一種檢測dna甲基化的方法

專利名稱：一種檢測dna甲基化的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測DNA甲基化的方法。
技術背景哺乳動物DNA的甲基化僅發生在CpG 二核苷酸的C上，在基因調控區啟動子上 富含CPG序列，而這些CpG序列的甲基化水平與基因的表達密切相關。近年來，隨著聚合酶鏈式反應技術(PCR)的快速發展，抑癌基因的甲基化與 癌癥的關系得到不斷深入的研究。研究表明，抑癌基因啟動子區CpG島的異常甲基 化導致抑癌基因失活，是癌癥發生的一個重要機制，而且甲基化水平隨著癌癥的發 展而提高。 一些基因的高甲基化水平有可能成為腫瘤乃至癌細胞形成的標志物。如 何在癌癥早期了解相關抑癌基因啟動子區CpG島的甲基化狀態，對于及時發現和治 療癌癥非常重要。這些研究結合亞硫酸氫鈉處理和PCR技術，由于樣品用量減少， 結果重復性高，非常適合臨床癌癥診斷。無論是基于甲基敏感的單堿基延伸技術(Ms-SNuPE)還是甲基特異性的PCR技術(MSP)，在檢測中或者使用有害的放射 性同位素以提高靈敏度，或者釆用酶切反應、基因測序、高壓液相色譜分析(HPLC) 及電泳分析，這些檢測手段需要繁瑣的分離、純化程序，增加了檢測時間，而且使 用更多的是靈敏度有限的電泳分析，不利于低甲基化水平的檢測，限制了Ms-SNuPE 和MSP技術在臨床癌癥診斷方面的應用。應用高靈敏度的熒光檢測手段的實時定量 PCR技術需要使用雙標記的熒光探針DNA，設備昂貴，由于受制于長度及特異性， 熒光探針不易設計，不是每個DNA序列中都能設計出一個合適的雙標記探針，因此 限制了這種技術在臨床癌癥診斷上的廣泛應用。 發明內容本發明的目的是提供一種檢測DNA甲基化的方法。 本發明所提供的檢測DNA甲基化的方法，依次包括以下步驟1) 用亞硫酸氫鈉處理待測DNA，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶；2) 以步驟l)的DNA為模板進行PCR擴增，并用熒光素標記歩驟l)的DNA;3) 通過所述熒光素與下述式(I)的化合物熒光共振能量轉移情況確定所述待測DNA的目標CpG位點或序列的甲基化狀態;<formula>formula see original document page 5</formula>式(I)中R代表鏈端含有四級胺的直鏈或支鏈的垸基，所述烷基的主鏈長為2-12個碳，X代表鹵素；所述式(I)化合物的數均分子量為5000-100000。式(I)的化合物命名為PFP。上述PFP可根據文獻(S. Wang， B. S. Gaylord, G. C. Bazan， / C力e瓜5bc. 2004，"《5446-5451)合成。所述式(I)中，R具體可為6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基 戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基等中的任意一種；X具體可為氯、溴和碘中的任意一種。所述熒光素標記步驟1)的DNA的方法具體可為用熒光素標記的dGTP對PCR 擴增產物進行單堿基延伸。所述單堿基延伸中，所用的引物有兩種甲基化特異引物和去甲基化特異引物； 所述甲基化特異引物的3'末端核苷酸為C，所述去甲基化特異引物的3'末端核苷 酸為T;所述引物能與待測DNA的目標CpG位點前至少15bp序列的對應互補序列特 異結合。確定所述待測DNA的目標CpG位點的甲基化狀態的方法具體可為若出現熒光 共振能量轉移并且在單堿基延伸中使用的是甲基化特異引物，則所述待測DNA的目 標CpG位點上存在甲基化；若出現熒光共振能量轉移并且在單堿基延伸中使用的是 去甲基化特異引物，則所述待測DNA的目標CpG位點上存在去甲基化；若兩種引物 都出現熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的目標CpG位點上部分甲基化。所述熒光素標記步驟1)的DNA的方法還可為用熒光素標記的任意一種dNTP 對所述步驟1)的DNA的目標序列進行PCR擴增。所述PCR擴增中所用的擴增所述目標序列的弓I物對有兩種甲基化特異弓I物對 和去甲基化特異引物對；甲基化特異引物對為正義引物和反義引物，所述正義引物 和反義引物至少含有三個CG;去甲基化特異引物對為正義引物和反義引物，所述正 義引物和反義引物至少含有三個TG。確定所述待測DNA的目標CpG序列的甲基化狀態的方法具體可為若出現熒光共振能量轉移并且在PCR擴增中使用的是甲基化特異引物對，則所述待測DNA的目 標CpG序列上存在甲基化；若出現熒光共振能量轉移并且在PCR擴增中使用的是去 甲基化特異引物對，則所述待測DNA的目標CpG序列上存在去甲基化；若兩種引物 對都出現熒光共振能量轉移，則所述待測D跳的目標CpG序列上部分甲基化。本發明所檢測的DNA可以是肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、淋 巴癌、白血病、膀胱癌、卵巢癌、腎癌等癌細胞或癌組織的基因組DNA，以及腫瘤 或正常的細胞或組織的基因組DNA、質粒DNA、合成DNA等。式(I)所示的PFP為水溶性陽離子型共軛聚合物或寡聚物，具有與DNA結合 強、熒光量子產率高、能對DNA上標記的熒光素有顯著的熒光增幅等特性。本發明 利用具有優越熒光性能的PFP，使用熒光素標記的單核苷三磷酸，結合亞硫酸氫鈉 -PCR技術在引物或擴增片段上標記熒光素，觀察標記的熒光素與PFP的熒光共振能 量轉移(FRET)情況進而了解DNA目標CpG位點或序列的甲基化狀態。本發明所提供的檢測DNA甲基化的方法克服了現有DNA甲基化檢測技術的不 足，具有高效、靈敏、簡便、快速、無需分離等優點。與應用最廣泛的電泳分析相 比，本發明靈敏度更高，檢測的DNA濃度更低，處理更快捷，更省略了各種分離、 純化步驟，能夠方便地檢測到低水平的DNA甲基化。許多癌癥在早期即表現出抑癌基因(如pM、 P75、 pM等)啟動子區CpG甲基 化的特征，而正常細胞中這些CpG序列是處于去甲基化狀態的。相比于在臨床應用 的對樣本質量要求很高的組織學方法，本發明僅需要很少量的DNA (不足l微克)， 可靈敏地檢測抑癌基因的甲基化水平，在早期癌癥的臨床診斷方面具有重要意義。


