專利名稱：一種弓形蟲pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學及實驗動物寄生蟲質量控制技術領域，尤其涉及弓形 蟲PCR檢測方法。
背景技術：
現行國家標準中的弓形蟲檢測依仗血清學檢測，然而血清學檢測存在無法 避免的滯后性以及難以檢測環境中的病原體。在實驗動物質量控制新國標修訂稿中列舉了弓形蟲檢測的PCR方法。該方 法是對原有血清學方法(IHA、 IFA、 ELISA等)的有效補充。但是仍需要處死 動物，并且檢測方法相對繁瑣。由于PCR是以指數方式擴增，極微量的DNA污染都可能造成假陽性結果， 因此反應體系的干凈程度是絕對重要的。現有技術中，需要自行加入各種PCR 反應組分，容易發生核酸污染，干擾檢測結果。參照修訂稿中的操作流程，需 要在PCR操作時分7次加入PCR反應組分以及反應過后電泳前的上樣緩沖液， 共8次需要移取試劑加入PCR反應管。耗時費力，且人為操作不慎，操作地點 設備(如超凈工作臺失效)，甚至PCR操作區域布局不當，都使反應體系受污 染的機率大大增加，會直接改變PCR結果，影響診斷。另外，在該修訂稿中，仍需要處死動物釆取腹水、其他組織或采取大量血 液(0.2毫升已經超過小鼠最大安全采血量)作為樣品，每檢測一只動物就必 須處死或者采血造成動物傷害。因此，本領域迫切需要提供一種簡便、有效的實驗動物弓形蟲PCR檢測方 法，并且無需處死動物。發明內容本發明旨在提供一種實驗動物弓形蟲PCR檢測方法。在本發明中，提供了一種弓形蟲PCR檢測方法，所述的檢測方法包括步驟(1) 將引物、T叫DNA聚合酶、聚合酶穩定劑、四種單核苷酸、緩沖液、和 PCR產物電泳前的上樣緩沖液混合，凍干成粉末；(2) 將步驟(1)得到的粉末和樣品混合，進行PCR反應，得到PCR產物；和(3) 將PCR產物進行電泳檢測；所述樣品包括抽提自哺乳動物尿液和/或糞便的核酸。在另一優選例中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。在另一優選例中，所述的緩沖液是10X PCR緩沖液，其中含有氯化鉀， Tris-HC1，和Triton X-100。在另一優選例中，所述的10X PCR緩沖液的配方是5 0 OmM氯化鉀，1 0 0mMTris-HCl， 1 v/v%Triton X-100，和雙蒸水。在另一優選例中，PCR產物電泳前的上樣緩沖液是10X上樣緩沖液，其中含 有丙三醇，和GelRecF 。在另一優選例中，所述的10X上樣緩沖液的配方是5 Ov/v^丙三醇，和 0. 05v/v%GelRed 。在另一優選例中，所述的Taq DNA聚合酶為紅色。在另一優選例中，所述的哺乳動物選自靈長類動物、貓科動物、犬科動物、 或嚙齒類動物。在另一優選例中，所述的哺乳動物選自猴子、豬、貓、犬、大鼠、或小鼠。 在另 一優選例中，所述的樣品還包括陽性對照品和陰性對照品。據此，本發明提供了一種簡便、有效的實驗動物弓形蟲PCR檢測方法，并 且無需處死動物。
圖1顯示了實施例1中的檢測電泳圖；其中A顯示的是DL2000標記物的電 泳結果，B顯示的是標準陽性片段的電泳結果。
具體實施方式
發明人在實踐中發現可以通過檢測實驗動物的排泄物，如尿液和/或糞便，用PCR的方法檢測弓形蟲是否存在，并且所述的用于檢測的PCR試劑是一次性加入， 避免了由于操作歩驟繁多而可能造成無法準確檢測的后果。如本文所用，"PCR"是指聚合醇鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)，是本領域技術人員熟知的用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性-退 火-DNA合成這一周期的多次循環，使目的DNA片段得到擴增的一項分子生物學 技術。本發明中所使用的聚合酶穩定劑是上海賽百盛基因技術有限公司的產品。 Tris是指三羥甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)ami畫ethane)。 Triton X-100是指曲拉通X100(Amresco)。GelRed熒光核酸染色試劑(GelRed Nucleic Acid Stain)是美國Biotium Inc.的產品，GelRed 是一種靈敏、穩定和相對安全的熒光核酸染色試劑。它 可以替代高毒性染色劑一溴化乙錠(EB)，用于瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 中dsDNA和ssDNA的染色。GelRed 既可用于預制凝膠也可用于電泳后染色。本發明提供的弓形蟲PCR檢測方法包括步驟.-(1) 將引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶穩定劑、四種單核苷酸、緩沖液、 和PCR產物電泳前的上樣緩沖液混合，凍干成粉末；(2) 將步驟(1)得到的粉末和樣品混合，進行PCR反應，得到PCR產物；和(3) 將PCR產物進行電泳檢測，確定樣品中是否存在弓形蟲。 本發明對于PCR反應所需試劑，先進行預混和凍干制備。