專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其在防治設施蔬菜連作障礙中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和農業病害防治技術領域，具體地說，它涉及一種枯草 芽孢桿菌及其在防治設施蔬菜連作障礙中的應用。
背景技術：
據聯合國糧農組織調查資料顯示，全球每年被病蟲害奪去的農作物占收成的
20% 30%,由此造成的經濟損失達1200億美元。目前主要是通過噴灑化學試 劑來防治。但是由于大量使用化學農藥，造成了空氣、水源、土壤和食物不同程 度的污染，甚至出現毒物逐漸積累在家畜和人類體內引起中毒的現象。全世界每 年約有200萬人因化學農藥而中毒，其中大約有4萬人死亡。而且，長期使用某 些化學農藥也會使害蟲產生抗藥性，椐公開的統計資料表明具有抗藥性的害蟲目 前已有417種。近年來，在農業生產中，應用生物農藥取代化學農藥已逐漸成為 一種趨勢。世界各國針對化學農藥的種種弊端，已研制出一系列選擇性強、效率 高、成本低、無污染、對人畜無害的生物制劑。我國也將逐步用生物農藥取代化 學農藥，特別是在蔬菜的生產上將盡早使用生物農藥。
2008年我國設施蔬菜栽培面積超過了 200萬公頃，現已成為世界設施園藝 面積最大的國家。設施蔬菜已成為我國農業生產中最有活力的新興產業，為我國 菜籃子工程的建設起到了巨大作用。但設施蔬菜具有高度集約化、復種指數高和 種類單一的特點，多年連作，出現了土壤環境惡化、蔬菜病蟲害嚴重、產量降低、 蔬菜品質變劣等一系列不良現象，嚴重威脅設施蔬菜生產的可持續發展，連作造 成的障礙已經成為蔬菜栽培生產中亟待解決的一大技術難題。
引起作物包括設施蔬菜連作障礙的原因是復雜的，是作物一土壤兩個系統內 部諸多因素綜合作用結果的外在表現。不同作物產生連作障礙的原因可能是不同 的。1983年日本將產生連作障礙的原因歸納為五大因子(l)土壤養分虧缺；(2) 土壤反應異常(毒素)；(3)土壤物理性狀惡化；(4)來自植物的有害物質；(5) 土壤微生物變化。同時強調在這五大因子中，土壤微生物區系的變化是連作障
礙的主要因子，其它為輔助因子。近幾年來國內外對根分泌物的研究成為揭示連 作障礙機制的熱點。
據公開的研究資料表明無論大棚或露地，土壤中微生物的種類均是繁多的。在各類群微生物中， 一般都以細菌數量為最多，其次是放線菌，真菌數量居第3 位；大棚中上述微生物數量及微生物活性均高于露地。真菌中以青霉菌、曲霉菌、 小克銀漢霉菌為主，兼性寄生菌長孺孢菌、粉孢霉等病原真菌在大棚、露地土壤 中都有存在。因此，這些真菌引起的病害并不是設施溫室、大棚土壤特有的障礙 因子。從種植年限看，細菌數量無明顯變化，而種植年限長的大棚中真菌、放線 菌數量較種植年限短的大棚中少、這種狀況的產生可能與大棚內較高的濕度及較 高含鹽量對其抑制有關。公開的研究資料還表明土傳病蟲害是引起連作障礙因子中最主要的因子， 有關連作障礙原因的調査結果表明，引起蔬菜連作障礙的70%左右的地塊是由 于土壤傳染性病蟲害所引起的。連作提供了根系病害賴以生存的寄主和繁殖的場 所，使得土壤中的病原菌數量不斷增加，特別是近年來由于過多的使用化肥所帶 來土壤中病原拮抗菌的減少，更加重了土傳病蟲害的發生。根際微生物種類繁多且活躍，其中能夠促進植物生長、防治病害、增加作物 產量的微生物被稱為促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,簡稱PGPR)。 它們和植物間是互生關系，與植物根系相互作用、相互促進。微生物大量聚集在 根系周圍，將有機物轉變為無機物，為植物提供有效的養料；同時，微生物還能 分泌維生素，生長刺激素等，促進植物生長。在植物生長過程中，死亡的根系和 根的脫落物(根毛、表皮細胞、根冠等)，以及根系向根外分泌的無機物和有機 物是微生物重要的營養來源和能量來源；由于根系的穿插，使根際的通氣條件和 水分狀況優于根際外，從而形成利于微生物的生態環境。