圖1為Ms-SNuPE方法檢測DNA甲基化流程圖。圖2為MSP方法檢測DNA甲基化流程圖。圖3為應用PFP1檢測質粒2甲基化的熒光光譜。圖4為應用PFP1檢測質粒1甲基化的熒光光譜。圖5為應用PFP1檢測質粒1和質粒2混合物甲基化的熒光光譜。圖6為應用PFP2檢測質粒2甲基化的熒光光譜。圖7為應用PFP2檢測質粒1甲基化的熒光光譜。圖8為應用PFP2檢測質粒1和質粒2混合物甲基化的熒光光譜。圖9為應用PFP3檢測質粒2甲基化的熒光光譜。圖10為應用PFP3檢測質粒1甲基化的熒光光譜。 圖11為應用PFP3檢測質粒1和質粒2混合物甲基化的熒光光譜。 圖12為應用PFP4檢測癌細胞HT29基因組甲基化的熒光光譜。 圖13為應用PFP5檢測癌細胞HT29基因組甲基化的熒光光譜。 圖14為應用PFP6檢測癌細胞HT29基因組甲基化的熒光光譜。 圖15為應用PFP2和甲基化特異引物對檢測癌細胞HT29基因組甲基化的熒光 光譜。圖16為應用PFP2和去甲基化特異引物對檢測癌細胞HT29基因組甲基化的熒 光光譜。
具體實施方式
本發明具體提供了以下兩種檢測DNA甲基化的方法方法一Ms-SNuPE方法，如圖1所示。1、 合成PFP。2、 用亞硫酸氫鈉處理待測DNA,使所述待測DNA中未發生甲基化的胞噴啶脫氨 基轉變成尿嘧啶(A. Olek， J. Oswald, J. Walter, M/ch'd他紐1996， 2《 5064-5066)。3、 PCR擴增按常規PCR方法擴增經亞硫酸氫鈉處理的正義鏈DNA，尿啼啶全部轉成胸腺嘧 啶，引物不含CpG序列，擴增片斷中含有目的CpG位點。4、 單堿基延伸PCR擴增產物經核酸外切酶I和磷酸水解酶消化后，不經分離取少許按常規方 法進行單堿基延伸。對應于甲基化的引物3，端最后一個堿基為C，對應于去甲基 化的引物3'端最后一個堿基為T，使用的dGTP為熒光素標記的單核苷三磷酸。引 物與目標序列匹配時，成功延伸，這樣熒光素就被標記在引物上；引物與目標序列 不匹配(在引物3'端最后一個堿基)時則不能延伸，熒光素不能被標記在引物上。5、 熒光光譜測定延伸產物經堿性磷酸酶消化后，不經分離取少量稀釋500倍后與PFP聚合物或 寡聚物作用，只有標記到DNA上的熒光素才能與PFP發生熒光共振能量轉移(FRET)， 這是因為PFP聚合物或寡聚物的發射光譜與熒光素的吸收光譜有較好的重疊，長鏈 的DNA與聚合物或寡聚物形成靜電復合物使DNA上的熒光素距離PFP很近而發生有效的能量轉移。若出現FRET并且在單堿基延伸中使用的是甲基化特異引物，則表 明DNA目標CpG位點上存在甲基化；若出現FRET并且在單堿基延伸中使用的是去 甲基化特異引物，則表明DNA目標CpG位點上存在去甲基化；若兩種引物都出現 FRET，則表明目標CpG位點上部分甲基化。 方法二 MSP方法，如圖2所示。1、 合成PFP。2、 用亞硫酸氫鈉處理待測DNA，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶(A. Olek， J. Oswald, J. Walter, M/ch.c ^c油L 1996， 2《 5064-5066)。3、 PCR擴增甲基化特異引物對的正義引物和反義引物至少含有三個CG;去甲基化特異引物 對的正義引物和反義引物至少含有三個TG。使用的dNTP混合物中混合了熒光素標 記的單核苷三磷酸，擴增經亞硫酸氫鈉處理的DNA。引物與模板DNA完全匹配時才 能有效擴增，擴增的DNA被熒光素標記；否則不能擴增，熒光素不被標記到DNA上。4、 熒光光譜測定PCR產物經堿性磷酸酶消化后，不經分離取少量稀釋500倍后與PFP聚合物或 寡聚物作用，只有標記到DNA上的熒光素才能與PFP發生FRET。若出現FRET并且 在PCR擴增中使用的是甲基化特異引物對，則表明目標CpG序列存在甲基化；若出 現FRET并且在PCR擴增中使用的是去甲基化特異引物對，則表明目標CpG序列存 在去甲基化；若兩種引物對都出現FRET，則表明目標CpG序列是部分甲基化的。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用質粒的合成方法針對癌細胞株HT29的基因組序列化學合成p76啟動子區283bp序列(序列表 中序列l)，序列1中共有3個CpG位點，分別是自序列1的5'末端第190-191 位核苷酸(CpG位點l)、第118-119位核苷酸(CpG位點2)、第223-224位核苷 酸(CpG位點3)。將序列l所示的核苷酸序列連接入載體質粒pUC57的EcoR V位 點，得到重組載體質粒l。用M.SssI酶(NEB，紐英倫公司)處理質粒l，使序列1所示的核苷酸序列上的 3個CpG位點全部甲基化，得到重組載體質粒2。實施例1、 PFP1在質粒2甲基化檢測中的應用PFP1一、 PFP1的合成PFP1的結構如式(II)所示，合成方法如下向100mL的單口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克對甲苯磺酸，回 流24小時，蒸除溶劑后硅膠柱分離(洗脫劑二氯甲烷)，得到4.8克1，4-苯二 硼酸新戊二酯。臓(400 MHz，CDCU: S (ppm) 7. 78(4H，s)， 3. 77(8H，s)， 1.02(12H， s)。向25 mL的二口瓶中加入5. 4 mL甲苯和3. 6 mL 2M碳酸鉀，鼓入氮氣30分鐘 后，加入325毫克2，7-二溴-9，9-二(6-溴己基)芴，151毫克1， 4-苯二硼酸新戊二 酯和20毫克四(三苯基膦)鈀，于氮氣下95。C攪拌反應24小時，冷卻后加入氯仿和 水，取氯仿層水洗后用無水硫酸鎂干燥，旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到210毫克淺黃 色固體。將固體溶于20毫升二氯甲烷，加入1毫升三乙胺于室溫攪拌24小時后離 心，收集沉淀并干燥，得到208毫克聚合物PFP1。氛=3.5X104。 'H麗R(400 MHz， DMSO): S (ppm) 7. 3-8. 0 (IOH， m) ， 2. 9—3. 2 (16H， m) ， 2. 2-2. 3 (4H， m) ， 1. 5—1. 6 (4H， m)， 0. 9-1.2 (30H， m)。二、 亞硫酸氫鈉處理500 ng質粒2按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉 變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4'C保存。三、 PCR擴增按常規方法進行PCR擴增，引物及反應條件如下 引物l序列(正義引物):5， -GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGT-3，， 引物2序列(反義引物):5， -TCTAATAACCAACCAACCCCTCC-3'。 