PCR反應需要的反應組分有緩沖液、Taq酶、引物2條、dNTP、樣品(或陰、陽性對照)、水。 在本發明的一個優選例中，按照國標修訂稿中的弓形蟲PCR檢測方法中規定的 上述組分的濃度，配置試劑后進行預混和分裝，每個PCR反應管中加入T叫DNA 聚合酶、單次 PCR 引物按弓形蟲 Bl 基因序列設計 5， GGAACTGCATCCGTTCATGAG3' (694-714bp， SEQ ID NO: 1); 5' TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3'(887-868bp， SEQ ID NO: 2)，預計擴增產物 為194bp。 10XPCR反應緩沖液(含MgCl2 15mM)以及10 dNTP:各為lOmM， 并加入PCR產物電泳前的上樣緩沖液。預混分裝后進行凍干。凍干的目的是去 除預混溶液中的水分，防止預混成分的變性和降解。由于去除了水分，預混后的PCR管中反應組分呈粉末狀。為了保證每一管中均含有Taq酶，避免PCR預 混管的核心組分差異，采用紅色的Taq酶，所以預混凍干后，PCR反應管底部 可見紅色粉末。本發明將預混和凍干的PCR反應試劑和提取自哺乳動物排泄物的樣品混合， 進行PCR反應，得到PCR產物。在常規PCR實驗中，由于反復凍融和抽取，可能導致試劑的浪費和交叉污 染，增加出錯的機率。本發明PCR反應管在使用時，因原有溶液組分已被凍干 成為粉末，只需加入樣品，再補足水至原定的反應體系(50或20微升體系) 即可。PCR操作中向PCR反應管中加溶液縮短為2次，而不是傳統的7次。預 混的試劑也避免了操作中因多次加樣，可能發生的核酸污染。由于已經預混了 上樣緩沖液，PCR反應結束后，電泳前也不用預混上樣緩沖液，經存放期試驗， 該試劑盒在-2(TC條件下能存放一年仍然有效，室溫下存放十五天之內不影響 檢測效果。本發明采用動物尿液和糞便作為樣品，可以檢出弓形蟲陽性結果。在人工 感染后80小時，可以從尿液和糞便中查出相應的核酸序列， 一方面說明弓形 蟲核酸在小鼠體內的代謝規律，另一方面說明PCR方法在通過尿液和糞便樣品 檢測弓形蟲的可行性。后續的血清學IHA試驗的結果說明弓形蟲感染的小鼠在 已能從排泄物中檢出陽性序列的40小時之后，仍未能從其血清中檢測到的特 異性抗體。通過排泄物檢測弓形蟲指標，可以避免傷害或處死動物，對于某些 價值較高的基因工程小鼠的質量檢測有很重要的意義，是對于減少、替代和優 化動物實驗的"3IT理論的施行，也是保障動物福利的具體實踐。本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所 揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特 征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發明的主要優點在于1、 簡化和標準化弓形蟲PCR診斷方法，最大可能地防止PCR檢測中的核酸 污染；2、 在保證診斷效果的情況下對動物無傷害。下面將結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于 說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。在本發明的實施例中，PCR反應的操作步驟如下 l.提取待檢樣品的DNA:(1) 取疑似弓形蟲病的病料(實驗大小鼠推薦采用動物的腹水、尿液或糞 便)；(2) 按照不同廠商的核酸提取試劑盒或者自配試劑進行，優選使用Qiagen Mini AmpDNA Kit。(3) 室溫晾干或倒置于超凈工作臺內風干，15-30分鐘。用雙蒸水溶解(難于溶解時，可56'C水浴15分鐘) 2.PCR加樣體系模板 雙蒸水即為模板，即用或-7(TC凍存備用10ul 40ul3.反應程序94'C預變性 94'C變性 60'C退火 72。C延伸3min如s 30s30個循環72。C延伸 7min4.電泳10pl擴增產物經2 %瓊脂糖凝膠電泳(加入少許EB或Goldenview核酸顯影劑 混勻)分離。同時在相鄰孔加適量DNAMarker,在5V/cm電壓下，lxTAE液中電泳30分鐘，在紫外成像儀下觀察結果。 [結果判定]
在約194bp位置出現特異性擴增帶，實驗結果為陽性(如圖l)。 實施例1
采用弓形蟲(7b^^力as鵬卵/ 力7)國際標準毒株RH株人工感染了實驗小 鼠(近交系C57 12只雌雄各半、遠交系ICR 24只雌雄各半和裸小鼠6只雌雄 各半，均購自上海市斯萊克實驗動物有限責任公司SCXK (滬)2003-003，動物 實驗在上海市計劃生育科學研究所動物房SYXK (滬)2003-019進行)，并設 生理鹽水對照組(近交系C57、遠交系ICR和裸小鼠各6只雌雄各半)。分別 于感染后第4至第120小時，每4小時收集一次小鼠的尿液和糞便(小鼠代謝 籠系蘇州馮氏實驗動物設備有限公司產品)，提取核酸后，采用預混凍干的PCR 反應管進行弓形蟲PCR檢測。感染后第120小時，動物采血，進行血清學檢測， 弓形蟲間接血凝(IHA)試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。結果， 弓形蟲感染后第80小時后，所有的感染組小鼠的尿液和糞便制樣均可PCR檢 測出陽性條帶，經克隆測序，與己知的弓形蟲B1基因片段同源性高達99%。對 照組小鼠的尿液和糞便均未出現特異性條帶，電泳結果僅見引物二聚體。IHA 試驗均為陰性結果。
