專利名稱：含抗幽門螺桿菌及其毒素特異性免疫球蛋白的牛初乳蛋白的制作方法
技術領域：
本發明申請涉及含抗幽門螺桿菌及其毒素特異性免疫球蛋白的牛初 乳蛋白，屬于保健食品領域。
技術背景1982年，澳大利亞學者巴里.馬歇爾和羅賓.沃倫發現了幽門螺桿菌 (; ;;/on', HP )，并證明該細菌感染胃部會導致人的胃炎、胃 潰瘍和十二指腸潰瘍，從而贏得了 2005年諾貝爾醫學獎。目前，許多醫 院都可以通過內窺鏡檢查和呼氣試驗等診斷患者是否有幽門螺桿菌感染。 大量的臨床研究報告表明，該菌在人群中的感染率很高，普通人群40% 都有這種細菌感染。雖然細菌感染以后不一定都得胃炎或者是胃潰瘍，但 大量研究表明，有90%以上的十二指腸潰瘍和80%左右的胃潰瘍，都是 由幽門螺桿菌感染引起的。研究還發現，有幽門螺桿菌感染的人的胃癌的 發病率比沒有幽門螺桿菌感染的人高20倍。幽門螺桿菌主要存在于胃粘 膜的表層或淺層，并在那里繁殖。該菌可產生空泡毒素、熱休克蛋白、尿 素酶等蛋白質，這些蛋白質作為毒素可在螺桿菌繁殖的局部呈現致病作 用，促發胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍甚至胃癌的發生。可幸的是，在臨 床應用中，抗生素的治療方法已被證明能夠有效治療幽門螺桿菌感染引發 的胃炎、胃潰瘍和十二指導腸潰瘍等疾病。因馬歇爾和沃倫的發現，徹底 改變了世人對胃病的認識，大幅度提高了胃潰瘍等患者獲得徹底治愈的機 會。然而，如同其它細菌可產生抗藥性一樣，在病人常期月良用抗菌素后幽 門螺桿菌也能產生抗藥性，從而使一些抗生素在一部分病人喪失治療作 用。因此，為了更有效地治療和預防幽門螺桿菌感染，國內外已有不少實 驗室在研究針對該菌感染的疫苗。特別是研制含有不同毒素蛋白抗原的亞 單位疫苗，這些研究還仍在初步階段。發明內容及具體實施方式
本發明申請的主要發明內容是將培養純化的人幽門螺桿菌菌體及其毒素蛋白抗原與佐劑混合乳化 后免疫注射懷孕乳牛，可誘發針對幽門螺桿菌及其毒素的特異性免疫球蛋 白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，經過4企測并根據現有技術加工成各型 乳制品。由于本制品含"抗幽門螺桿菌及其毒素的牛初乳蛋白"，服用后可 以減弱幽門螺桿菌在胃粘膜表面的繁殖并中和其在粘膜表面產生的毒素。本發明申請中所稱毒素是幽門螺桿菌培養物離心后的上清液用能截 留分子量1萬左右超濾膜(如天津通海凈7jc設備廠的TH-30-l超濾膜)分級 過濾，除去小分子量的內毒素，保留并濃縮分子量大于1萬的各種毒素蛋 白質抗原的混合物，該混合物含有空泡毒素、熱休克蛋白、尿素酶等蛋白 質，并以純化的在大腸桿菌中表達的重組熱休克蛋白作為指示抗原進行檢 測。1菌種所選幽門螺桿菌只要經過鑒定、符合以下幽門螺桿菌生物學特性并具 有可誘導針對幽門螺桿菌的保護性免疫應答的VacA、 CagA、HspA、 HspB、 尿素酶和過氧化氫酶等多種抗原的菌林，如幽門螺桿菌悉尼(SS1)抹 (張延齡，張輝主編.疫苗學.科學出版社，2004年3月704 - 733 )、//./7_y/o" ATCC 43504抹(簡稱43504抹)、Hp Y06抹(中華微生物血和免疫學雜 志，2003,25 (10):301 - 302 )、 Hp 27抹(中華微生物血和免疫學雜 志,2007,27(4):362 )等均可用于本項發明。 (1)形態染色幽門螺桿菌染色體大小為1.60 1.72mb。 G+C含量為34.1%~37.5%。 它是有4 6根鞭毛的螺桿狀細菌、革蘭氏染色陰性、寬0.5~1.0pm、長 2.5~4.0|im、鞭毛長2 5pm。在胃粘膜中，幽門螺桿菌常常為彎曲、S形 或弧形，在胃粘液層中常呈魚群樣排列。經傳代培養后，細菌往往會失去 特有彎曲狀而成桿狀。在細菌菌體表面有一層多糖蛋白復合物。若周圍環 境不利細菌生長，如延長培養，暴露空氣中，遇抗生素或細菌在不利環境 中等，幽門螺桿菌會變成圓球體， 一般認為這是細菌一種靜止狀態。(2 )培養特性 幽門螺桿菌屬于微需氧菌。該菌營養要求高，常用氣體培養條件有 85%N2, 10%<:02和5%02; 5% 10%CO2;③厭氧袋；袋內置有化學藥品(枸櫞酸、碳酸氫鈉、硼氫鈉、氯化鈷)，加水激活發生反應，產生一定比例的H2和C02(袋內不力口釔)。固體培養基可選用腦心浸液、血瓊脂2號、Wilkins-Chalgren和哥 倫比亞等。以上述培養基為基礎，力。5%羊血、馬血或人血，有報告人 血優于其他種類血源。液體培養基可選用腦心浸液加0.4。/。酵母浸液和 10%馬血清。幽門螺桿菌培養時間較長需3 7天。細菌菌落l 2mm,開 始呈針尖樣透明，以后菌落稍大呈灰白色，無明顯溶血。在液體培養基中， 幽門螺桿菌生長呈細顆粒狀，2~3天后可見細菌明顯生長，易與其他細菌 區別。幽門螺桿菌最適培養溫度為35 37°C。 (3 )生化反應幽門螺桿菌產生大量尿素酶，能迅速分解尿素，這是幽門螺桿菌的一 個重要特性。尿毒酶、氧化酶和過氧化氫酶陽性，這三項試驗是鑒定幽門螺桿菌最 主要生化反應。其他生化反應包括不還原硝酸鹽，馬尿酸水解陰性，產 生堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、組氨酸氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、DNA 酶及一些脂酶(C4~C12)。2免疫懷孕乳牛用幽門螺桿菌菌體及其毒素疫苗的制備(1) 幽門螺桿菌懸液的制備將幽門螺桿菌菌種接種于幽門螺桿菌 用肉湯培養基，置于分別含85%氮氣、10%二氧化碳及5%氧氣的混合氣 體的厭氧培養箱中于35 -37。C培養3 4天后，于3000xg的離心力下將 培養液離心30min。將細菌沉淀物再懸浮于含0.5%福馬林的生理鹽水中 滅活細菌并洗去培養液中的內毒素，再按109菌落形成單位(cfli) /mL濃 度將其懸浮于pH7.2 PBS中重新制成懸液備用。(2) 幽門螺桿菌毒素蛋白的制備將以上1)項中幽門螺桿菌菌培 養液離心后的上清液用能截留分子量1萬左右超濾膜(如天津通海凈水設 備廠的TH-30-l超濾膜)分級過濾，除去小分子量的內毒素，保留并濃縮分子量大于1萬的毒素蛋白質，濃縮至總蛋白量10mg/mL,備用。(3 )幽門螺桿菌菌體和幽門螺桿菌毒素蛋白混合疫苗的制備將上 述1份幽門螺桿菌菌體懸液和1份按(2)制備的幽門螺桿菌多種毒素蛋白 的混合懸液(細菌培養上清液經超濾純化和濃縮產物)等量混合后，再分 別與等量的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合并用超聲波乳化后制備 成疫苗A和疫苗B用于免疫乳牛。 3懷孕乳牛的免疫注射程序第一次免疫懷孕后4 5月，分二點頸部皮下注射疫苗A,每點各 3mL。