PCR反應條件94°C、 2分鐘變性一40個循環94°C、 30秒，68°C、 30秒，72°C、 30秒。四、 單堿基延伸反應1、 先對PCR產物進行酶消化處理以除去未反應的引物和單核苷三磷酸。2、 向19 uLPCR產物中加入6 uL酶消化液(2.5 uL IOX堿性磷酸酶反應 緩沖液，1單位堿性磷酸酶，10單位核酸外切酶I)于37t反應45分鐘，再于95°C 加熱15分鐘使酶失活。3、 單堿基延伸單堿基延伸對應序列1中的CpG位點1。單堿基延伸總體積IO wL，含5 uL 酶消化過的PCR產物，10 uM熒光素標記的dGTP， 1.25單位Taq聚合酶，4 uM 甲基化特異性的引物3或去甲基化特異性的引物4。引物3序列5， -TTTTTTTGTTTGGAAAGATATC-3，，引物4序列5， -TTTTTTTGTTTGGAAAGATATT-3，。在表層覆蓋一層礦物油，反應條件94°C、 l分鐘變性一40個循環94°C、 20 秒，56°C、 30秒，72°C、 30秒。五、 熒光光譜測定先對單堿基延伸產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。除去 油層后，加入2 uL酶消化液(1 uL IOX堿性磷酸酶反應緩沖液，1單位堿性磷 酸酶)，在37匸反應20分鐘，接著65'C反應20分鐘使酶失活。向含有PFP1 (0. 25 uM)的lmLN-2-羥乙基哌嗪-N， -2-乙磺酸緩沖液(HEPES， 25 raM， pH8)力口2 uL 酶處理的反應液，掃描熒光光譜，激發波長為380納米。圖3為分別用引物3和引物4做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物3時有 顯著的能量轉移而使用引物4時只出現了背景信號，說明目標CpG位點上是甲基化 的。實施例2、 PFP1在質粒1甲基化檢測中的應用一、 PFP1的合成 同實施例1的步驟一。二、 亞硫酸氫鈉處理將500 ng質粒l按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4TM呆存。三、 PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 單堿基延伸反應 同實施例l的步驟四。五、 熒光光譜測定 同實施例1的步驟五。圖4為分別用引物3和引物4做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物4時有 顯著的能量轉移而使用引物3時只出現了背景信號，說明目標CpG位點上是去甲基 化的。實施例3、 PFP1在質粒1和質粒2混合物甲基化檢測中的應用一、 PFP1的合成 同實施例1的步驟一。二、 亞硫酸氫鈉處理將質粒1和質粒2混合，質粒1和質粒2的質量比為1: 1。將500 ng混合物 按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，用瓊 脂糖包埋，并在4'C保存。三、 PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 單堿基延伸反應 同實施例1的步驟四。五、 熒光光譜測定 同實施例1的步驟五。圖5為分別用引物3和引物4做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物3和4 時均出現顯著的能量轉移，說明目標CpG位點上是部分甲基化的。 實施例4、 PFP2在質粒2甲基化檢測中的應用<formula>formula see original document page 11</formula>一、PFP2的合成PFP2的結構如式(III)所示，合成方法如下 1,4-苯二硼酸新戊二酯的制備同實施例1中的步驟一。向50mL的單口瓶加入lOmL干燥的四氫呋喃和0. 65克2， 7-二溴荷(鄭州太平洋 化源公司)，低溫冷卻至-78。C后加入2mL 2M丁基鋰溶液(Alfa Aesar公司)低溫攪 拌1小時，加入0.67克l,6-二碘己烷(北京偶合公司)于室溫反應過夜，結束反應。 向反應液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有機層經水洗、無水硫酸鎂干燥后蒸除 溶劑，硅膠柱分離(石油醚/乙酸乙酯20/1，體積/體積)得到0. 6克2， 7-二溴-9， 9-二(6-碘己基)芴。'H臓(400 MHz， CDC1》:5 (ppm) 7.82(d，2H)， 7.42(m，4H)， 3. 29 (m， 4H) ， 2. 06(m，4H)， 1.67(m，4H)， 1.22(m，8H)， 0. 69(m，4H)。向25 mL的二口瓶中加入6 mL四氫呋喃和3 mL 2M碳酸鈉，鼓入氮氣30分鐘 后，加入390毫克2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴，182毫克1， 4-苯二硼酸新戊二 酯和23毫克四(三苯基膦)鈀，于氮氣下8(TC攪拌反應48小時，冷卻后加入氯仿和 水，取氯仿層水洗后用無水硫酸鎂干燥，旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到230毫克淺黃 色固體。將固體溶于25毫升二氯甲烷，加入1毫升33%三甲胺醇溶液于室溫攪拌 24小時后離心，收集沉淀并干燥，得到222毫克聚合物PFP2。 #n = 4. 1X104。 醒R(400 MHz， DMSO): 醒R(400 MHz， DMSO): S (ppm) 7. 3—8. 0 (IOH， m)， 2. 9-3. 2(22H，m) ， 2. 2-2. 3 (4H， m) ， 1. 5-1. 6 (4H, m) ， 0. 9-1. 2 (12H， m)。二、 亞硫酸氫鈉處理將500 ng質粒2按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4C保存。三、 PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 單堿基延伸反應1、 先對PCR產物進行酶消化處理以除去未反應的引物和單核苷三磷酸。2、 向19 uL PCR產物中加入6 nL酶消化液(2.5 uL IOX堿性磷酸酶反應 緩沖液，1單位堿性磷酸酶，10單位核酸外切酶I)于37"C反應45分鐘，再于95°C 加熱15分鐘使酶失活。3、 單堿基延伸單堿基延伸對應序列1中的CpG位點2。