專利名稱：南方豇豆花葉病毒檢測用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及南方豇豆花葉病毒檢 測用引物。
背景技術：
南方哀工豆花葉病毒附osa/c v/ras， SCPMV)是南 方菜豆花葉病毒屬(5b&woWmO重要病毒之一，主要自然寄主為 豆科植物。SCPMV非常穩定，致死溫度90-95°C,稀釋終點10-5-10—6, 體外存活期最長可達165天，而且該病毒還可通過種子傳播。2007 年9月，廈門出入境檢驗檢疫局首次從進口的豇豆種子中截獲該病 毒，這也是我國首次從進境種子中檢出該病毒。因為國內學者對該 病毒的研究較少，相關資料及防治經驗缺少。SCPMV抗原性較強,容易研制出高滴度的特異抗血清,一般可達 1/2048至1/4096。SCPMV與同屬的南方菜豆花葉病毒(5bw/2emZ)e朋 wo^n'c Wras, SBMV)有非常密切的血清學關系，因此很難通過血清 學檢測將SCPMV和SBMV準確鑒定。近年來已經廣泛應用于分子 檢測領域的聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction, PCR) 為實現這一 目標提供了解決方案。本發明選擇南方豇豆花葉病毒外殼蛋白基因和3'端非翻譯區序 列，設計用于RT-PCR檢測的特異性引物，通過反轉錄和PCR擴增 建立了南方虹豆花葉病毒的分子檢測方法，反應結束后根據特異性 擴增DNA片段的位置判定結果。發明內容本發明目的在于提供用于南方豆工豆花葉病毒RT-PCR檢測的引 物序列。本發明通過分析已報道的SCPMV外殼蛋白基因和3'端非翻譯 區序列，設計SCPMV特異性引物。所述的引物對由正向和反向引 物組成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.l&2所示。本發明還進一步給出了應用上述引物的RT-PCR檢測方法，其 以樣品總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，反應結東后根據特異性 擴增的979 bp DNA片段判定結果。具體地說本發明以樣品總RNA為模板，進行RT-PCR反應。 RT-PCR反應包括反轉錄和PCR擴增兩個過程。首先在20pL反應體系進行反轉錄反應，即在0.2mL的反應管 中加入6.75 DEPC處理水，4 |iL總RNA, 1 SCPMV-RP ( 10 pmol/L), 1 pLdNTP ( 10mmol/L),混勻后于65。C保持5 min，迅 速轉移到冰上驟冷5min;然后向反應管中加入2 pL DTT (0.1 mmol/L)， 4pL5x反轉錄緩沖液，ljiLRNA酶抑制劑(40U/|iL)， 0.25 |iL反轉錄酶(200 U4iL )， 42。C反應50 min; 72 。C 15 min滅活 反轉錄酶后獲得反轉錄產物cDNA。PCR反應體系為50pL，即在0.2mL的PCR反應管中加入30.5 DEPC處理水，2 (xL cDNA， 2 pL SCPMV-FP ( 10 (xmol/L )， 2 [iL SCPMV-RP ( 10 |xmol/L), 10xPCR緩沖液5 ^L, 8 pL dNTP (2.5 mmol/L )， 0.5 (iL DNA聚合酶(5 U/(iL )。反應條件為94 °C ， 5 min; 94 °C 30 s, 52 °C 45 s， 72 °C 1 min,共30個循環；72 °C延伸5 min。進一步，還可以將本發明引物及相關試劑組裝成試劑盒，以方 便使用。本發明根據南方豆工豆花葉病毒外殼蛋白和3'端非編譯區序列設 計引物，該引物特異性好，用于SCPMV的RT-PCR檢測。本發明檢 測方法具有高特異性和靈敏度，其能夠快速準確地判斷樣品是否有 SCPMV,為進出口安全提供了保證。
圖1是應用RT-PCR檢測南方豇豆花葉病毒的結果，其中，l為 100 bp ladder, 2為SCPMV陽性對照，3、 4為SCPMV侵染發病 植株，5為健康植株，6為SBMV陽性對照，7為SBMV陽性對照； 1~6為SCPMV特異性RT-PCR產物擴增；7為SBMV特異性引物擴 增。圖2是本發明檢測方法的靈敏度試驗結果，其中，1為100 bp ladder, 2~7為發病樣本，50 pL反應體系中總RNA分別為5 |aL, 4 (iL, 3 ^L, 2 (xL, 1 0.5 |xL。
具體實施方式
下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明 的范圍。實施例l引物設計和合成根據SCPMV外殼蛋白和3，端非編譯區(GenBank No. M23021 )的公開序列，釆用引物設計軟件Primer 5.0設計引物，引物 序列為SCPMV-FP (正向)5，國atg tec ggt eta ttc cat c國3， SCPMV國RP (反向)5，- cca ttc gga tag cgc tc -3， 實施例2總RNA的提取1) 取0,2g發病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入 滅菌的1.5 ml離心管中，然后加入1 ml的Trizol試劑，劇烈震蕩搖 勻；2) 4°C， 12000 g離心10 min以除去不溶的成份，將上清液轉入 一新的1.5 ml離心管中；3) 室溫下保持5min，加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 s,然后在 室溫下保持2-15min后，4。