專利名稱：一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法及其試劑盒。
技術背景隨著經濟的發展和物質生活水平的提高，人們對畜產品質量的要求越來越高， 對雞蛋的需求已經不再僅限于數量，對品質風味也有了更高的要求。通常飼料含魚 粉會導致雞只產出魚腥味蛋，然而用不含魚粉的飼料喂養，仍然有部分雞只產魚腥 味蛋。由于必需打開雞蛋才能判斷其是否有魚腥味，造成了養禽生產者和加工者很 大的經濟損失。因此，研究雞蛋魚腥味的產生機理并通過育種手段剔除它，具有非 常重大的經濟意義和社會意義。根據Bolton等(1976)研究發現，雞只產魚腥味蛋的性狀為常染色體隱性遺傳， 傳統育種方法很難剔除突變基因。隨著分子生物學技術和雞基因組研究的飛快發 展，育種更準確、進展更快的分子育種已經提上歷史舞臺，從分子生物學角度研究 魚腥味產生的機理，并研究候選基因和分子遺傳標記，運用標記輔助選擇的方法可 以快速、高效的達到育種的目的。某些食物中含有三甲胺，如油菜籽，三甲胺揮發可產生很難聞的魚腥味。含黃 素單氧化酶3 (flavin-containing mono-oxygenase3， FM03)主要存在于肝臟中，其 功能為促進食物中的三甲胺氧化成沒有氣味的N-氧化三甲胺，/WO 基因突變個體 不能氧化機體從食物中攝入的三甲胺，從而導致三甲胺沉積，發生魚腥味。有研究 發現，人類和奶牛的尸M^基因突變均可導致魚腥味的發生(Treacy， et al., 1998; Akerman et al. ， 1999; Lund6n et al., 2002) 。 FM^基因突變的雞只，由于不能氧 化從食物中攝入的三甲胺，會導致三甲胺沉積到蛋黃中，產出魚腥味蛋。Honkatukia 等(2005)已經成功克隆了雞的/￥0 基因，該基因位于雞8號染色體上，FM03的cDNA 全長1882bp，含9個外顯子，共編碼531個氨基酸殘基(GenBank Accession Number AJ431390)。SNP(single nucleotide polymophism)，即單核苷酸多態，是由于單個核苷酸 改變而導致的核酸序列多態。目前己有很多成熟的技術檢測SNP，如單鏈構象多態 性(PCR-SSCP)、 DNA測序、限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)、等位基因特異寡聚核苷酸雜交、DNA芯片及TaqMan等。PCR-SSCP方法最為常用，但存在的問題 有檢測步驟較多；耗時較長(12-20小時)；易出現雜帶，增加錯判幾率，結果 的可信度較低。DNA測序、等位基因特異寡聚核苷酸雜交、DNA芯片和TaqMan方法 雖然準確度都比較高，但檢測費用高，運用到實際育種比較困難。 發明內容本發明的目的是提供一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法。本發明所提供的檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法，是PCR擴增包括 GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸在內 的片段，用限制性核酸內切酶BsrI酶切所得的PCR擴增產物，電泳檢測所得到的 酶切產物，按照如下方法確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的 自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T:如果電泳顯示為兩 條帶，所述待測雞只的基因型為AA，是野生型純合體；如果電泳顯示為一條帶，所 述待測雞只的基因型為TT，是突變型純合體；如果電泳顯示為三條帶，所述待測雞 只的基因型為AT，是雜合體。上述檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法，具體可為用序列是序列表中的序 列1和序列是序列表中的序列2組成的一對引物進行PCR。上述檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法，具體可為以所述待測雞只的基因 組DNA為模板，用序列是序列表中的序列1和序列是序列表中的序列2組成的一對 引物進行PCR，用限制性核酸內切酶BsrI酶切所得的PCR擴增產物，按照如下方法 確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧 核糖核苷酸是野生型A還是突變型T:如酶切產物為143bp和226bp兩個片段，所 述待測雞只的基因型為AA，是野生型純合體；如酶切產物為369bp—個片段，所述 待測雞只的基因型為TT，是突變型純合體；如酶切產物為143bp、 226bp及369bp 三個片段，所述待測雞只的基因型為AT，是雜合體。本發明的另一個目的是提供一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的試劑盒。本發明所提供的檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的試劑盒，含有PCR擴增包括 GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸在內 的片段所用的引物對和限制性核酸內切酶BsrI。該試劑盒中，所述引物對的一個引物的核苷酸序列是序列表中序列l，另一個 引物的核苷酸序列是序列表中序列2。