專利名稱：：一種地衣芽孢桿菌菌株及用途和用其生產聚γ-谷氨酸的方法
技術領域：
：本發明涉及芽孢桿菌及其用途，具體地說是地衣芽孢桿菌菌株及用途和用其生產聚Y-谷氨酸的方法。
背景技術：
：地衣芽孢桿菌(Sflc///^丄/c/2em/w7m》是一類自然界廣泛存在的兼性厭氧腐生菌。在工業上常常作為蛋白水解酶、淀粉酶、生物活性劑、抗生素等的生產菌。目前已有研究者采用特定的地衣芽孢桿菌生產聚Y-谷氨酸，如有人采用地衣芽孢桿菌A35生產聚Y-谷氨酸(詳見參考文獻1:ChengC,AsadaY，AaidaT.Productionofy-polyglutamicacidby5"c/〃ws//c/ewi/brw/A35underdenitrifyingconditions.AgricBiolChem，1989，53:2369—2375;)。但采用該菌株生產聚.Y-谷氨酸存在發酵周期長，發酵產率低的缺陷。為了解決這一問題，有研究者公開了一種采用地衣芽孢桿菌(凡ATCC9945A)生產聚Y-谷氨酸的方法(詳見參考文獻USPatent5378807，1995;YoonSH，DOJH，LeeSY.Productionofpoly-y-glutamicaddbyfed-batchcultureof5ac///ws//c/^w/o/TmiBiotechnologyLetters，2000,22:585—588)。上述方法雖然對聚，谷氨酸的產量有所提高，但其在發酵過程中需添加高濃度的甘油，故其生產成本高。由于聚，谷氮酸[Poly(Y-glutamicacid),PGA](以下簡稱y-PGA))在醫藥、工業、農業等領域具有廣闊的應用前景，因此，發明一株具有良好生產Y-PGA特性的地衣芽孢桿菌就具有非常重要的意義。
發明內容本發明目的就是要提供一種可克服現有地衣芽孢桿菌菌株缺陷的新地衣芽孢桿菌菌株，同時提供一種該菌株的用途以及用該菌株生產聚，谷氨酸的方法。本發明的目的是這樣實現的本發明所提供的新的地衣芽孢桿菌菌株，其保藏名稱為一株地衣芽孢桿菌WX-02，保藏單位在CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M208065。保藏日期2008年4月28日。本發明的菌種的分離與篩選方法是稱取湖北應城鹽礦高鹽環境土樣lg于滅菌試管中，加無菌水9mL，用棉塞封口，振蕩2min，然后放水浴鍋中，8(TC加熱10分鐘，再靜置30min。冷卻后，吸取上清液O.lmL，稀釋l(T2，l(T3，分別取0.2mL，涂布LB平板，37。C培養48h觀察結果，挑選在LB培養基上呈乳液狀能拉絲的單菌落，接入新鮮液體種子培養基中，37t:搖床培養12h后，按2%的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發酵培養基的250mL搖瓶中，37°C，190r/min，振蕩培養36h結束發酵。對發酵產物分別取樣離心除去菌體，用3倍乙醇沉淀上清液，輕輕振蕩后12000r/min離心15min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸餾水溶解沉淀物，透析去除離子，利用HPLC檢測產物。將篩選到的菌株按照規定方法進行菌種鑒定。本發明所提供的新地衣芽孢桿菌菌株菌f直桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢近似圓形，偏端生。在LB固體培養基上菌落圓形，邊緣不齊，毛發狀，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰白色。最適生長溫度30-37"，適宜pH6.8-7.2。接觸酶實驗陽性，硝酸鹽利用陽性，檸檬酸鹽利用陽性，明膠液化實驗陽性。本發明所提供的新地衣芽孢桿菌菌株16SrRNA基因序列有1263個堿基，經采用Genebank登記號EU564336對比16SrRNA分子鑒定與前面的生理生化鑒定結果結合分析，鑒定為芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌。本發明的第二個目的是提供一種該地衣芽孢桿菌菌株的用途，即該菌株用于生產聚Y-谷氨酸。本發明同時提供了一種用該菌株生產聚Y-谷氨酸的方法。該方法包括以下步驟a、采用地衣芽孢桿菌WX-02、保藏單位CCTCC、保藏編號為CCTCCNO:M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作為生產菌株；b、將上述WX-02菌株接在LB培養基固體斜面上3(TC-37。