C, 12000 g離心15 min;4) 將上層水相轉移到新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇， 顛倒混勻，室溫下保持15min;5) 4°C, 12000 g離心10 min， RNA就會在管的側壁和底部形 成沉淀；6) 倒掉上清液，加入75%的乙醇洗滌沉淀，然后4匸，7500g 離心5min (如沉淀懸浮起來，則用12000g)，棄去乙醇；7) 沉淀于室溫下充分干燥后，溶于40pldH20 (DEPC處理) 中，-20°。保存備用。實施例3 RT-PCR擴增方法的建立以總RNA為模板，進行RT-PCR反應。20pL反應體系進行反 轉錄反應，即在0.2mL的反應管中加入6.75(xLDEPC處理水，4 |iL 總RNA， 1 SCPMV-RP ( 10 pmol/L )， 1 pL dNTP ( 10 mmol/L )， 混勻后于65 °C保持5 min，迅速轉移到冰上驟冷5min;然后向反 應管中加入2 ^LDTT (0.1 mmol/L), 4 pL 5x反轉錄緩沖液，1 RNA酶抑制劑(40U/pL)， 0.25 (iL反轉錄酶(200 U/VL)， 42""C反 應50 min; 72 °C 15 min滅活反轉錄酶后獲得反轉錄產物cDNA。PCR反應體系為50pL，即在0.2mL的PCR反應管中加入30.5 DEPC處理水，2 cDNA， 2 SCPMV-FP ( 10 [imol/L ), 2 SCPMV隱RP ( 10 (imol/L), 10xPCR緩沖液5 (iL， 8 jiL dNTP (2.5 mmol/L ), 0.5 DNA聚合酶(5 U/jiL )。反應條件為94 °C, 5 min; 94 °C 30 s， 52 °C 45 s， 72 °C 1 min,共30個循環；72 °C延伸5 min。 實施例4 SCPMVRT-PCR方法的特異性確定以表現癥狀的豇豆葉片總RNA為模板，以健康葉片和SBMV陽性 材料作為對照，通過RT-PCR進行擴增。反應結束后根據SCPMV特異 性擴增DNA片段(979 bp)的位置判定結果。根據SBMV外殼蛋白和3，端非編譯區(GenBankNo.DQ836714) 的公開序列，釆用引物設計軟件Primer5.0設計引物，引物序列為SBMV-FP (正向)ATG GCG AAG AGG TTG ACSBMV-RP (反向)ACT TTT GGA TTA CGC TCC ATCSBMV擴增條件與SCPMV完全相同，擴增片段930bp。 試驗結果以表現癥狀的豇豆葉片總RNA為模板，通過RT-PCR檢測可觀察 到979 bp的特異性擴增片段，而健康對照和SBMV陽性材料則沒有特 異性擴增條帶的出現。說明建立的RT-PCR對SCPMV具有良好的特異 性，可將SCPMV與其同屬的SBMV區分開來。結果見圖l。 實施例5 SCPMVRT-PCR方法的靈敏度確定使用l ml的Trizol試劑從0.2 g發病葉片中提取總RNA，用40 (iL DEPC處理水溶解總RNA,進行相對靈敏度檢測。在50 ^L反應體系中， 總RNA分別為5 jiL， 4 ^L, 3 (aL, 2 1 ^L， 0.5 |aL。檢測結果如圖2所 示。表明建立的RT-PCR方法可從0.5 pL總RNA中成功檢測出SCPMV。 具有較高的靈敏度，符合檢測的要求。序歹U 表〈110〉廈門出入境檢驗檢疫局，中國檢驗檢疫科學研究院 〈120〉南方豇豆花葉病毒檢測用引物 〈130〉〈160〉 2〈170〉 Patentln version 3.3<210〉 1〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 1atgtccggtc tattccatc 19〈210〉 2 〈211> 17 〈212〉 薩 〈213>人工序列 〈400〉 2ccattcggat agcgctc 1權利要求
1、一種南方豇豆花葉病毒檢測用引物，其核苷酸序列為SCPMV-FP5’-atg tcc ggt cta ttc cat c-3’SCPMV-RP5’-cca ttc gga tag cgc tc-3’
2、 一種檢測南方豇豆花葉病毒的方法，該方法以樣品總RNA 為模板，利用權利要求1所述的引物進行RT-PCR擴增，反應結束 后根據特異性擴增DNA片段的位置判定結果。
3、 如權利要求2所述的方法，其特征在于，RT-PCR的反應過 程中反轉錄反應的溫度為42°C, PCR擴增的退火溫度為52°C,延伸 溫度為72°C。
4、 含有權利要求1所述南方S工豆花葉病毒檢測用引物的試劑盒。
5、 權利要求l所述的引物在南方豆工豆花葉病毒檢測中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種南方豇豆花葉病毒檢測用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本發明還進一步提供了檢測南方豇豆花葉病毒的方法，該方法以樣品總RNA為模板，利用特異性引物進行RT-PCR擴增，反應結束后根據特異性擴增DNA片段的位置判定結果。本發明引物特異性好，檢測方法快速簡單，靈敏度高，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/70GK101215611SQ20081005611
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月11日 優先權日2008年1月11日
發明者朱水芳, 林石明, 趙文軍, 青 陳, 陳洪俊, 陳紅運 申請人:中華人民共和國廈門出入境檢驗檢疫局;中國檢驗檢疫科學研究院