單堿基延伸總體積IO uL，含5 yL 酶消化過的PCR產物，10 uM熒光素標記的dGTP， 1.25單位Taq聚合酶，4 uM甲基化特異性的引物5或去甲基化特異性的引物6。在表層覆蓋一層礦物油，反應條件94°C、 l分鐘變性一40個循環94°C、 20 秒，55°C、 30秒，72°C、 30秒。引物5序列5' -TTTTAGGGGTGTTATATTC-3，， 引物6序列5， -TTTTAGGGGTGTTATATTT-3，。 五、熒光光譜測定先對單堿基延伸產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。除去 油層后，加入2 iiL酶消化液(1 uL IOX堿性磷酸酶反應緩沖液，1單位堿性磷 酸酶)，在37。C反應20分鐘，接著85。C反應10分鐘使酶失活。向含有PFP2 (0. 25 uM)的lmLN-2-羥乙基哌嗪-N， -2-乙磺酸緩沖液(HEPES， 25 raM， pH8)力[]2 uL 酶處理的反應液，掃描熒光光譜，激發波長為380納米。圖6為分別用引物5和引物6做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物5時有 顯著的能量轉移而使用引物6時只出現了背景信號，說明目標CpG位點上是甲基化 的。實施例5、 PFP2在質粒1甲基化檢測中的應用一、 PFP2的合成 同實施例4的步驟一。二、 亞硫酸氫鈉處理將500 ng質粒l按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4r保存。三、 進行PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 進行單堿基延伸反應 同實施例4的步驟四。五、 熒光光譜測定 同實施例4的步驟五。圖7為分別用引物5和引物6做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物6時有 顯著的能量轉移而使用引物5時只出現了背景信號，說明目標CpG位點上是去甲基 化的。實施例6、 PFP2在質粒1和質粒2混合物甲基化檢測中的應用一、 PFP2的合成 同實施例4的步驟一。二、 亞硫酸氫鈉處理將質粒1和質粒2混合，質粒1和質粒2的質量比為1: 1。將500 ng混合物 按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，用瓊 脂糖包埋，并在4'C保存。三、 進行PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 進行單堿基延伸反應 同實施例4的步驟四。五、 熒光光譜測定 同實施例4的步驟五。圖8為分別用引物5和引物6做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物5和6 時均有顯著的能量轉移，說明目標CpG位點上是部分甲基化的。 實施例7、 PFP3在質粒2甲基化檢測中的應用<formula>formula see original document page 14</formula>式(IV) 一、PFP3的合成PFP3的結構如式(IV)所示，合成方法如下 1，4-苯二硼酸新戊二酯的制備同實施例1中的步驟一。向50mL的單口瓶加入lOmL干燥的四氫呋喃和0. 65克2， 7-二溴荷(鄭州太平洋 化源公司)，低溫冷卻至-78。C后加入2mL 2M丁基鋰溶液(Alfa Aesar公司)低溫攪 拌1小時，加入0.46克1,5-二溴戊垸(北京偶合公司)于室溫反應過夜，結束反應。 向反應液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有機層經水洗、無水硫酸鎂干燥后蒸除 溶劑，硅膠柱分離(石油醚/乙酸乙酯20/1，體積/體積)得到0. 5克2， 7-二溴-9, 9-二 (5-溴戊基)芴。!H NMR(400 MHz， CDC13): 5 (ppm) 7. 82 (d， 2H) ， 7. 42 (m， 4H)，3.29(m，4H)， 2.06(m,4H)， L67(m，4H)， 1.22(m，4H)， 0.69(m，4H)。向25 mL的二口瓶中加入4. 5 mL甲苯和3 mL 2M碳酸鈉，鼓入氮氣30分鐘 后，加入390毫克2，7-二溴-9，9-二(5-溴戊基)芴，182毫克1， 4-苯二硼酸新戊二 酯和23毫克二氯(1，1， -二茂鐵磷酸)鈀(鄭州太平洋化源公司)，于氮氣下9(TC 攪拌反應20小時，冷卻后加入氯仿和水，取氯仿層水洗后用無水硫酸鎂千燥，旋 蒸濃縮，丙酮沉淀，得到196毫克棕色固體。將固體溶于20毫升二氯甲烷，加入l 毫升33%三甲胺醇溶液于室溫攪拌24小時后離心，收集沉淀并干燥，得到201毫 克聚合物PFP3。 #n = 2. 7X104。 'H醒R(400 MHz， DMSO): S —) 7. 3-8. 0 (IOH， m)， 2. 9—3. 2 (22H， m) ， 2. 2-2. 3 (4H， m) ， 1. 5—1, 6 (4H， ra) ， 0. 9—1. 2 (8H， m)。二、 亞硫酸氫鈉處理將500 ng質粒2按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4'C保存。三、 進行PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 單堿基延伸反應1、 先對PCR產物進行酶消化處理以除去未反應的引物和單核苷三磷酸。2、 向38 pL PCR產物中加入12 uL酶消化液(5 y L IOX堿性磷酸酶反應 緩沖液，2單位堿性磷酸酶，20單位核酸外切酶I)于37'C反應45分鐘，再于95°C 加熱15分鐘使酶失活。3、 單堿基延伸單堿基延伸對應序列1中的CpG位點3。單堿基延伸總體積IO uL，含5 pL 酶消化過的PCR產物，10 uM熒光素標記的dGTP， 1.25單位Taq聚合酶，4 uM 甲基化特異性的引物7或去甲基化特異性的引物8。在表層覆蓋一層礦物油，反應條件94°C、 l分鐘變性一40個循環94°C、 20 秒，58°C、 30秒，72°C、 30秒。引物7序列5， -TTTTAGAGGATTTGAGGGATAGGGTC-3，，引物8序列5， -TTTTAGAGGATTTGAGGGATAGGGTT-3，。五、 熒光光譜測定先對單堿基延伸產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。