PGPR可以抑制土壤中有害病原微生物的繁殖，并可以產生有益植物生長的 代謝產物，從而可以用來防治連作障礙，促進植物的生長發育、改善蔬菜的品質， 其研究和產業化前途光明、催人奮進，事實證明PGPR產業化是今后國內外農業 生物技術領域發展的重要領域和方向。 發明內容本發明的目的在于針對設施農業連作障礙日益嚴重的技術問題，而提供一種 枯草芽孢桿菌及其在防治設施蔬菜連作障礙中的應用。本發明涉及的枯草芽孢桿菌(Bacz7/M ra6"fc) M-2菌株，于2007年11月 29日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，其保藏號為 CGMCC No.2271。所述枯草芽孢桿菌(5ad//"s ;ywto'fc) M-2 CGMCC No.2271 ，是從海洋紅樹植物中分離得到，經培養基富集后通過抑菌圈試驗篩選獲得。所述枯草芽孢桿菌(Bflc/〃Mw6rifc) M-2 CGMCCNo.2271的細胞形態特 征革蘭氏陽性菌，桿狀，大小為0.5 l.(Himx3.5 6.(Vm，芽孢端生或次端生， 周生鞭毛，能運動。所述枯草芽孢桿菌(Sflc/〃www^7&) M-2 CGMCCNo.2271的生理生化特 征生長溫度27。C 45。C， pH4 9,NaCL耐受性2%~6%，觸酶試驗、H2S試驗、 淀粉水解試驗、纖維素水解試驗和MR試驗均為陽性，苯丙氨酸脫氨試驗、脲酶 試驗、氧化酶試驗、明膠液化試驗、酪氨酸降解試驗和V-P試驗均為陰性，產酸 利用甘露醇，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖和檸檬酸 鹽。所述枯草芽孢桿菌(5flc/〃w wto加)M-2 CGMCC No.2271的16S rRNA 的核苷酸具有如序列表所示序列。所述枯草芽孢桿菌M-2 CGMCC No.2271在防治設施蔬菜 連作障礙中的應用。所述枯草芽孢桿菌Bac///Wls做^/fc M-2 CGMCC No.2271菌株的應用方法是發酵培養一稀釋一噴灑一效果測定。所述枯草芽孢桿菌5fl"7/w M-2 CGMCC No.2271菌株的發酵培養基組成為g/L:葡萄糖IO，酵母膏IO，牛肉膏4，蛋白胨4， NaC125，pH7.2 7.4。本發明涉及的菌株，參照《Bergey，s Mannual of Systematic Bacteriology)) Vol. 聰的內容，根據其形態特征和生理生化特征，以及16SrRNA基因序列結果，經 多相分類鑒定是一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為M-2。本發明提供的M-2CGMCC No.2271株菌，是一種優良的根際促生菌 (PGPR)，對設施蔬菜連作障礙中的真菌病害具有很強的抑制作用，可以抑制 多種致病真菌的生長，特別是防治黃瓜枯萎病、棉花枯萎病、立枯病和各種腐 霉和疫霉引起的植物病害。對于促進植物的生長，具有高效、無污染等突出優點。
附圖1是枯草芽孢桿菌5ad/to swto'fc M-2 CGMCC No.2271菌株的顯微 照片。附圖2是枯草芽孢桿菌Bac/〃M wto'fo M-2 CGMCC No.2271菌株對連作土壤中真菌作用結果測定圖。附圖3是枯草芽孢桿菌5ac/〃M M-2 CGMCC No.2271菌株發酵液不同稀釋倍數對幼苗生根生長促進效果比對照片。附圖4是枯草芽孢桿菌Sad〃w M-2 CGMCC No.2271菌株對棉花枯萎病病菌的抑制作用比對照片，其中A為作用后，B為作用前。附圖5是枯草芽孢桿菌Bfla7/M w&"'to M-2 CGMCC No.2271菌株接種后對 綠豆生長影響的照片，其中A為作用后，B為作用前。附圖6是枯草芽孢桿菌5flc///^ wto'to M-2 CGMCC No.2271菌株接種后對 白菜幼苗生長影響的照片，其中A為作用后，B為作用前。
具體實施方式