所述試劑盒中還可包括進行PCR-RFLP所需的其它試劑，這些試劑均可從商業 途徑得到。本發明還提供了上述檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法在確定雞只產魚腥 味蛋性狀中的應用。本發明還提供了上述檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的試劑盒在確定雞只產魚 腥味蛋性狀中的應用。通過本發明所提供的檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法或試劑盒，可確定待 測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核 苷酸是野生型A還是突變型T，從而確定雞只產魚腥味蛋性狀突變型純合體TT 在伺喂含有三甲胺的飼料時產魚腥味蛋；野生型純合體AA、雜合體AT，在飼喂含 有三甲胺的飼料時不產魚腥味蛋。利用本發明提供的方法或試劑盒檢測雞只是否攜帶雞蛋魚腥味突變等位基因， 可以確定雞只產魚腥味蛋性狀，使配制飼料過程中不用刻意剔除含有三甲胺的原 料，大大節省詞料成本，獲得可觀的經濟效益。本發明為蛋雞育種工作中針對產魚 腥味蛋性狀開展標記輔助選擇，提供了一個分子遺傳標記檢測方法，使用該方法和 遺傳標記對蛋雞的產魚腥味蛋性狀進行標記輔助選擇，可大大降低分子育種的花 費，并可有效剔除實際生產中的產魚腥味蛋問題，為加速改善雞蛋風味的分子育種 奠定了基礎。本發明提供的方法或試劑盒操作簡單，只需將酶切產物進行瓊脂糖凝 膠電泳，可確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第 1034位脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T。準確度高，沒有雜帶；耗時短， 4-6小時；費用低廉；可實現自動化檢測。為雞的育種工作提供便利，將在雞的育 種中發揮巨大作用。
圖1為酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施方式
下面結合具體實例對本發明作進一步詳細說明。以下的實施例便于更好地理解 本發明，但并不限定本發明。本發明提供的檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法可用于檢測雞只產魚腥蛋 性狀。下述實施例提供了具體的檢測雞只產魚腥味蛋性狀的方法PCR擴增包括GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸在內 的片段，用限制性核酸內切酶BsrI酶切所得的PCR擴增產物，電泳檢測酶切產物， 按照如下方法確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第 1034位脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T，從而確定待測雞只的產魚腥味蛋 性狀如果電泳顯示為兩條帶，所述待測雞只的基因型為AA，是野生型純合體，在 飼喂含有三甲胺的詞料時不產魚腥味蛋；如果電泳顯示為一條帶，所述待測雞只的 基因型為TT，是突變型純合體，在飼喂含有三甲胺的飼料時產魚腥味蛋；如果電泳 顯示為三條帶，所述待測雞只的基因型為AT，是雜合體，在飼喂含有三甲胺的飼料 時不產魚腥味蛋。進行所述PCR擴增的一對引物中， 一個引物的核苷酸序列具體可為序列表中序 列1，另一個引物的核苷酸序列具體可為序列表中序列2。所述PCR擴增的模板具體可為所述待測雞只的基因組DNA。以上述待測雞只的基因組DNA作為模板應用上述引物對進行PCR擴增后，用限 制性核酸內切酶BsrI酶切所得的PCR擴增產物，電泳檢測酶切產物，可按照如下 方法確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位 脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T，從而確定待測雞只的產魚腥味蛋性狀 如酶切產物為143bp和226bp兩個片段，所述待測雞只的基因型為AA，是野生型純 合體，在飼喂含有三甲胺的飼料時不產魚腥味蛋；如酶切產物為369bp—個片段， 所述待測雞只的基因型為TT，是突變型純合體，在飼喂含有三甲胺的飼料時產魚腥 味蛋；如酶切產物為143bp、 226bp及369bp三個片段，所述待測雞只的基因型為 AT，是雜合體，在飼喂含有三甲胺的飼料時不產魚腥味蛋。下列實施例中所用方法如無特殊說明均為常規方法。所用原料都可從商業途徑 獲得。引物合成及測序工作均由奧科生物有限公司完成。實施例1、檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法的建立一、A985T多態性位點的確定1、 PCR擴增選擇矮小型褐殼蛋雞純系為實驗材料。根據GenBank Accession Number AJ431390設計引物，令擴增得到的目的片段包含GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸，引物序列如下U (上游引物)5， -CAGGGTGGTATCAAGCCTGT-3，(序列表中序列1) D (下游引物)5， -GATCCAAAGGACTGGACCAA-3'(序列表中序列2) 以矮小型褐殼蛋雞純系基因組DNA為模板，使用引物U和D進行PCR擴增。 