C培養；刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；一60一70。C冷凍保藏；C、制備種子液(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，'3(TC-37'C培養24-36小時，使其活化；LB固體培養基的優選配方為蛋白胨1-10克/升、酵母浸出物l-5克/升、NaCll-10克/升、瓊脂10-20克/升，pH6.0-8.0。LB固體培養基更為優選配方為蛋白胨'3-5克/升、酵母浸出物3-5克/升、NaCl5-10克/升、瓊脂15-20克/升、pH6.0-8.0。(2)將上述活化的種子轉接到LB液體種子培養基中，30°C-37°C，200rpm培養14-16小時至對數生長中期；d、發酵培養(1)按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉7-100克；碳源10-100克；無機氮源3-20克；K2HP04'3H200.1-2克；MgS04'7H200.1-2克；FeCl3'6H200.01-0.1克；CaCl2.2H200.1-2克；MnS040.01-0.2克；ZnS040.1-2克，補充蒸餾水至lOOOmL，pH6.0-7.5;.(2)按50-100mL/500mL三角瓶的裝液量，投入上述培養基，121°C，30min滅菌后，接種量為1-5%,30-37。C培養24-48小時；或按發酵罐容積的40-80%投入上述發酵培養基，以0.07-0.1Mpa高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至30°C-37°。接入種子液；在30。C-37。C條件下培養，通氣量l:0.5-2(v/v);其中谷氨酸鈉的優選含量為20-100克/升。發酵培養基中的無機氮源優選硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨、或硝酸鈉。無機氮源含量優選5-20克/升。培養基中的碳源優選葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉、或淀粉水解液。碳源含量優選30-100克/升。e、提取將d步驟所述的菌株培養液深層發酵24-48小時；離心除去菌體、收集上清液，并用95%的乙醇沉淀、回收聚-Y-谷氨酸。本發明所提供的地衣芽孢桿菌菌株wx-02在用于生產聚Y-谷氨酸時，其效果明顯優于現已知的地衣芽孢桿菌菌株。其總體表現在以下幾個方面(1)發酵周期短，生產效率高本發明的菌株在實驗室3L發酵罐中發酵周6期為28-36小時，聚Y-谷氨酸產量可達到42g/L;在中試3000L發酵罐產量達到35.05g/L,擴大過程中產量穩定。(2)發酵工藝相對簡單如不需要補料控制及溫度、pH值的控制。發酵過程中不起泡，不需要控制泡沫，不會發生逃液及染菌現象。(3)生產成本低培養基中不需要添加甘油和有機氮源，發酵成本低，培養基無色透明，易于產物分離提取。(4)遺傳穩定性好。該菌株遺傳操作簡單，可制備高感受態細胞，轉化效率高。遺傳性能穩定，連續傳代20次以上，該菌株合成聚，谷氨酸的能力不變。本發明用于生產聚Y-谷氨酸時發酵周期短、生產效率高的有益效果通過以下對比試驗得到驗證試驗材料試驗組采用本發明菌株，生產聚Y-谷氨哮的方法采用本發明實施例4所述方法；對照組采用參考文獻1所述的地衣芽孢桿菌菌株及其生產聚Y-谷氨酸的方法。試驗結果對比見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖h是本發明菌株生產聚-Y-谷氨酸發酵產物水解樣品的HPLC分析圖譜。(保留時間為2.74分鐘的峰為聚Y-谷氨酸的水解產物谷氨酸的峰)具體實施例方式以下通過實施例對本發明進行詳細說明，但所有實施例并不對本發明構成任何限制。實施例1:本發明菌株的分離、篩選稱取湖北應城鹽礦高鹽環境土樣lg于滅菌試管中，加無菌水9mL，用棉塞封口，振蕩2min，然后放水浴鍋中，8(TC加熱10分鐘，再靜置30min。冷卻后，吸取上清液0.1mL，稀釋10-2，10-3，分別取0.2mL,涂布LB平板，37。C培養48h觀察結果，挑選在LB培養基上呈乳液狀能拉絲的單菌落，接入新鮮液體種子培養基中，37。