞改造為B型紅細胞；緩沖溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液200～400mm甘氨酸，0～10mm NaCl；緩沖溶液的pH值為6.6～7.2。該方法可用于制備通用型紅細胞。
文檔編號C12N5/08GK101215549SQ20081005646
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月18日 優先權日2008年1月18日
發明者華 徐, 章揚培, 郁成雨 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所