專利名稱：一種乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物傳感器領域，更具體的說，是涉及一種乙醇生物傳感器 核微孔酶膜的制備方法。
背景技術：
乙醇含量的測定方法主要有氣相色語法，分光光度法，密度瓶法，重 鉻酸鉀t匕色法等，這些方法耗時、繁瑣，檢測起來既費時又費力。因此，現 在普遍看好酶的測定法即乙醇生物傳感器法，這種方法具有靈敏、快速、簡 便、特異性強等特點，而且對樣品幾乎不用任何預處理。
乙醇生物傳感器的研制為乙醇的現場快速檢測和發酵過程中乙醇的在 線檢測提供了有利手段。目前已經出現了各種各樣的生物傳感器，其中電流 型的酶傳感器依然是研究最多，也是商品化最為成功的傳感器類型，而這類 傳感器的核心元件就是固定化酶膜。酶膜性能的優劣主，決定于固定化材料 的選取和固定方法的選擇。
目前在電極上固定化酶的方法主要有吸附法、共價結合法、交聯法、聚 合物包埋法、組合法等。
為實現乙醇測定，國外已經發明了一些酶電極，這些酶電極主要是通過 固定化酶的4支術。通過將Alcohol oxidase (A0X),固定在安培電極上， 制成'乙醇生物傳感器。在這類傳感器上直接通過監測反應池內O,的消耗和 H,02的生成來計量電化學反應。另外酶也可以和介導物一起固定在電極上， 例如Horseradish Peroxidase (HRP)。介導物增加了酶促反應速率，從而放 大了電信號(Azevedo， A. M， 2005)。進而，4艮多不同類型的酶電極被^是議 出來，例如隔膜電才及、玻璃碳電極(GC) 、 Screen-Printed電極。上述方法 都是將酶直接固定到電極上，必須使用相匹配的電極，從而不具有普遍適用 性。
發明內容
本發明是為了克服現有技術中將酶直接固定到電極上之后不具有普遍適用性等不足之處，提供了一種可以和不同氧化還原電極配合使用，酶膜性 能好，適合于乙醇在線監控的乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法。
本發明通過下iii支術方案實現
一種乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其特征是，包括下述步驟 (i)將可溶性淀粉溶解于含低濃度戊二醛的水溶液中，80攝氏度加熱 溶解并攪拌30分鐘，之后，室溫放置12小時，使淀粉與戊二醛水溶液發生 交聯反應，得到醛基化淀粉膠溶液，再與質量體積百分比濃度為2%的海藻 酸鈉溶液混合，得到海藻酸鈉-淀粉膠凝膠；其中淀粉與戊二醛交聯反應得 到的醛基化淀粉膠溶液與質量體積百分比濃度為2%的海藻酸鈉溶液的體積 比為1: 1。可溶性淀粉與含低濃度戊二醛的水溶液的質量體積比為2:1。
(2 )取上述海藻酸鈉-淀粉膠凝膠作為固定材料與混合酶溶液充分混合 后，4攝氏度下放置8分鐘使酶固定化，所述混合酶溶液由乙醇氧化酶和牛 血清白蛋白混合而成。取10微升上述固定化的酶均勻涂抹于兩張聚碳酸酯 微孔膜上，制成三明治結構的酶膜后，浸入CaCl2溶液10秒鐘后取出，其中 浸入CaCl2溶液后可以使海藻酸鈉與鉤離子相互作用，形成網狀結構，可使 海藻酸鈉溶液瞬時凝膠化，成為良好的包埋載體。
研究表明當某溶液中含有少量Ca2+,即小于O. 001%時，能夠顯著增大酶 膜的響應值。因此，用PH=7的磷酸緩沖液沖洗3遍以上，去除乙醇酶膜上 存留的Ca2+ 、 Cl"等離子，從而消除測定誤差，制成乙醇酶膜。其中固定 材料與混合酶溶液的體積比為4: 1。
其中，所述低濃度戊二醛水溶液的體積百分比濃度為1-4°/ 。所述CaCl2 溶液的重量百分比濃度為5-7%。所述混合酶溶液用0. Olg牛血清白蛋白配 制，其最終乙醇氧化酶濃度為Q. 022 - 0. 088g。可溶性淀粉與含低濃度戊二 醛的水溶液的質量體積比為1: 5 - 40。
本發明具有下述技術效果