除去 油層后，加入2 uL酶消化液(1 uL IOX堿性磷酸酶反應緩沖液，1單位堿性磷酸酶)，在37T:反應20分鐘，接著85。C反應10分鐘使酶失活。向含有PFP3 (0. 25 uM)的lmLN-2-羥乙基哌嗪-N， -2-乙磺酸緩沖液(HEPES， 25 mM， pH8)加2 yL 酶處理的反應液，掃描熒光光譜，激發波長為380納米。圖9為分別用引物7和引物8做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物7時有 顯著的能量轉移而使用引物8時只出現了背景信號，說明目標CpG位點上是甲基化 的。實施例8、 PFP3在質粒1甲基化檢測中的應用一、 PFP3的合成 同實施例7的步驟一。二、 亞硫酸氫鈉處理將500 ng質粒1按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨 基轉變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4'C保存。三、 進行PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 進行單堿基延伸反應 同實施例7的步驟四。五、 熒光光譜測定 同實施例7的步驟五。圖10為分別用引物7和引物8做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物8時 有顯著的能量轉移而使用引物7時只出現了背景信號，說明目標CpG位點上是去甲 基化的。實施例9、 PFP3在質粒1和質粒2混合物甲基化檢測中的應用一、 PFP3的合成 同實施例7的步驟一。二、 亞硫酸氫鈉處理將質粒1和質粒2混合，質粒1和質粒2的質量比為1: 1。將500 ng混合物 按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，用瓊 脂糖包埋，并在4'C保存。三、 進行PCR擴增 同實施例1的步驟三。四、 進行單堿基延伸反應 同實施例7的步驟四。五、 熒光光譜測定同實施例7的步驟五。圖11為分別用引物7和引物8做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物7和8 時均有顯著的能量轉移，說明目標CpG位點上是部分甲基化的。 實施例IO、 PFP4在基因組DNA甲基化檢測中的應用 一、PFP4的合成<formula>formula see original document page 17</formula>PFP4的結構如式(V)所示，合成方法如下 1，4-苯二硼酸新戊二酯的制備同實施例1中的步驟一。向50mL的單口瓶加入lOmL干燥的四氫呋喃和0. 65克2， 7-二溴芴(鄭州太平洋 化源公司)，低溫冷卻至-78。C后加入2mL 2M丁基鋰溶液(Alfa Aesar公司)低溫攪 拌1小時，加入0.52克l,7-二溴庚垸(北京偶合公司)于室溫反應過夜，結束反應。 向反應液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有機層經水洗、無水硫酸鎂干燥后蒸除 溶劑，硅膠柱分離(石油醚/乙酸乙酯20/1，體積/體積)得到0. 7克2， 7-二溴-9， 9-二(7-溴庚基)芴。'H麗R(400 MHz，CDCl3): S (ppm) 7, 82(d，2H)， 7. 42(m, 4H)， 3. 29(m，4H)， 2. 06(m，4H)， 1,67(m，4H)， 1. 22 (m， 12H) ， 0. 70(m, 4H)。向25 mL的二口瓶中加入5 mL四氫呋喃和2. 5 mL 2M碳酸氫鈉，鼓入氮氣30 分鐘后，加入339毫克2，7-二溴-9，9-二(7-溴庚基)笏，151毫克1， 4-苯二硼酸新 戊二酯和20毫克二氯(1，1' -二茂鐵磷酸)鈀(鄭州太平洋化源公司)，于氮氣下 85t:攪拌反應20小時，冷卻后加入氯仿和水，取氯仿層水洗后用無水硫酸鎂干燥， 旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到233毫克淺黃色固體。將固體溶于30毫升二氯甲烷， 加入1.5毫升三乙胺于室溫攪拌24小時后離心，收集沉淀并干燥，得到228毫克聚合物PFP4。 # = 1. 9X 104。力NMR(400 MHz， DMSO): S (ppm) 7. 3-8. O(IOH， m)， 2. 9—3. 2(16H，m) ， 2. 2-2. 3 (4H， m) ， 1. 5—1. 6 (4H, m), 0. 9—1. 2 (34H， m)。二、 細胞培養及基因組DNA提取將癌細胞株HT29在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中于含5% 0)2的37°C 培養箱中培養至生長對數期，胰酶消化，加入含血清的培養液并使細胞脫壁形成懸 浮液，離心收集細胞并按照常規方法提取基因組DNA。三、 亞硫酸氫鈉處理將750 ng HT29的基因組DNA按文獻處理，使所述待測DNA中未發生甲基化的 胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，用瓊脂糖包埋，并在4'C保存。四、 Nested-PCR擴增按常規nested-PCR反應進行擴增。以HT29的基因組DNA為模板進行第一輪PCR (697bp)，反應條件如下 引物9序列(正義引物)5， -GAGGGGGTAGGGGGATAT-3，， 引物10序列(反義引物):5， -ACCAATCAACCAAAAACTCCATACTA-3，。 94°C、 2分鐘變性一35個循環94°C、 30秒，56°C、 45秒，72°C、 45秒。 以第一輪PCR擴增的產物為模板進行第二輪PCR (290 bp)，反應條件如下 引物ll序列(正義引物):5， -GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTT-3，， 引物12序列(反義引物)5， -CCCACCCTCTAATAACCAACCAA-3，。 94°C、 2分鐘變性—35個循環94°C、 30秒，58°C、 45秒，72°C、 45秒。 對擴增產物進行測序，擴增出序列表中序列2所示的核苷酸序列。五、 單堿基延伸反應1、 先對PCR產物進行酶消化處理以除去未反應的引物和單核苷三磷酸。2、 向15 uL PCR產物中加入5 "L酶消化液(2 p L IOX堿性磷酸酶反應緩 沖液，l單位堿性磷酸酶，IO單位核酸外切酶I)于37"C反應45分鐘，再于95" 加熱15分鐘使酶失活。