下面結合實施例及其附圖進一步說明本發明。實施例h本發明提供的枯草芽孢桿菌^^7/wM-2菌株的篩選和育種。 將海洋紅樹植物的根部浸漬在大量無菌水中約20min，洗去粘附在根上的土 壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。將水樣收集 于100mL干凈、滅菌的廣口塑料瓶中，震蕩均勻后取15mL，無菌接種于 100mLZoBell培養基中(培養基組成蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸鐵0.1g，陳 海水1000mL,pH7.6 7.8) ，36。C震蕩培養6天。在LB平板上觀察，培養一天的 菌落直徑3 5mm，呈圓形，邊緣整齊，表面濕潤。將培養6天富集培養液混勻 后，取0.1mL涂布于營養瓊脂培養基中，36X:恒溫培養2天，根據菌落形態進 行編號，將所有分離到的微生物以白色粘球菌為指示菌，通過抑菌圈法進行篩選， 最終獲得如圖1所示的抑菌效果最好的M-2菌株。實施例2:本發明提供的枯草芽孢桿菌^fld//^幼6f/fc M-2菌株的形態特征和生理生 化特征的鑒定。參照《Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VlII的試驗方法進行， 檢測其革蘭氏染色，菌體大小和形態，有無鞭毛和芽孢，生長溫度，pH范圍。 NaCL耐受性。觸酶、H2S試驗、淀粉水解、纖維素水解、MR試驗，苯丙氨酸 脫氨、脲酶試驗、氧化酶、明膠液化、酪氨酸降解、V-P試驗，以及利用甘露醇， 阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖和檸檬酸鹽試驗。結果表明，該菌為革蘭氏陽性，桿狀，大小為0.5^im l.(Himx3.5pm 6.(^m， 芽孢端生或次端生，周生鞭毛，能運動(見圖1)。生長溫度27 45。C，pH4 9，NaCL耐受性0~2%。觸酶、H2S試驗、淀粉水解、纖維素水解、MR試驗均為陽性， 苯丙氨酸脫氨、脲酶試驗、氧化酶、明膠液化、酪氨酸降解、、V-P試驗均為陰 性，能夠利用甘露醇，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖 和檸檬酸鹽。實施例3:本發明提供的枯草芽孢桿菌5fld〃w M-2菌株的16S rRNA基因的PCR擴增和序列測定。將該菌株接種于LB培養基，120rpm，37"C震蕩培養10小時，離心收集菌體， 懸浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚一氯仿法提取基因組DNA，用正相引物 27F (5'誦GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物1541R(5'-AAGGAGG TGATCCAGCC-3')，對其16S rRNA基因進行PCR擴增，將擴增的產物由北京三 博公司進行測序。PCR條件為94°C， 10min; 94°C， 45s; 55°C 45s; 72°C， 90s; 30個循環，4'C保存。16SrRNA基因序列長度為1543bp，在GenBank中的登陸 號為￡1;333948，與5<^///^^^7& (AB110598)相似性為99%。其結果如序列表 所示。實施例4:本發明提供的枯草芽孢桿菌^flcz7/w to6"/" M-2菌株的發酵培養。 將M-2菌株接種在LB培養基上，36'C下活化24小時，然后將活化的M-2 菌株轉接到基礎培養基中進行搖瓶發酵，溫度為30 36'C，搖床轉速為200rpm， 發酵時間為72小時。其中發酵培養基組成為g/L:葡萄糖10，酵母膏10，牛肉 膏4，蛋白胨4， NaC125， pH7.2~7.4。實施例5:采用稀釋平板法，分別對連作土壤和接種M-2菌株后土壤的真菌數量進行 測定，培養基為馬丁氏培養基，每皿加1滴氯霉素抑制細菌防治。置于28'C的 恒溫箱中培養3天，計數。結果表明，海洋細菌M-2能夠有效抑制連作土壤中 致害菌生長，接種20周后的作用結果如圖2所示真菌數量降為對照土壤的30%。實施例6:本發明提供的枯草芽孢桿菌5" 7/m ^Z^to M-2菌株對各種真菌菌絲的抑 制作用試驗。