C搖床培養12h后，按2%的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發酵培養基的250mL搖瓶中，3'7"C，190r/min，振蕩培養36h結束發酵。對發酵產物分別取樣離心除去菌體，用3倍乙醇在沉淀上清液，輕輕振蕩后12000r/min離心15min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸餾水溶解沉淀物，透析去除離子，利用HPLC檢測產物。實施例2:本發明菌株的鑒定生理生化鑒定菌體直桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢近似圓形，偏端生。在LB固體培養基上菌落圓形，邊緣不齊，毛發狀，菌苔干燥，.不透明，蔓延，灰白色。最適生長溫度30-37r，適宜pH6.8-7.2。接觸酶實驗陽性，硝酸鹽利用陽性，擰檬酸鹽利用陽性，明膠液化實驗陽性。利用16SrRNA基因序列分析進行菌種鑒定地衣芽孢桿菌WX-02基因組DNA抽提將地衣芽孢桿菌WX-02在LB(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaC110克/升、瓊脂15克/升、pH7.0)平板上劃線，置37。C過夜培養后，挑取少量菌體，轉接于LB搖瓶培養液，于37"C以l卯r/min振蕩培養到OD600的值約為0.20.3;離心收集所有菌體，以STE(100mmol/LNaCl,10mmol/LTris'HCl，pH8.0，lmmol/LEDTA)洗滌菌體1次；加100pL溶液1(50mmol/L蔗糖，25mmol/LTris.HCl，pH8.0，10mmol/LEDTA)懸浮菌體，再加30mg/mL的溶菌酶20pL，冰浴上放置過夜；力日200inL2%SDS，輕緩混勻后置6(TC水浴上30min;加100|liL溶液5MNaCl，輕緩混勻后置冰浴上放10min;以12000r/min離心5min，吸取上清液到一個新的Eppendorf管，用苯酚氯仿異戊醇溶液(24:24:1,v/v)抽提2次；上清液加2倍體積的95%乙醇，于室溫下放510min后，把溶液吸除后，以12000r/min離心5min，棄上清液，再用70%乙醇離心洗滌沉淀1次；真空干燥沉滌，用20jiLddH20，加入10mg/mL的RNase溶液l2)LiL,混勻后置37°C0.5h以上，即為制備的總DNA溶液。16SrRNA基因序列的PCR擴增弓I物由北京奧科生物技術公司合成。原核生物16SrDNA擴增通用引物Primer1:5'隱AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'Primer2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA陽3'反應體系PCR反應體系:模板DNA(l-3ug)1uL10Xbuffer(含Mg2+)2.5uLdNTPGOmmol/L)2.5uLPrimer1(lOumol/L)luLPrimer2(10umol/L)luLLyDNA聚合酶0.25uLddHzO16.75uLTotal25uL擴增條件9fC預變性5分鐘；94'C變性1分鐘、57匸退火1分鐘、72'C延伸1.5分鐘、28個循環；72'C補平末端5分鐘；4'C保溫1分鐘。16SrRNA基因序列PCR擴增產物的純化參照上海華舜生物生物工程有限公司的小量膠回收試劑盒對PCR產物進行回收。16SrRNA基因測序純化后的產物測序委托北京奧科生物技術公司測序，測序所得聚"谷氨酸產生菌Zic/^m/ww/sWX-0216SrRNA基因序列有1263個堿基，Genebank登記號EU564336，測得的16SrRNA序列輸入GenBank，EMBL,DDBJ等數據庫用BLAST軟件進行比對處理，同//c/zew/om/jCICC10103(Genebank登記號DQ212969.1)同源性達到100%。結合16SrRNA分子鑒定與前面的生理生化鑒定結果，鑒定WX-02為芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌。質粒檢測將5ac/〃w丄/c/7em/w7w、WX-02在LB上劃線，置37。