3、 單堿基延伸單堿基延伸對應自序列2的5'末端第190-191位核苷酸中的CpG位點。單堿 基延伸總體積IO PL，含5 iiL酶消化過的PCR產物，10 uM熒光素標記的dGTP， 1.25單位Taq聚合酶，4 u M甲基化特異性的引物3或去甲基化特異性的引物4。在表層覆蓋一層礦物油，反應條件94°C、 l分鐘變性一50個循環94°C、 20秒，56°C、 30秒，72°C、 30秒。引物3序列5， -TTTTTTTGTTTGGAAAGATATC-3'， 引物4序列5， -TTTTTTTGTTTGGAAAGATATT-3'。 六、熒光光譜測定先對單堿基延伸產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。除去 油層后，加入2 uL酶消化液(1 PL IOX堿性磷酸酶反應緩沖液，1單位堿性磷 酸酶)，在37。C反應30分鐘，接著85t:反應10分鐘使酶失活。向含有PFP4 (0. 25 uM)的lmL HEPES緩沖液(25 mM， pH 8)加2 u L酶處理的反應液，掃描熒光光 譜，激發波長為380納米。圖12為分別用引物3和引物4做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物3有 顯著的能量轉移而使用引物7時的熒光信號接近于背景信號，說明目標CpG位點上 是甲基化的。實施例11、 PFP5在基因組DNA甲基化檢測中的應用PFP5一、PFP5的合成PFP5的結構如式(VI)所示，合成方法如下1,4-苯二硼酸新戊二酯的制備同實施例1中的步驟一。向50mL的單口瓶加入10mL干燥的四氫呋喃和0. 65克2， 7-二溴荷(鄭州太平洋 化源公司)，低溫冷卻至-78t:后加入2mL 2M丁基鋰溶液(Alfa Aesar公司)低溫攪 拌1小時，加入0.54克l，8-二溴辛烷(北京偶合公司)于室溫反應過夜，結束反應。 向反應液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有機層經水洗、無水硫酸鎂干燥后蒸除 溶劑，硅膠柱分離(石油醚/乙酸乙酯20/1，體積/體積)得到0. 7克2, 7-二溴-9， 9-二(8-溴辛基)荷。^ NMR(400 MHz， CDCL): S (ppra) 7. 82(d, 2H)， 7.43(m，4H)， 3. 29(m, 4H)， 2. 06(m，4H)， L68(m,4H)， 1.22(m，16H)， 0.71(m，4H)。向25 mL的二口瓶中加入4 mL四氫呋喃和2 mL 2M碳酸鈉，鼓入氮氣30分 鐘后，加入354毫克2， 7-二溴-9， 9-二(8-溴辛基)芴，151毫克1, 4-苯二硼酸新戊 二酯和24毫克二氯(1，1' -二茂鐵磷酸)鈀(鄭州太平洋化源公司)，于氮氣下75 "C攪拌反應28小時，冷卻后加入氯仿和水，取氯仿層水洗后用無水硫酸鎂干燥， 旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到199毫克棕色固體。將固體溶于26毫升二氯甲烷，加 入1毫升三乙胺于室溫攪拌24小時后離心，收集沉淀并干燥，得到201毫克聚合 物PFP5。 #n = 2. 3X104。 'H麗R(400 MHz, DMSO): S (ppm) 7. 3-8. 0(IOH， ra)， 2. 9—3. 2(16H，m)， 2. 2-2. 3他m)， 1. 5—1. 6 (4H， m) ， 0. 9—1. 2 (38H， m)。二、 細胞培養及基因組DNA提取 同實施例IO的步驟二。三、 亞硫酸氫鈉處理 同實施例IO的步驟三。四、 Nested-PCR擴增 同實施例10的步驟四。五、 單堿基延伸反應1、 先對PCR產物進行酶消化處理以除去未反應的引物和單核苷三磷酸。2、 向15 nLPCR產物中加入5 iiL酶消化液(2 yL IOX堿性磷酸酶反應緩 沖液，l單位堿性磷酸酶，IO單位核酸外切酶I)于37'C反應45分鐘，再于95'C 加熱15分鐘使酶失活。3、 單堿基延伸單堿基延伸對應自序列2的5'末端第118-119位核苷酸中的CpG位點。單堿 基延伸總體積IO "L，含5 ixL酶消化過的PCR產物，10 ixM熒光素標記的dGTP， 1.25單位Taq聚合酶，4 W M甲基化特異性的引物5或去甲基化特異性的引物6。在表層覆蓋一層礦物油，反應條件94°C、 l分鐘變性一40個循環94°C、 20 秒，55°C、 30秒，72°C、 30秒。引物5序列5， -TTTTAGGGGTGTTATATTC-3，，引物6序列5， -TTTTAGGGGTGTTATATTT-3'。六、 熒光光譜測定先對單堿基延伸產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。除去 油層后，加入2 PL酶消化液(1 ixL IOX堿性磷酸酶反應緩沖液，1單位堿性磷酸酶)，在37r反應30分鐘，接著85"反應10分鐘使酶失活。向含有PFP5 (0. 25 UM)的lmL HEPES緩沖液(25 mM， pH 8)加2 " L酶處理的反應液，掃描熒光光 譜，激發波長為380納米。圖13為分別用引物5和引物6做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物5時 有顯著的能量轉移而使用引物6時只出現了接近于背景的信號，說明目標CpG位點 發生了甲基化。實施例12、 PFP6在基因組DNA甲基化檢測中的應用一、PFP6的合成<formula>formula see original document page 21</formula> 式(vn)PFP6的結構如式(vn)所示，合成方法如下1，4-苯二硼酸新戊二酯的制備同實施例1中的步驟一。向50mL的單口瓶加入10mL干燥的四氫呋喃和0. 65克2， 7-二溴芴(鄭州太平洋 化源公司)，低溫冷卻至-78'C后加入2mL 2M丁基鋰溶液(Alfa Aesar公司)低溫攪 拌1小時，加入0.44克l，4-二溴丁垸(北京偶合公司)于室溫反應過夜，結束反應。 向反應液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有機層經水洗、無水硫酸鎂干燥后蒸除 溶劑，硅膠柱分離(石油醚/乙酸乙酯20/1，體積/體積)得到0. 6克2， 7-二溴-9， 9-二 (4-溴丁基)芴。'H NMR (400 MHz, CDC13): S (ppm) 7. 82 (d， 2H) ， 7. 