采用含毒介質法，在20mLPDA培養基中加入2mL M-2的發酵液，倒PDA 平板，用打孔器取直徑為5mm的病原真菌菌絲塊，移入平板中心處，28'C培養 24h、 48h、 72h和96h測量菌絲生長直徑(mm)，重復3次，計算各處理濃度下的 抑菌率。抑菌率=[(對照菌絲生長直徑—試驗處理菌絲生長直徑)/對照菌絲生長直 徑]xlOOQ/。。結果表明，其對蘋果腐爛病病菌的抑制率為99.5%,對哈密瓜根腐病 病菌的抑制率為99.1%，對棉花枯萎病病菌的抑制率為98.5%，對玉米小斑病病 菌的抑制率為97.5%，水稻立枯病病菌的抑制率為98.3%，對小麥根腐病病菌的 抑制率為96.5%，對煙草赤星病病菌的抑制率為97.5%。如圖4所示，該菌可以 有效的抑制棉花枯萎病病菌的生長。實施例7:本發明提供的枯草芽孢桿菌5fl"7/as仰6rito M-2菌株對綠豆幼苗根生長的 促進作用試驗。取M-2發酵液，離心，取上清夜，將其分別稀釋5、 10、 100、 1000和10000 倍，設置蒸餾水做對照(Control)，將各稀釋液加入到10mL的小試管中，用牛 皮紙和封口膜封口，在其中央打一孔，將綠豆苗栽入，每管一棵，培養7天，設 置四個重復，結果見表1和圖3。表1 M-2對綠豆幼苗根生長的促進作用稀釋倍數重復I 根芽數(個)重復II 根芽數(個)重復ni 根芽數(個)重復IV 根芽數(個)均值 根芽數(個)51614161615.5101720161316.51022420121618.01032016131215.251041010121211.00Control1213111111.75表1說明，M-2菌株可以有效促進幼苗生根生長,其中稀釋100倍時效果最 好。圖3中CK、 a、 b、 c、 d、 e分別為蒸餾水對照、將發酵液稀釋5、 10、 100、1000和10000倍時對綠豆苗根生長的影響，從中可以看出M-2菌株對幼苗生根 生長有很好的促進作用。實施例8:本發明提供的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株接種 后對綠豆生長的影響。將綠豆栽入連作后的土壤中， 一組接種M-2菌株，另一組不接種做為空白 對照(Control)，培養8天后觀察綠豆的生長情況。從圖5中可以看出接種M-2 菌株后可以有效的促進綠豆苗的生長。實施例9:本發明提供的枯草芽孢桿菌5ad〃ws swto'fc M-2 CGMCC No.2271菌株接種 后對綠豆生長的影響。將綠豆栽入連作后的土壤中， 一組接種M-2菌株，另一組不接種做為空白 對照(Control)，培養8天后觀察綠豆的生長情況。從圖6中可以看出接種M-2 菌株后可以有效的促進綠豆苗的生長。實施例10:本發明提供的枯草芽孢桿菌Sad//^ M-2菌株在黃瓜試驗田中的應用試驗。通過發酵液能夠抑制黃瓜枯萎病，具體過程為對菌株M-2進行發酵，發 酵液稀釋1000倍噴霧，黃瓜幼苗移栽成活一周后開始噴藥，每次間隔20-25天， 連續3_4次。其生防效果可達73%。發酵培養條件為將M-2菌株接種在LB培 養基上，36'C下活化24小時，然后將活化的M-2菌株轉接到基礎培養基中進行 發酵培養，溫度為30 36'C，搖床轉速為200rpm，發酵時間為72小時。其中發 酵培養基組成為g/L:葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4， NaCl 25， pH7.2。實施例11:本發明提供的枯草芽孢桿菌^a"7/"j犯6/Zfo M-2菌株在煙草試驗田中的應用。通過發酵液能夠抑制煙草赤星病，具體過程為對菌株M-2進行發酵，發 酵液稀釋1000倍噴霧，苗床十字期第1次葉面噴霧施藥，移栽成活后5-7天后 施第2次藥，以后間隔20天施藥1次，共3次，整個生育期試藥4次。其生防 效果可達71%。發酵培養條件為將M-2菌株接種在LB培養基上，36'C下活化 24小時，然后將活化的M-2菌株轉接到基礎培養基中進行發酵培養，溫度為 30~36°C，搖床轉速為200rpm，發酵時間為72小時。