第二次免疫第一次免疫后一個月，分二頸部皮下注射疫苗B,每點 3mL。第三次免疫在分娩前一個月分2點皮下注射疫苗B，每點3mL。 4初乳的采集、加工 (1 )分娩后1 ~3天內的初乳作為有效初乳采集保存。每頭乳牛每次 采集初乳用前，均應洗凈乳頭和乳房，再用常規消毒劑消毒后人工或機械 采集初乳。每頭乳牛每次采集的初乳在檢測前于4。C保存。檢測后，將合 格的初乳盡快制作干份或冰凍保存。 (2)初乳的加工將抗幽門螺桿菌凝集抗體及抗毒素沉淀抗體效價合格的初乳樣品按 現有常規技術制成干粉制劑。初乳蛋白干粉分裝后用同位素CC)M照射滅 菌。(3 )對同位素CC^照射后的成品抽樣做滅菌檢驗及特異性抗體的再檢測。5初乳中特異性抗體的檢測(1)幽門螺桿菌基因工程毒素的制備，在大腸桿菌中表達幽門螺桿 菌的熱休克蛋白，從重組菌的培養物的裂解物中提取、純化和濃縮該熱休 克蛋白，達10 mg/mL (純度70% ~ 80% )(熱休克蛋白基因工程產物的 制備見李明峰等，幽門螺桿菌熱休克蛋白A基因的克隆、表達及免疫原 性研究，生物化學與生物物理學報，1999， 31 (3 ): 264-26)，作為檢測初乳中抗幽門螺桿菌毒素抗體的水平的指示性抗原(代表性抗原)。該重組 熱休克蛋白也僅用于4企測初乳中抗幽門螺桿菌毒素抗體水平診斷用指示 抗原。(2) 測定將每份初乳取3mL分置于二個eppedoff離心管中，在 15000r/min下離心20min,分離乳脂和乳清。取乳清分別檢測對幽門螺桿 菌的凝集抗體及對毒素蛋白的沉淀抗體。1) 菌體試管凝集反應每份樣品取10只凝集反應用玻璃試管 (100mmx8mm)，每管加入0.25mL幽門螺桿菌菌懸液(3xl()9菌/mL)。懸液用pH 7.2的PBS液配制。將待試乳清樣品分別用pH7.2 PBS做1:2 連續稀釋，分別在1 9號管中加入0.25mL不同稀釋度的待檢乳清，第 10管加入0.25mL PBS作為無自凝對照。每次檢測設一對照系列10只管，將4頭非免疫乳牛產后1 ~ 2日初乳 乳清混合后作為陰性對照。將凝集管在室溫(25。C左右)靜置60min，觀察試管管底細菌凝集狀 態，如果菌體呈傘狀均勻沉積于整個管底，且在輕輕搖震后呈絮狀物飄起， 判為凝集陽性。如體呈點狀集中沉積于管底中央，搖振后菌體均勻散開， 判為為陰性。如能產生50%菌體凝集的最大乳清稀釋度為凝集價。 在同一試驗中，將待試樣品的凝集價與非免疫乳牛乳清的凝集價比確 定為有效特異性凝集價。如^1:4為合格。2) 初乳中抗毒素瓊脂擴沉淀抗體效價的測定用pH 7.2的PBS配 制1%的瓊酯糖懸液，在100mm平皿中傾入20mL，在室溫下冷卻自然形 成凝膠后，置于4。C冰箱保存備用(可保存一周)。用標準的瓊脂擴散沉淀反應打孔器在凝膠上打孔。于中央孔中加入 lOOpL重組熱休克蛋白懸液(10mg/mL),在5個外周孔中分別加入用pH 7.2 PBS的作l:2連續稀釋的乳清樣品。另1個孔加入未經稀釋的未免疫乳牛 初乳乳清做為陰性對照。結果判定在陰性對照乳清不產生沉淀線的條件下，以針對重組熱休 克蛋白產生沉淀線的最大稀釋度作為乳清樣品對重組熱休克蛋白的瓊擴沉淀反應抗體效價。出現沉淀線時判為陽性。并以此代表初乳中對幽門螺 桿菌多種毒素特異性抗體的平均水平。3)經測定得知經用本發明所制備幽門螺桿菌菌體和幽門螺桿菌毒 素混合疫苗免疫后的乳牛所誘發的特異性免疫球蛋白可不斷分泌到乳牛 乳汁中，特別是分娩后5天內的初乳中，初乳中免疫球蛋白濃度可達3 % ~ 6%比常乳高30 ~ 60倍；1 ~ 3日內初乳乳清中對幽門螺桿菌抗體的試管 凝集效價分別為1:8， 1:4,1:2;對重組菌表達的熱休克蛋白(純度80%， 10mg/mL)抗原的瓊擴沉淀抗體效4介分別為1:4， 1:2， 1:1。