42 (m， 4H)， 3.29(m,4H)， 2.06(m，4H)， 1.71(m，4H)， 1.20(m，4H)。向25 mL的二口瓶中加入4 mL四氫呋喃和2 mL 2M碳酸鈉，鼓入氮氣30分 鐘后，加入297毫克2， 7-二溴-9， 9-二(4-溴丁基)芴，151毫克1， 4-苯二硼酸新戊 二酯和24毫克二氯(l，r -二茂鐵磷酸)鈀(鄭州太平洋化源公司)，于氮氣下75 'C攪拌反應28小時，冷卻后加入氯仿和水，取氯仿層水洗后用無水硫酸鎂干燥， 旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到186毫克棕色固體。將固體溶于25毫升二氯甲烷，加 入1毫升三乙胺于室溫攪拌24小時后離心，收集沉淀并干燥，得到171毫克聚合 物PFP6。 # = 2.5X104。 麗(400 MHz， DMSO): S (卯m) 7. 3-8. 0 (IOH， m)，2. 9—3.2(16H,m)， 2. 2—2. 3 (4H， ra) ， 1.5-1.6他m)， 0. 9—1. 2 (22H， m)。二、 細胞培養及基因組DNA提取 同實施例IO的步驟二。三、 亞硫酸氫鈉處理 同實施例10的步驟三。四、 Nested-PCR擴增 同實施例IO的步驟四。五、 單堿基延伸反應1、 先對PCR產物進行酶消化處理以除去未反應的引物和單核苷三磷酸。2、 向15 uLPCR產物中加入5 "L酶消化液(2 u L IOX堿性磷酸酶反應緩 沖液，l單位堿性磷酸酶，IO單位核酸外切酶I)于37"C反應45分鐘，再于95'C 加熱15分鐘使酶失活。3、 單堿基延伸單堿基延伸對應自序列2的5'末端第223-224位核苷酸中的CpG位點。單堿 基延伸總體積IO uL，含5 i^L酶消化過的PCR產物，10 uM熒光素標記的dGTP， 1.25單位Taq聚合酶，4 UM甲基化特異性的引物7或去甲基化特異性的引物8。在表層覆蓋一層礦物油，反應條件94°C、 l分鐘變性一40個循環94°C、 20 秒，58°C、 30秒，72°C、 30秒。引物7序列5， -TTTTAGAGGATTTGAGGGATAGGGTC-3，，引物8序列5， -TTTTAGAGGATTTGAGGGATAGGGTT-3，。六、 熒光光譜測定先對單堿基延伸產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。除去 油層后，加入2 uL酶消化液(1 uL IOX堿性磷酸酶反應緩沖液，1單位堿性磷 酸酶)，在37"C反應30分鐘，接著85'C反應10分鐘使酶失活。向含有PFP6 (0. 25 HM)的lniL HEPES緩沖液(25 mM， pH 8)加2 u L酶處理的反應液，掃描熒光光 譜，激發波長為380納米。圖14為分別用引物7和引物8做單堿基延伸得到的熒光光譜，使用引物7時 有顯著的能量轉移而使用引物8時只出現了接近于背景的信號，說明目標CpG位點 發生了甲基化。實施例13、 PFP2在基因組DNA甲基化檢測中的應用一、 PFP2的合成 同實施例4的步驟一。二、 HT29的培養及基因組DNA提取 同實施例IO的步驟二。三、 亞硫酸氫鈉處理 同實施例10的步驟三。四、 PCR擴增以HT29的基因組DNA為模板，使用引物13和引物14進行第一輪PCR(280bp)， 反應條件如下引物13序列(正義引物):5， -GAAGAAAGAGGAGGGGTTGG-3，， 引物14序列(反義引物)5， -CTACAAACCCTCTACCCACC -3'。 94°C、 2分鐘變性一35個循環94°C、 30秒，56°C、 45秒，72°C、 45秒。 以第一輪PCR擴增的產物為模板(以水為空白對照)，使用甲基化特異性引物對 (引物15和引物16)進行第二輪PCR (234 bp)，反應條件如下引物15序列(正義引物):5， -TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC -3，，引物16序列(反義引物)5， -CCACCTAAATCGACCTCCGACCG-3'。94°C、 2分鐘變性一35個循環94°C、 30秒，65°C、 45秒，72°C、 45秒。反應液含有的dNTPs為10uMdCTP， 10uMdTTP， 10uMdATP， 7.5nMdGTP， 2. 5 u M熒光素標記的dGTP。對擴增產物進行測序，擴增出序列表中序列3所示的核苷酸序列。 以第一輪PCR擴增的產物為模板(以水為空白對照)，使用去甲基化特異性引物 (引物17和引物18)進行第二輪PCR (234 bp)，反應條件如下引物17序列(正義引物)5， -TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT -3，，引物18序列(反義引物):5， -CCACCTAAATCAACCTCCAACCA-3，。94°C、 2分鐘變性一35個循環94°C、 30秒，60°C、 45秒，72°C、 45秒。反應液含有的dNTPs為:10nMdCTP， 10yMdTTP， 10uMdATP， 7. 5uMdGTP， 2. 5 u M熒光素標記的dGTP。五、 熒光光譜測定先對PCR擴增的產物進行酶消化處理以除去未反應的熒光素標記的dGTP。加入 2 UL酶消化液(1 UL10X堿性磷酸酶反應緩沖液，l單位堿性磷酸酶)，在37。C反應30分鐘，接著85"C反應10分鐘使酶失活。向含有PFP2 (0. 4 u M)的lmL HEPES 緩沖液(25mM， pH8)加2 u L酶處理的反應液，掃描熒光光譜，激發波長為380 納米。圖15為用甲基化特異性的引物15和引物16做PCR得到的熒光光譜，以水為 模板無能量轉移現象而以第一輪PCR產物為模板出現顯著的能量轉移，說明癌細胞 HT29的p"啟動子區發生了甲基化。圖16為用去甲基化特異性的引物17和引物18做PCR得到的熒光光譜，以水 或以第一輪PCR產物為模板均無顯著的能量轉移，說明癌細胞HT29的p76啟動子 區去甲基化程度很低即甲基化程度很高。〈110〉中國科學院化學研究所 〈120〉一種檢測DNA甲基化的方法〈130〉CGGNARY81035〈160〉3<210>1 <211〉283 <212>DNA <213>人工序列<400>1gcaggtgggg a.ggagcccag tcctccttcc ttgccaacgc tggctctggc gagggctgct 60tccggctggt gcccccgggg gagacccaac ctggggcgac ttcaggggtg ccacattcgc 120taagtgctcg gagttaatag cacctcctcc gagcactcgc tcacagcgtc cccttgcctg 180gaaagatacc gcggtccctc cagaggattt gagggacagg gtcggagggg gctcttccgc 240cagcaccgga ggaagaaaga ggaggggctg gctggtcacc aga 283<210>2<211>290<212>DNA<213>人屬人(j%m o幼/ j.