C過夜培養后，挑取少量菌體，轉接于5mLLB試管培養液，于3(TC以190r/min振蕩培養到OD600的值約為0.20.3;離心收集所有菌體，以STE(100mmol/LNaCl，lOmmol/LTris.HCl，pH8.0，lmmol/LEDTA)洗滌菌體1次；加100|uL溶液1(50mmol/L蔗糖，25mmol/LTris.HCl,pH8.0，10mmol/LEDTA)懸浮菌體，再加30mg/mL的溶菌酶20pL，冰浴上放置lh以上；力H200jiL新鮮配制的溶液II(0.2mol/LNaOH,l°/oSDS)，輕緩混勻后置冰浴中5min;加150溶液III(50mol/LKAc60mL，冰乙酸11.5mL，ddH2028.5mL)，混勻后置冰浴上放5min;以12000r/min離心5min，吸取上清液到一個新的Eppendorf管，用苯酚氯仿異戊醇溶液(24:24:1,v/v)抽提1次；上清液加2X體積的95%乙醇，于室溫下放510min后，以12000r/min離心5min，棄上清液，再用70%乙醇離心洗滌沉滌1次；真空干燥沉滌，用20fiLTE溶液(lmmol/LEDTA，10mmol/LTris.HCl，pH8.0)溶解沉淀，加入10mg/mL的RNase溶液l2iLiL，混勻后置37。C放置0.5h以上，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經過5次重復未檢測到質粒。高感受態細胞制備地衣芽孢桿菌感受態制備用培養基10x最低鹽溶液K2HP0414g、KH2P046亭、(NH4)2S042g、Na3C6H507'2H20lg、MgSO(7H2O0.2g，在蒸餾水中依次溶解，加水至100ml。L-trp:2mg/mL，貯于棕色試劑瓶內，過濾滅菌，用黑紙包裹保存。葡萄糖50%，過濾滅菌。GMI溶液lx最低鹽溶液95ml、50%葡萄糖1ml、5°/。酸水解酪蛋白0.4ml、10%酵母汁1ml、2mg/mLL-trp2.5ml。GMII溶液lx最低鹽溶液97.5ml、50%葡萄糖1ml、5%酸水解酪蛋白0.0810ml、10%酵母汁0.04ml、0.5MMgCl20.5ml、0.1MCaCl20.5ml、2mg/mlL-trp0.5ml。LB平板上活化SacZ〃w丄/c/^m/wvw;yWX-02;接種于5mlGMI溶液，在37'C慢搖床(100r/min)振蕩培養過夜；次日取2ml轉接到18mlGMl溶液中，37"C快搖床(200r/min)培養3.5h;再取10ml.轉接到90mlGMII溶液中，37°C搖床培養90min,離心收集菌體；用10ml上清液懸浮菌體，并加30%的滅菌甘油至10%，混勻后分裝1.5ml離心管中，隨即放到-7(TC冰箱保存；用于直接轉化時不加甘油，在0.5ml菌液中加入適量DNA(1昭/ml)于37'C緩慢振蕩保溫30min后涂抗性平板，在37"C培養過夜，次日檢查轉化子。本實驗室構建的整合載體pDG1730-vgb為每次取5線性化質粒轉化0.5mL感受態細胞，質粒濃度為125ng&L，長出的抗性轉化子約50-100個/平板，則整合效率約80-160個轉化子/嗎質粒。經PCR鑒定，都是陽性克隆。實施例3采用本發明菌株所生產的聚7-谷氨酸的產量測定用本發明菌株所生產的聚Y-谷氨酸其定量分析由HPLC完成，色譜柱AgilentIIOO，流動相為100mmol丄"KH2POj[]5.0%甲醇(用磷酸調pH值至2.5)過濾，超聲波除氣，紫外檢測波長為210nm，流速為lmL/min,谷氨酸作為定量的標準物。具體測定步驟如下取5毫升發酵離心上清液，加3倍體積酒精沉淀PGA，溶解產物，加等體積濃鹽酸真空條件下110"C水解24h，水解后把水解液加10mol丄"NaOH中和定容，經0.22pm膜過濾，測定谷氨酸的含量，聚Y-谷氨酸濃度-水解后谷氨酸濃度*129/147。詳見圖1所示結果。'實施例4聚Y-谷氨酸的發酵生產a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種；b、斜面菌種活化將冷凍保藏的菌種(本發明菌株WX-02)，接種到LB固體培養基斜面(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaC110克/升、瓊脂20克/升、pH7.0)，3(TC-37。C培養24-36小時。刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-70"冷凍保藏；c、種子液培養將上述冷凍保藏的菌種子轉接到LB固,體培養基平板上，3(TC-37。