附圖1:初乳中抗毒素瓊脂擴沉淀抗體效價的測定結果。 圖1中中央孔為重組菌表達的幽門螺桿菌熱休克蛋白懸液 (10mg/mL,純度為80%)，外周孔除一個孔加入未免疫牛初乳乳清作為陰性對照外，其余5孔加入的是在分4免后1 ~ 3天內采分別5次采集的初乳乳清，均出現沉淀線。 本發明的優點吃入的牛初乳中的針對幽門螺桿菌及其毒素的特異性免疫球蛋白可 直接作用于在胃粘膜表面的幽門螺桿菌特別是其毒素，以此減弱該菌的繁 殖力從而強化抗菌素的抗菌效果,特別是可直接中和胃翻膜表面由該菌產 生的毒素，減弱其致病作用。實施例1將幽門螺桿菌SS1林菌種接種于幽門螺桿菌用肉湯培養基，置于分 別含85%氮氣、10%二氧化碳及5%氧氣的混合氣體的厭氧培養箱中于 35 -37。C培養3 4天后，于3000xg的離心力下將培養液離心30min。將 細菌沉淀物再懸浮于含0.5%福馬林的生理鹽水中滅活細菌并洗去培養液 中的內毒素，再按109菌落形成單位(cfli VmL濃度將其懸浮副pH 7.2 PBS 中重新制成懸液。將以上幽門螺桿菌SS1抹菌培養液離心后的上清液用能截留分子量1 萬左右超濾膜(如天津通海凈水設備廠的TH-30-l超濾膜)分級過濾，除去 小分子量的內毒素，保留并濃縮分子量大于1萬的毒素蛋白質抗原，濃縮至總蛋白量10mg/mL。將上述1份幽門螺桿菌43504林菌體懸液和1份幽門螺桿菌43504 林毒素蛋白質抗原(細菌培養上清液經超濾純化和濃縮產物)等量混合后， 再分別與等量的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合并用超聲波乳化后 制備成疫苗A和疫苗B用于免疫乳牛。實施例2用幽門螺桿菌Hp Y06林替代實施例1中的幽門螺桿菌SS1林制備成 疫苗A和B用于免疫乳牛。 實施例3用幽門螺桿菌Hp 27抹替代實施例1中的幽門螺桿菌SSI抹制備成 疫苗A和B用于免疫乳牛。 實施例4用幽門螺桿菌43504抹替代實施例1中的幽門螺桿菌SSI抹制備成 疫苗A和B用于免疫乳牛。 實施例5免疫懷孕乳牛注射程序第一次免疫懷孕后4 5月，分二點頸部皮下注射疫苗A，每點各 3mL 第二次免疫第一次免疫后一個月，與頸部兩側各皮下注射疫苗B, 每側3mL。第三次免疫在分娩前一個月分2點皮下注射疫苗B,每點3mL。 實施例6分娩后1~3天內的初乳作為有效初乳采集保存。每頭乳牛每次采集 初乳用前，均應洗凈乳頭和乳房，再用常規消毒劑消毒后人工或機械釆集 初乳。經檢驗合格的初乳按現有常規技術制成干粉制劑。初乳蛋白干粉分 裝后用同位素CC^照射滅菌。實施例7初乳中特異性抗體的檢測將每份初乳取3mL分置于二個eppedoff離心管中，在15000r/min下離心20min,分離乳脂和乳清。取乳清分別檢測對幽門螺桿菌的凝集抗體 及對毒素的沉淀抗體。1) 菌體試管凝集反應每份樣品取10只凝集反應用玻璃試管 (100mmx8mm )，每管加入0.25mL幽門螺桿菌菌懸液(3x 109菌/mL )。懸液用pH 7.2的PBS液配制。