朋50 <400>2gcaggtgggg aggagcccag tcctccttcc ttgccaacgc tggctctggc gagggctgct 60tccggctggt gcccccgggg gagacccaac ctggggcgac ttcaggggtg ccacattcgc 120taagtgctcg gagttaatag cacctcctcc gagcactcgc tcacagcgtc cccttgcctg 180gaaagatacc gcggtccctc cagaggattt gagggacagg gtcggagggg gctcttccgc 240cagcaccgga gga卿aaga ggaggggctg gctggtcacc agagggtggg 290<210>3<211〉234<212>DNA〈213〉人屬人(/fo/z o鄉ie/ 50 <400>3tcaccagagg gtggggcgga ccgcgtgcgc tcggcggctg cgg卿gggg gagagcaggc 60 agcgggcggc ggggagcagc atggagccgg cggcggggag cagcatggag ccttcggctg 120 actggctggc cacggccgcg gcccggggtc gggtagagga ggtgcgggcg ctgctggagg 180 cgggggcgct gcccaacgca ccgaatagtt acggtcggag gccgatccag gtgg 23權利要求
1、一種檢測DNA甲基化的方法，依次包括以下步驟1)用亞硫酸氫鈉處理待測DNA，使所述待測DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶；2)以步驟1)的DNA為模板進行PCR擴增，并用熒光素標記步驟1)的DNA；3)通過所述熒光素與下述式(I)的化合物熒光共振能量轉移情況確定所述待測DNA的目標CpG位點或序列的甲基化狀態；式(I)；式(I)中，R代表鏈端含有四級胺的直鏈或支鏈的烷基，所述烷基的主鏈長為2-12個碳，X代表鹵素；所述式(I)化合物的數均分子量為5000-100000。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征為所述式(I)中R為6-三甲胺基己基、 6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基 丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一種。
3、 如權利要求l所述的方法，其特征為所述式(I)中X為氯、溴和碘中的任 意一種。
4、 如權利要求l所述的方法，其特征為所述熒光素標記步驟l)的DNA的方法 為用熒光素標記的dGTP對PCR擴增產物進行單堿基延伸。
5、 如權利要求4所述的方法，其特征為所述單堿基延伸中，所用的引物有兩 種甲基化特異引物和去甲基化特異引物；所述甲基化特異引物的3'末端核苷酸為 C，所述去甲基化特異引物的3'末端核苷酸為T;所述引物能與待測DNA的目標CpG 位點前至少15bp序列的對應互補序列特異結合。
6、 如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征為確定所述待測DNA的目標 CpG位點的甲基化狀態的方法為若出現熒光共振能量轉移并且在單堿基延伸中使用 的是甲基化特異引物，則所述待測DNA的目標CpG位點上存在甲基化；若出現熒光共 振能量轉移并且在單堿基延伸中使用的是去甲基化特異引物，則所述待測DNA的目標 CpG位點上存在去甲基化；若兩種引物都出現熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的 目標CpG位點部分甲基化。
7、 如權利要求l所述的方法，其特征為所述熒光素標記步驟l)的DNA的方法 為用熒光素標記的任意一種dNTP對所述步驟1)的DNA的目標序列進行PCR擴增。
8、 如權利要求7所述的方法，其特征為所述PCR擴增中所用的擴增所述目標CpG序列的引物對有兩種甲基化特異引物對和去甲基化特異引物對；甲基化特異引 物對為正義引物和反義引物，所述正義引物和反義引物至少含有三個CG;去甲基化特異引物對為正義引物和反義引物，所述正義引物和反義引物至少含有三個TG。
9、 如權利要求l、 2、 3、 7或8所述的方法，其特征為確定所述待測DNA的目 標CpG序列的甲基化狀態的方法為若出現熒光共振能量轉移并且在PCR擴增中使用 的是甲基化特異引物對，則所述待測DNA的目標CpG序列上存在甲基化；若出現熒光 共振能量轉移并且在PCR擴增中使用的是去甲基化特異引物對，則所述待測DNA的目 標CpG序列上存在去甲基化；若兩種引物對都出現熒光共振能量轉移，則所述待測DNA 的目標CpG序列上部分甲基化。
10、 如權利要求1至9中任一所述的方法，其特征為所述待測DNA是癌細胞或 癌組織的基因組DNA;或所述待測DNA是腫瘤或正常的細胞或組織的基因組DNA、質 粒DNA或合成DNA;所述癌細胞或癌組織來源于肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、淋巴 癌、白血病、膀胱癌、卵巢癌或腎癌。
全文摘要
本發明公開了一種檢測DNA甲基化的方法，本發明提供的方法靈敏度更高，檢測的DNA濃度更低，處理更快捷，更省略了各種分離、純化步驟，能夠方便地檢測到低水平的DNA甲基化。相比于在臨床應用的對樣本質量要求很高的組織學方法，本發明僅需要很少量的DNA，可靈敏地檢測抑癌基因的甲基化水平，在早期癌癥的臨床診斷方面具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK101230399SQ200810055698
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月7日 優先權日2008年1月7日
發明者馮福德, 樹 王 申請人:中國科學院化學研究所