擴增體系如下50ng1. 5叱 0, 8叱 各0. 3叱 0. 5U2. 5mmol/L (終濃度)雞基因組DNA IOXPCR擴增緩沖液 dNTPs (4mmol/L)混合液 上、下游引物(10praol/L) Taq DNA聚合酶 Mg2+用ddH20補充反應體系至15叱 PCR反應條件為95。C變性5min;循環程序為95。C變性20s， 68。C退火30s， 72。C延伸30s，共35個循環；最后72。C延伸10min。 2、 RFLP分析使用限制性內切酶BsrI，酶切步驟l中的PCR擴增產物。Bsrl的酶切序列如 下(其中的箭頭所指位置為酶切位點，N表示任何堿基)5， -ACTGGN U3， -TGAC t CN- 5， 酶切反應體系如下PCR反應混合物 8^1IOX酶切緩沖液 1.6pl內切酶BsrI (lOUAil) 1^1ddH20 13.4pl總體積 24pl 恒溫水浴65"C孵育1-3小時。酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓8V/cm，時間30min)。使用凝膠成 像系統觀察，結果如圖l所示。由圖可見，酶切產物呈現3種帶型。部分樣本顯示兩條電泳條帶，序列長度分 別為143bp、 226bp;部分樣本顯示為一條電泳條帶，序列長度為369bp;剩下的樣 本顯示為三條電泳條帶，序列長度分別為143bp、226bp及369bp，其中長度為143bp、226bp的兩條電泳條帶亮度之和為369bp長度電泳條帶亮度。3、 克隆測序及序列分析根據PCR-RFLP分析結果，分別將顯示不同電泳條帶的樣本的PCR擴增產物用 瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收純化，回收的DNA片段連接 載體pGEM-T (Proraega公司)后，參照Cohen等的方法(尸roc船W Jcad Sc厶69:2110)， 將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，根據載體上的羧卞青霉素抗性標記篩 選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟 動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明不同樣本的擴增片段長度 均為369bp，只存在一個脫氧核糖核苷酸的差異(A/T)，此脫氧核糖核苷酸為GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸(即從起始密 碼子ATG開始第985位)，命名為A985T。根據測序結果和PCR-RFLP結果，對基因型進行如下限定若該位點的等位基因為A，其純合體基因型為AA， PCR-RFLP檢測為兩條電泳條 帶，序列長度分別為143bp、 226bp;若該位點的等位基因為T，其純合體基因型為TT， PCR-RFLP檢測為一條電泳條 帶，序列長度為369bp;該位點雜合體基因型為AT， PCR-RFLP檢測為三條電泳條帶，序列長度分別為 143bp、226bp及369bp，其中長度為143bp、226bp的兩條電泳條帶亮度之和為369bp 長度電泳條帶亮度。4、 雞蛋魚腥味突變等位基因檢測試劑盒的制備雞蛋魚腥味突變等位基因檢測試劑盒包括 一對引物，其中一個引物的核苷酸 序列是序列表中序列l，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2;限制性核酸 內切酶BsrI;步驟1中PCR反應體系中的所有試劑和步驟2中酶切反應體系中的所 有試劑。二、雞只基因型與產魚腥味蛋性狀的關聯分析 用含有油菜籽(含三甲胺)的飼料飼喂絲羽烏骨雞。利用雞蛋魚腥味突變等位基因檢測試劑盒進行檢測。以待檢測雞只的基因組 DNA為模板，按照步驟一中1進行PCR擴增，按照步驟一中2進行RFLP分析。檢測 雞只產的蛋是否有魚腥味，分析雞只基因型與產魚腥蛋性狀的關聯性。雞只基因型與產魚腥蛋性狀的關聯如表1所示。在所檢測的48只雞中，AA基因型29只，AT基因型9只，TT基因型10只。所有AA基因型和AT基因型個體 所產雞蛋都不表現魚腥味，所有TT基因型個體所產雞蛋都表現出濃重的魚腥味。以上結果證明了 A985T多態與雞只產魚腥蛋性狀密切關聯，可以作為雞只產魚 腥蛋性狀篩選的分子標記。表1 ZWO 基因A985T位點基因型與所產魚腥味蛋性狀的關聯AAATTT有0010無2990實施例2、通過雞蛋魚腥味突變等位基因檢測試劑盒檢測不同品種雞只攜帶雞 蛋魚腥味突變等位基因的情況及基因型-雞只產魚腥味蛋性狀關聯驗證分析用含有油菜籽(含三甲胺)的飼料飼喂白來航蛋雞、H褐蛋雞、東鄉綠殼蛋雞。 利用雞蛋魚腥味突變等位基因檢測試劑盒檢測上述不同品種雞只的A985T多 態。雞蛋魚腥味突變等位基因檢測試劑盒包括 一對引物，其中一個引物的核苷酸 序列是序列表中序列l，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2;限制性核酸 內切酶BsrI;該試劑盒還包括PCR-RFLP所需的常規試劑。以待檢測雞只的基因組 DNA為模板，按照實施例1中步驟一的1進行PCR擴增，按照實施例1中步驟一的 2進行RFLP分析。分析三個品種雞只A985T等位基因和基因型的分布情況。三個品種雞只A985T 等位基因和基因型的分布情況如表2所示。