C培養24-36小時，使其活化；將活化的種子轉接到三角瓶液體種子培養基中(蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl10克/升、pH7.0)，30°C-37°C，200rpm培養14-16小時至對數生長中期；d搖瓶發酵培養按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉10克；葡萄糖10克；氯化銨3克；K2HP04'3H200.1克；MgS04'7H200.1克；FeCl3'6H200.01克；CaCl2'2H2O0.1克；MnSO40.01克;ZnS040.1克，補充蒸餾水至1000mL，pH7.5，配置210mL發酵液分裝500mL三角瓶，每瓶裝液量70mL，以121。C高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37'C按照1%的接種量接入種子液，搖床轉速180rpm，發酵溫度37。C，通氣量l:0.5-2(v/v)，發酵至36小時結束發酵。e、提取將上述發酵液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收聚-Y-谷氨酸。采用實施例3所述方法，檢測分析所得到的聚Y-谷氨酸，其濃度為8g/L。實施例5聚Y-谷氨酸的發酵生產a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種；b、斜面菌種活化'將冷凍保藏的菌種(本發明菌株WX-02)，接種到LB固體斜面(含蛋白胨5克/升、酵母浸出物3克/升、NaC15克/升、瓊脂15克/升、pH6.0)，30°C-37"C培養36小時。c、種子液培養同實施例4。d、搖瓶發酵培養按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉30克；蔗糖30克;硫酸銨10克；K2HPO4'3H2O0.5克；MgS04'7H200.5克；FeCl3'6H200.05克；CaCl2'2H200.5克；MnSO40.5克;ZnS040.6克，補充蒸餾水至lOOOmL，pH7.5，配置210mL發酵液分裝500mL三角瓶，每瓶裝液量70mL，以121。C高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37t:按照1%的接種量接入種子液，搖床轉速180rpm,發酵溫度37X:，通氣量h0.5-2(v/v)，發酵至24小時結束發酵。e、同實施例4采用實施例3所述方法，檢測分析所得到的聚Y-谷氨酸，其濃度為15g/L。實施例6聚Y-谷氨酸的發酵生產a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種；b、斜面菌種活化將冷凍保藏的菌種(本發明菌株WX-02)，接種到LB固體斜面(含蛋白胨1克/升、酵母浸出物1克/升、NaCll克/升、瓊脂10克/升、pH8.0),30°C-37'C培養24小時。c、種子液培養同實施例4。d、搖瓶發酵培養按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉50克；葡萄糖60克；氯化銨12克；K2HPO4'3H2O0.8克；MgS04'7H200.8克；FeCl3'6H200.06克；CaCl2'2H200.8克；MnSO40.08克;ZnS041.0克，補充蒸餾水至1000mL，pH7.5，配置210mL發酵液分裝500mL三角瓶，每瓶裝液量70mL，以121。C高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37'C按照2%的接種量接入種子液，搖床轉速180rpm，發酵溫度37°C，發酵至48小時結束發酵。e、同實施例4采用實施例3所述方法，檢測分析所得到的聚Y-谷氨酸，其濃度為30.8g/L。實施例7聚"谷氨酸的發酵生產a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種；b、斜面菌種活化。將冷凍保藏的菌種(本發明菌株WX-02)，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCllO克/升、瓊脂20克/升、pH6.5)，30。C-37"C培養30小時'。