本發明采用和國外研究不同的適合于核微孔膜的固定化酶方法制成固 定化酶的核微孔膜，而不是直接固定到電極上，從而適合于山東省科學院生 物研究所生產的SBA-40C生物傳感分析儀，也可以靈活地和其它氧化還原 電極配合使用，具有普遍適用性。而且，本發明利用淀粉、戊二醛和海藻酸 鈉為混合固定材料，并通過合理的配比，使乙醇酶膜性能良好，由該乙醇酶膜制成的電極的線性范圍為0-1%,分辨率達到0.001%，響應時間20s,半衰
期大于30天。
具體實施例方式
以下結合具體實施例對本發明詳細說明。 實施例1
將O. 088g乙醇氧化酶與0. Olg牛血清白蛋白混合得到混合酶溶液備用。
稱取可溶性淀粉4g，加到20ml體積百分比濃度為1%的戊二醛水溶液 中，80攝氏度加熱溶解并攪拌30分鐘，加熱過程中不斷攪拌溶液，使其不 聚集成固體，之后，室溫放置12小時，使可溶性淀粉與戊二醛水溶液進行 交聯反應，得到醛基化淀粉膠溶液。將上述醛基化淀粉膠溶液與質量體積百 分比濃度為2%的海藻酸鈉溶液按照體積比為1: 1的比例混合，攪拌均勻后， 便制成海藻酸鈉-淀粉膠凝膠，裝入1. 5毫升的離心管中避光保存。
取海藻酸鈉-淀粉膠凝膠8微升作為固定材料與2微升的混合酶溶液充 分混合后，4攝氏度下放置8分鐘使酶固定化，將上迷10微升固定化的酶 均勻涂沐于兩張聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治結構的酶膜后，浸入重量百 分比濃度為7%的CaCh溶液10秒鐘后取出，用上述配制好的pH=7的磷酸緩 沖液沖洗3遍以上，制成乙醇酶膜，即可裝到山東省科學院生物研究所生產 的SBA-40C生物傳感分析儀上用于分析測試。
儲存條件在膜上滴一滴甘油，4度保存。
實施例2
將O. 044g乙醇氧化酶與0. Olg牛血清白蛋白混合得到混合酶溶液備用。 '稱取可溶性淀粉2g，加到20ml體積百分比濃度為1%的戊二醛水溶液中 80攝氏度加熱溶解攪拌30分鐘，加熱過程中不斷攪拌溶液，使其不聚集成 固體，之后，室溫放置12小時，使可溶性淀粉與戊二醛水溶液進行交聯反 應，得到醛基化淀粉膠溶液。將上述醛基化淀粉膠溶液與質量體積百分比濃 度為2%的海藻酸鈉溶液按照體積比為1:1的比例混合，攪拌均勻后，便制 成海藻酸鈉-淀粉膠凝膠。裝入1. 5毫升的離心管中避光保存。
取海藻酸鈉-淀粉膠凝膠8微升作為固定材料與'2微升的混合酶溶液充 分混合后，4攝氏度下放置8分鐘使酶固定化，取上述10微升固定化的酶 均勻涂抹于兩張聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治結構的酶膜后，浸入重量百分比濃度為6%的CaCh溶液10秒鐘后取出，用上述配制好的PH=7的磷酸緩 沖液沖洗3遍以上，制成乙醇酶膜，即可裝到山東省科學院生物研究所生產 的SBA-40C生物傳感分析儀上用于分析測試。 儲存條件在膜上滴一滴甘油，4度保存。 實施例3
將O. 022g乙醇氧化酶和0. Olg牛血清白蛋白混合得到混合酶溶液備用。
稱取可溶性淀粉0. 5g，加到20ml體積百分比濃度為1%的戊二醛水溶液 中，80攝氏度加熱溶解攪拌30分鐘，加熱過程中不斷攪拌溶液，使其不聚 集成固體，之后，室溫放置12小時，使可溶性淀粉與戊二醛水溶液進行交 聯反應，得到醛基化淀粉膠溶液。將上述醛基化淀粉膠溶液與質量體積百分 比濃度為2%的海藻酸鈉溶液按照體積比為1:1的比例混合，攪拌均勻后， 便制成海藻酸鈉-淀粉膠凝膠。裝入1. 5毫升的離心管中避光保存。
取海藻酸鈉-淀粉膠凝膠8微升作為固定材料與2微升的混合酶溶液充 分混合后，4攝氏度下放置8分鐘使酶固定化，取上述10微升固定化的酶 均勻涂抹于兩張聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治結構的酶膜后，浸入重量百 分比濃度為5%的CaCh溶液10秒鐘后取出，用上述配制好的pH=7的磷酸緩 沖液沖洗3遍以上，制成乙醇酶膜，即可裝到山東省科學院生物研究所生產 的SBA-40C生物傳感分析儀上用于分析測試。
儲存條件在膜上滴一滴甘油，4度保存。
測定原理