其中發酵培養基組成為g/L: 葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4， NaC125， pH7.2。實施例12:本發明提供的M-2菌株在煙草試驗田中的應用。 通過發酵液能夠抑制番茄根腐病，具體過程為對M-2進行發酵，發酵液 稀釋1000倍噴霧，苗床十字期第1次葉面噴霧施藥，移栽成活后5-7天后施第2 次藥，以后間隔20天施藥1次，共3次，整個生育期試藥4次。其生防效果可 達70%。發酵培養條件為將M-2菌株接種在LB培養基上，36。C下活化24小 時，然后將活化的M-2菌株轉接到基礎培養基中進行發酵培養，溫度為30~36 °C，搖床轉速為200rpm，發酵時間為72小時。其中發酵培養基組成為g/L:葡萄 糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4， NaC125， pH7.4。序列表<110>天津現代職業技術學院天津市輕工業化學研究所<120>—種枯草芽孢桿菌及其在防治設施蔬菜連作障礙中的應用 <160>1<170>Patentin Version 2.1 <210>1 <211> 1543 <212>DNA<213>枯草芽胞桿菌(BacZ/Z^wZ^'to) <400> 1g￡Lgtttg3tCctggctc鄉acgaacgctggcggcgtgccaagtcgetgcg 60gac卿tgggagcttgctccctgatgttagcggcggax;gggtgagtaacacgtgggt犯c120ctgcctgt肌gactgggala3CtCCggg犯￡tcccgggctaataccggatggttgtttgaa180ccgcatggttaggtggcttcggctaccactt3C8gettggeicccgcggcgc240attagctagttggtg3ggt3acggctcacctgcgtagccg3CCtg3g鄉300gtgatcggccacactgggactg卿C3Cggcccagactcctacgggaggc3gcagt郷g360aatcttccgc肪tggacg犯3gtCtg8Cggagc朋cgccgCgtg兆tg3tgaaggttttc420ggatcgta犯gctctgttgttaggga卿ficaagtaccgttcg犯tagggcggtaccttg 480acggt3cctscacggctaactacgtgccagcagccgcggt犯tacgteigg540tggc卿cgttgtccgg犯ttattgggcgt3犯gggctcgcaggcggtUcttaagtctg600atgtgaaagcccccggctca織gggg郷gtcattggaaactgggg犯cttgagtgCElg660a卿gg卿gtggaattccacgtgtagcggtg肌atgcgt卿g3tgtgg720gtggcg卿gcgactctctggtctgtaactgacgctg娜agegaragegtggggagcgs780acaggattagataccctggtagtccacgccgt犯3Cg3tgELgtgCt犯gtgtt鄉gggt840ttccgccccttagtgctgcagct幼cgcattaagcactccgcctggggsgt3CggtCgC3900tgscgggggcccgcac朋gcggtggagceitgtggtttaat960tcgaagcaacgcgaag8acctteiccaggtcttgacatcctctgacaatcctag柳tagg1020acgtccccttcgggggc卿gtg6LC3ggtggtgcatggttgtcgtcagctCgtgtCgtg31080gatgttgggttaagtcccgc肌Cg3gCgC3acccttgatcttagttgcc8gcattcagtt1140gggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccgg鄉卿gtggggatgacgtc犯atca1200tcatgcccctt3tg3CCtgggctacacacgtgCt3C￡l￡ltggacagaacaa鄉gcagcga1260犯ccgcgaggttaagccaatcccac犯3tctgttctcagttcggatcgcagtctgcaact1320cgactgcgtgcgctagt肌tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgtt1380cccgggccttgtacscaccgcccgtcacaccacgagagtttgt犯cacccgaagtcggtg1440aggt犯ccttt犯ggagccagCCgCCg￡L￡lggtggg3C卿tgsttggggtgaagtcgtaa1500C肌ggt3gCCgt3tcgg朋ggtgcggctggatcacctcct154權利要求
1、一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，是保藏號為CGMCC No.2271的M-2菌株。
2、 如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌(^ d//Mw6ri/&) M-2菌株，是從海洋紅樹植物中分離得到，經ZoBell營養培養基富集后通過抑菌圈試驗篩選獲得。
3、 如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌5a"7/附幼WtoM-2CGMCCNo.2271菌株，其特征在于革蘭染色呈陽性，桿狀，大小為0.5nm l.(Vmx3.5pm 6.(^m， 芽孢端生或次端生，周生鞭毛，能運動；生長溫度27°C 45°C， pH4~9， NaCl 耐受性2%~6%;觸酶試驗、H2S試驗、淀粉水解試驗、纖維素水解試驗和MR 試驗均為陽性；苯丙氨酸脫氨試驗、脲酶試驗、氧化酶試驗、明膠液化試驗、酪 氨酸降解試驗和V-P試驗均為陰性，產酸利用甘露醇。
4、 如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌Bacz7/wwwto'fcM-2CGMCCNo.2271 菌株，其16S rRNA的核苷酸具有如序列表所示序列。
5、 如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌Bad〃w M-2 CGMCC No.2271 在防治設施蔬菜連作障礙中的應用。
6、 如權利要求5所述的枯草芽孢桿菌Bad〃iw M-2 CGMCC No.2271 菌株，其特征在于M-2菌株應用方法是發酵培養一稀釋一噴灑一效果測定。
7、 如權利要求6所述的枯草芽孢桿菌Bfld〃iw M-2 CGMCC No.2271 菌株，其特征在于發酵培養基組成為g/L:葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4， 蛋白胨4， NaC125， pH7.2~7.4。
全文摘要
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌及其在防治設施蔬菜連作障礙中的應用，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis是保藏號為CGMCC No.2271的M-2菌株。M-2菌株是一種分離于海洋紅樹植物的根際促生菌，能夠抑制黃瓜枯萎病病菌、番茄根腐病病菌、大豆根腐病病菌等多種有害真菌的生長，可有效的防治設施蔬菜連作障礙，增加設施蔬菜的品質和產量。
文檔編號C12R1/125GK101531971SQ20081005244
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月14日 優先權日2008年3月14日
發明者超 任, 傅明范, 孫勇民, 樹生權, 芃 王, 范延輝 申請人:天津現代職業技術學院;天津市輕工業化學研究所