c、種子液培養同實施例4。d、搖瓶發酵培養按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉60克；葡萄糖90克；硝酸銨15克；K2HP04'3H201.5克；MgS04'7H201.5克；FeCl3'6H200.08克；CaCl2'2H201.5克；MnS040.1克;ZnS041.5克，補充蒸餾水至廳0mL，pH7.5，配置210mL發酵液分裝500mL三角瓶，每瓶裝液量70mL，以12KC高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37。C按照4%的接種量接入種子液，搖床轉速180rpm，發酵溫度37"C，發酵至32小時結束發酵。e、同實施例4。采用實施例3所述方法，檢測分析所得到的聚Y-谷氨酸，其濃度為45g/L。實施例8:聚Y-谷氨酸的發酵生產聚a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種；b、斜面菌種活化將冷凍保藏的菌種(本發明菌株WX-02)，接種到LB固體斜面(含蛋白胨8克/升、酵母浸出物4克/升、NaC18克/升、瓊脂18克/升、pH7.0)，30°C-37'C培養24小時。c、種子液培養同實施例4。d、搖瓶發酵培養按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉100克；淀粉100克；氯化銨20克；K2HP04'3H202克；MgS04'7H202克；FeCl3'6H200.1克；CaCl2,2H202克;MnS040.2克;ZnS042克,補充蒸餾水至lOOOmL，pH7.5，配置210mL發酵液分裝500mL三角瓶，每瓶裝液量70mL，以12rC高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37t按照4%的接種量接入種子液，搖床轉速180rpm，14發酵溫度37'C，發酵至36小時結束發酵。e、同實施例4。采用實施例3所述方法，檢測分析所得到的聚Y-谷氨酸，其濃度為42.3g/L。實施例9:聚Y-谷氨酸的發酵生產聚a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種;'b、斜面菌種活化同實施例4。c、種子液培養同實施例4。d、搖瓶發酵培養谷氨酸鈉7%;葡萄糖7%;氯化銨2°/0;K2HPO4'3H2O0.01%;MgS04'7H200.01%;FeCl3.6H200.001%;CaCl2.2H200.01%;MnSO40.001%;ZnSO40.01%，裝液量1.5L/3L發酵罐，以12rC高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，接入上述種子液，接種量3%，pH7.0，通氣量l:l(v/v)，轉速400rpm，溫度37。C,發酵至36小時結束發酵。.e、同實施例4。檢測分析所得到的聚Y-谷氨酸的濃度為42g/L。實施例10聚Y-谷氨酸的發酵生產聚a、用冷凍保藏的本發明菌種為原始菌種；b、斜面菌種活化同實施例4。c、種子液培養同實施例4。d、搖瓶發酵培養谷氨酸鈉7%;葡萄糖7%;氯化銨2%;K2HP04'311200.01%;MgS(V7H200.01%;FeCl:r6H200.001%;CaCl2'2H200.01%;MnS040.0010/。；ZnS040.01%，裝液量1500L/3000L發酵罐，以12rC高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，接入上述種子液，接種量3%,pH7.0，通氣量75L/min，轉速150r/min，溫度37。C，發酵至36小時結束發酵。e、同實施例4。檢測同實施例4。分析所得到的聚Y-谷氨酸的濃度為35.05g/L。權利要求1、一種地衣芽孢桿菌菌株，其特征在于所述菌株保藏名稱為地衣芽孢桿菌WX-02，保藏單位CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM208065，保藏日期2008年4月24日。2、根據權利要求1所述的地衣芽孢桿菌菌株的用途，其特征在于該菌株用于生產聚，谷氨酸。