實施例2
從2007年上海市實驗動物生產許可證五年到期復評審檢測中的六家不同 受檢單位的抽樣實驗小鼠，采集小鼠的尿液和糞便，共計6個品系(KM、 ICR、 裸小鼠、BALB/c、轉基因小鼠、C57) 78只小鼠148份核酸樣品。提取核酸后， 采用自制的弓形蟲PCR快速檢測試劑盒進行檢測。同時，使用德國genekam產 弓形蟲PCR檢測試劑盒作對比。除了試劑盒的比對，還進行了3人次的人員比 對。結果，PCR反應均為陰性，無論是自制的PCR快速所檢測的小鼠樣品中人 員比對的結果一致，德國genekam產品結果與自制的弓形蟲PCR快速檢測試劑 盒完全一致。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而己，并非用以限定本發明的實質技術 內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。序列表
〈110〉上海實驗動物研究中心
〈120〉 一種弓形蟲PCR檢測方法
<130〉 083019
<160> 2
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 21
〈212> DNA
〈213〉 人工序列
〈221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400> 1
ggaactgcat ccgttcatga g
<210〉 2
<211〉 20
〈212〉 廳
<213〉 人工序列
<221> misc—feature
<223> 引物
〈400〉 2
tctttaaagc gttcgtggtc
權利要求
1.一種弓形蟲PCR檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法包括步驟(1)將引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶穩定劑、四種單核苷酸、緩沖液、和PCR產物電泳前的上樣緩沖液混合，凍干成粉末；(2)將步驟(1)得到的粉末和樣品混合，進行PCR反應，得到PCR產物；和(3)將PCR產物進行電泳檢測；所述樣品包括抽提自哺乳動物尿液和/或糞便的核酸。
2. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
3. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的緩沖液是10X PCR緩 沖液，其中含有氯化鉀，Tris-HCl，和Triton X-100。
4. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的10X PCR緩沖液的配 方是5 0 OmM氯化鉀，1 0 OmM Tris-HCl， 1 v/v%Triton X-100，和雙蒸水。
5. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，PCR產物電泳前的上樣緩沖液 是10X上樣緩沖液，其中含有丙三醇，和GelRecP 。
6. 如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述的10X上樣緩沖液的配 方是5 Ov/v^丙三醇，和0. 05v/v%GelRed 。
7. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶為紅色。
8. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的哺乳動物選自靈長類 動物、貓科動物、犬科動物、或嚙齒類動物。
9. 如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的哺乳動物選自猴子、 豬、貓、犬、大鼠、或小鼠。
10. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品還包括陽性對照品 和陰性對照 品o
全文摘要
本發明公開了一種弓形蟲PCR檢測方法，所述的檢測方法包括步驟(1)將引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶穩定劑、四種單核苷酸、緩沖液、和PCR產物電泳前的上樣緩沖液混合，凍干成粉末；(2)將步驟(1)得到的粉末和樣品混合，進行PCR反應，得到PCR產物；和(3)將PCR產物進行電泳檢測；所述樣品包括抽提自哺乳動物尿液和/或糞便的核酸。
文檔編號C12Q1/68GK101649348SQ20081004155
公開日2010年2月17日 申請日期2008年8月11日 優先權日2008年8月11日
發明者濮俊毅, 胡建華, 誠 高 申請人:上海實驗動物研究中心