將待試乳清樣品分別用pH7.2 PBS做1:2 連續稀釋，分別在1 ~9號管中加入0.25mL不同稀釋度的待檢乳清，第 10管加入0.25mLPBS作為無自凝對照。每次檢測設一對照系列10只管，將4頭非免疫乳牛產后1 ~ 2日初乳 乳清混合后作為陰性對照。將凝集管在室溫(25。C左右)靜置60min，觀察試管管底細菌凝集狀 態，如果菌體呈傘狀均勻沉積于整個管底，且在輕輕搖震后呈絮狀物飄起， 判為凝集陽性。如體呈點狀集中沉積于管底中央，搖振后菌體均勻散開， 判為為陰性。如能產生50%菌體凝集的最大乳清稀釋度為凝集價。 在同 一試驗中，將待試樣品的凝集價與非免疫乳牛乳清的凝集價比確 定為有效特異性凝集價。如^1:4為合格。2) 初乳中抗毒素瓊脂擴沉淀抗體效^h的測定用pH 7.2的PBS配 制1%的瓊酯糖懸液，在100mm平皿中傾入20mL，在室溫下冷卻自然形 成凝膠后，置于4。C水箱保存備用(可保存一周)。用標準的瓊脂擴散沉淀反應打孔器在凝膠上打孔。于中央孔中加入 100jxL重組熱休克蛋白懸液(10mg/mL)，在5個外周孔中分別加入用pH 7.2 PBS的作l:2連續稀釋的乳清樣品。另1個孔加入未經稀釋的未免疫乳牛 初乳乳清做為陰性對照。結果判定在陰性對照乳清不產生沉淀線的條件下，以針對重組熱休 克蛋白產生沉淀線的最大稀釋度作為乳清樣品對重組熱休克蛋白的瓊擴 沉淀反應抗體效價。出現沉淀線時判為陽性。并以此代表初乳中對幽門螺 桿菌多種毒素特異性抗體的平均水平。
權利要求
1.一種乳牛的初乳制品，其特征在于含有針對幽門螺桿菌菌體及其毒素蛋白的特異性免疫球蛋白的乳牛初乳蛋白，作為有幽門螺桿菌感染人群的保健營養品。
2. —種乳牛的初乳制品的制備方法，其特征在于將培養純化的可 誘導針對幽門螺桿菌的保護性免疫應答的VacA、 CagA、 HspA、 HspB、 尿素酶和過氧化氬酶等多種抗原的人幽門螺桿菌菌體及其毒素蛋白抗原 與佐劑混合乳化后免疫注射懷孕乳牛，誘發針對幽門螺桿菌及其毒素的特 異性免疫球蛋白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，經過檢測并根據現有技 術加工成各型乳制品。
3. 如權利要求2所述的一種乳牛初乳制品的制備方法，其特征在于 用每毫升含3xl09菌體細胞的幽門螺桿菌菌懸液對待檢乳牛初乳乳清應 用試管凝集試驗，測定乳牛初乳中抗幽門螺桿菌菌體凝集抗體效價。
4. 如權利要求2所述的一種乳牛初乳制品的制備方法，其特征在于 以經純化和濃縮的幽門螺桿菌的重組熱休克蛋白為指示抗原，用瓊脂擴散 沉淀反應測定乳牛初乳中抗幽門螺桿菌外毒素蛋白抗體的效價。
全文摘要
本發明涉及一種抗幽門螺桿菌及其毒素的牛初乳蛋白，其制備方法是將培養純化的人幽門螺桿菌菌體及其毒素蛋白抗原與佐劑混合乳化后免疫注射懷孕乳牛，可誘發針對幽門螺桿菌及其毒素的特異性免疫球蛋白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，經過檢測并根據現有技術加工成各型乳制品，人服用后可以減弱幽門螺桿菌在胃粘膜表面的繁殖并中和其在粘膜表面產生的毒素。
文檔編號A23C9/158GK101223915SQ200810056199
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月15日 優先權日2008年1月15日
發明者崔治中 申請人:山東益生種畜禽有限公司