乙醇在乙醇氧化酶的催化下水解為乙醛和HA,其氧化還原反應的化學 計量學信號通過電極的電信號表現出來，從而達到對乙醇進行定量測定的目的。
本發明利用淀粉、戊二醛和海藻酸鈉為混合固定材料的乙醇酶膜性能良 好，由該乙醇酶膜制成的電極最低乙醇檢出濃度為0. 001°/ ，響應時間20秒， 0%-1°/。范圍內線性關系W達到0. 995以上，每天測樣40次，1周以后酶膜活 性沒有明顯下降。
權利要求
1、一種乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其特征是，包括下述步驟(1)將可溶性淀粉溶解于含低濃度戊二醛的水溶液中，80攝氏度加熱溶解并攪拌30分鐘，之后，室溫放置12小時，使淀粉與戊二醛水溶液發生交聯反應，得到醛基化淀粉膠溶液，再與質量體積百分比濃度為2％的海藻酸鈉溶液混合，得到海藻酸鈉-淀粉膠凝膠；其中淀粉與戊二醛交聯反應得到的醛基化淀粉膠溶液與質量體積百分比濃度為2％的海藻酸鈉溶液的體積比為1∶1；(2)取上述海藻酸鈉-淀粉膠凝膠作為固定材料與混合酶溶液充分混合后，4攝氏度下放置8分鐘使酶固定化，所述混合酶溶液由乙醇氧化酶和牛血清白蛋白混合而成；取10微升上述固定化的酶均勻涂抹于兩張聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治結構的酶膜后，浸入CaCl2溶液10秒鐘后取出，用pH＝7的磷酸緩沖液沖洗3遍以上，制成乙醇酶膜；其中固定材料與混合酶溶液的體積比為4∶1。
2、 根據權利要求1所述的乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其 特征是，所述低濃度戊二醛水溶液的體積百分比濃度為1%-4%。
3、 根據權利要求1所述的乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其 特征是，所述CaCl2溶液的重量百分比濃度為5-7%。
4、 根據權利要求1所述的乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其 特征是，所述混合酶溶液用0. Olg牛血清白蛋白配制，其最終乙醇氧化酶濃 度為0. 022 - 0. 088g。
5、 根據權利要求1所述的乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其 特征是，所述緩沖液是由21. 8502g NaHP04* 12&0和10. 76g NaH2P04* H20溶 解定容至1L配制成pH=7的磷酸緩沖液。
6、 根據權利要求1所述的乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，其 特征是，可溶性淀粉與含低濃度戊二醛的水溶液的質量體積比為1: 5-40。
全文摘要
本發明公開了一種乙醇生物傳感器核微孔酶膜的制備方法，旨在提供一種能與不同氧化還原電極配合使用，具有普遍適用性，性能好，適合于乙醇在線監控的生物傳感器核微孔酶膜的制備方法。包括下述步驟將可溶性淀粉溶解于含低濃度戊二醛水溶液中，80℃加熱并攪拌，使其發生交聯反應，再與2％的海藻酸鈉溶液混合。取上述醛基化淀粉膠海藻酸鈉混合液作為固定材料與混合酶溶液充分混合后，4℃下放置8分鐘使酶固定化，將固定化的酶均勻涂抹于兩張聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治結構的酶膜，浸入CaCl<sub>2</sub>溶液10秒鐘后取出，沖洗3遍以上制成乙醇酶膜。混合酶溶液由乙醇氧化酶和牛血清白蛋白混合而成。本發明的酶膜具有普遍適用性，性能良好。
文檔編號C12N11/10GK101294156SQ20081005351
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月13日 優先權日2008年6月13日
發明者傅家胤, 龐廣昌, 李加鵬, 馬小剛, 高寅生, 高振興 申請人:天津商業大學