表2 /WO 基因A985T等位基因和基因型在不同雞種中的分布品種檢測的只數等位基因頻率基因型頻率ATAAATTT白來航蛋雞961.0000, 0001.0000.0000.000H褐蛋雞790. 7720. 2280. 6840. 1770. 139東鄉綠殼蛋雞1961. 0000. 0001. 0000. 0000. 000是否魚腥味雞蛋否否是由表2可見，白來航蛋雞不攜帶突變等位基因T，沒有TT基因型，對雞只所產 蛋進行魚腥味檢測的結果表明該雞種不產魚腥味雞蛋，這與其他研究報道一致 (Bolton et al. ， 1976)，說明檢測結果可靠。東鄉綠殼蛋雞中同樣不攜帶突變等位基因T，沒有TT基因型，對雞只所產蛋進行魚腥味檢測的結果表明該雞種不產 魚腥味雞蛋，說明綠殼雞蛋不會有魚腥味出現，雞蛋風味較好。H褐蛋雞中攜帶等位基因A頻率為0.772、攜帶突變等位基因T頻率為0.228， AA基因型的頻率為 0. 684、 AT基因型的頻率為0. 177、 TT基因型的頻率為0. 139，對雞只所產蛋進行 魚腥味檢測的結果表明所有AA、 AT基因型個體不產魚腥味雞蛋，所有TT基因型個 體均產魚腥味雞蛋，說明飼喂含三甲胺的飼料，該雞種中13.9%的雞只(TT基因型) 會生產魚腥味雞蛋，需要利用分子育種手段剔除突變等位基因T。序列表<110>中國農業大學〈120〉一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法及其試劑盒 〈130〉CGGNARY81036<160〉2<210>1 〈211>20 <212〉腿 <213>人工序列〈220> 〈223〉<400>1cagggtggta tcaagcctgt 20<210>2 <211>20 <212〉腿 <213〉人工序列<220〉 <223><400>2gatccaaagg actggaccaa 20
權利要求
1、一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法，是PCR擴增包括GenBank AccessionNumber AJ431390的自5′末端第1034位脫氧核糖核苷酸在內的片段，用限制性核酸內切酶BsrI酶切所得的PCR擴增產物，電泳檢測所得到的酶切產物，按照如下方法確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T如果電泳顯示為兩條帶，所述待測雞只的基因型為AA，是野生型純合體；如果電泳顯示為一條帶，所述待測雞只的基因型為TT，是突變型純合體；如果電泳顯示為三條帶，所述待測雞只的基因型為AT，是雜合體。
2、 如權利要求l所述的檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法，其特征在于用 序列是序列表中的序列1和序列是序列表中的序列2組成的一對引物進行PCR。
3、 如權利要求2所述的檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法，其特征在于以 所述待測雞只的基因組DNA為模板，用序列是序列表中的序列1和序列是序列表中的 序列2組成的一對引物進行PCR，用限制性核酸內切酶BsrI酶切所得的PCR擴增產物， 按照如下方法確定待測雞只的GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第 1034位脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T:如酶切產物為143bp和226bp兩個 片段，所述待測雞只的基因型為AA，是野生型純合體；如酶切產物為369bp—個片段， 所述待測雞只的基因型為TT，是突變型純合體；如酶切產物為143bp、 226bp及369bp 三個片段，所述待測雞只的基因型為AT，是雜合體。
4、 一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的試劑盒，含有PCR擴增包括GenBank Accession Number AJ431390的自5'末端第1034位脫氧核糖核苷酸在內的片段所用 的引物對和限制性核酸內切酶Bsrl。
5、 如權利要求4所述的該試劑盒，其特征在于所述引物對的一個引物的核苷 酸序列是序列表中序列1，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2。
6、 權利要求1或2或3所述方法在確定雞只產魚腥味蛋性狀中的應用。
7、 權利要求4或5所述試劑盒在確定雞只產魚腥味蛋性狀中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測雞蛋魚腥味突變等位基因的方法及其試劑盒，該方法和試劑盒可應用于篩查雞只產魚腥味蛋性狀。使用本發明的方法或試劑盒可準確、高效地判別雞只是否攜帶雞蛋魚腥味突變等位基因，剔除實際生產中的雞蛋魚腥味問題，大大降低分子育種花費，有利于更廣泛選擇飼料原料，降低飼養成本，提高經濟效益。本發明提供的檢測方法或試劑盒操作簡單，費用低廉，檢測時間短，準確度高，可實現自動化檢測，將在雞育種中發揮巨大作用。
文檔編號C12Q1/68GK101215607SQ200810055748
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月8日 優先權日2008年1月8日
發明者張龍超, 寧 楊, 鄭江霞 申請人:中國農業大學