3、根據權利要求1所述的地衣芽孢桿菌齒株用于生產聚，谷氨酸的方法，其特征在于它包括以下步驟a、采用地衣芽孢桿菌WX-02、保藏單位CCTCC、保藏編號為CCTCCNO:M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作為生產菌株；b、上述wx-02菌株接在LB培養基固體斜面上30。C-37t:培養；刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-60-70匸冷凍保藏；C、制備種子液(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，3(TC-37'C培養24-36小時，使其活化；，(2)將上述活化的種子轉接到LB液體種子培養基中，30°C-37°C，200rpm培養14-16小時至對數生長中期；d、發酵培養(1)按照每1升培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉7-100克；碳源10-100克；無機氮源3-20克；K2HP04'3H200.1-2克；MgS04'7H200.1-2克；FeCl3.6H200.01-0.1克;CaCl2.2H200.1-2克;MnS040.01-0.2克;ZnS040.1-2克，補充蒸餾水至lOOOmL，pH6.0-7.5;(2)按50-100mL/500mL三角瓶的裝液量，投入上述培養基，121°C，30min滅菌后，接種量為1-5%，30-37。C培養24-48.小時；或按發酵罐容積的40-80%投入上述發酵培養基，以0.07-0.1Mpa高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至30°C-37'C接入種子液；在3(TC-37"C條件下培養；e、提取將d步驟所述的菌株培養液深層發酵24-48小時；離心除去菌體、收集上清液，并用95%的乙醇沉淀、回收聚-Y-谷氨酸。4、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的LB固體培養基的組成為蛋白胨l-10克/升、酵母浸出物l-5克/升、NaCll-10克/升、瓊脂10-20克/升，pH6.0-8.0。5、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的LB固體培養基的組成為蛋白胨5-10克/升；酵母浸出物3-5克/升；NaC15-10克/升；瓊脂15-20克/升；pH6.0-8.0。6、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的谷氨酸鈉的含量為20-100克/升。7、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的無機氮源是硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨或硝酸鈉中的任意一種。8、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的發酵培養基中的無機氮源含量為5-20克/升。9、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的發酵培養基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉或淀粉水解液中的任意一種。10、根據權利要求3所述的生產聚Y-谷氨酸的方法，其特征在于所說的發酵培養基中的碳源含量為30-100克/升。全文摘要本發明公開了一種地衣芽孢桿菌菌株，菌株保藏名稱為地衣芽孢桿菌WX-02，保藏單位CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM208065，保藏日期2008年4月24日。本發明同時公開了該菌株的一種用途以及該菌株用于生產聚γ-谷氨酸的方法。本發明通過種子液制備、液體深層發酵工藝生產聚γ-谷氨酸產品，所屬菌株遺傳性能穩定、生產效率高、生產成本低。利用本發明的菌株及其發酵方法制備聚γ-谷氨酸3000L發酵罐產量可達35.05g/L。文檔編號C12R1/10GK101603015SQ200810055068公開日2009年12月16日申請日期2008年6月13日優先權日2008年6月13日發明者冀志霞,劉曉雷,孫君偉,張紅艷,李建波,李海濤,王正品,米造吉,萍謝,威郭,陳守文,魏雪團,黃品奇申請人:河北維爾康制藥有限公司;華中農業大學