專利名稱：：一種雙歧桿菌生長促進因子及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種雙歧桿菌生長促進因子及其制備方法。
背景技術：
：在人體腸道中棲息著400多種、數量多達百萬億的細菌，其生物量達糞便干重的1/3-1/2。這些細菌按照對人體健康的影響可分為有益、有害和無害三類群，正常情況下這三類群細菌處于相對的平衡狀態。若人體有益菌如雙歧桿菌等處于優勢，則對凈化腸道、改善營養、維護人體健康起重要作用。雙歧桿菌(說yWok^ten'i/m)是一種益生菌，其主要功能有維持腸道菌群平衡，治療腸道功能紊亂；抗腫瘤作用；激活免疫系統，提高人體免疫機能;營養作用；控制內毒素的產生；降低自氧化作用，延緩機體衰老；降低血清中膽固醇含量；提高宿主對放射線的耐受性等。由于雙歧桿菌對營養要求苛刻，在大多數基質中生長緩慢，所以雙歧桿菌的培養和生長常常需要添加雙歧桿菌生長促進因子(bifidusfactor)來促進其繁殖和生長。現有的雙歧桿菌生長促進因子主要包括以下六類物質①純寡聚糖類物質..一般是由2-10個單糖通過糖苷鍵聚合在一起所形成的，如已知的乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、異麥芽糖等二十余種。②蛋白酶解產物及一些蛋白質類物質，如胃粘膜蛋白酶解產物，其生物活性部分為糖蛋白中的寡糖；酪蛋白酶解物；牛奶中的(x-乳清蛋白和乳鐵蛋白等。◎多糖類物質，如云芝多糖的水提物；胡蘿卜中的含氮多糖。短鏈脂肪酸類物質，如費氏丙酸桿菌產生的丙酸鹽(脂)能刺激和促進雙歧桿菌的生長繁殖。⑤天然植物及中草藥的提取物，如茶葉中的茶多酚；人參中的人參皂甙及五加科植物的水提物。⑥其他類物質，如雙泛酰硫乙胺和泛酰硫氫乙胺等。其中，現有的用作雙歧桿菌生長促進因子的蛋白酶解產物主要有酵母提取物、牛肉浸液和大豆酶解產物。現有的大豆酶解產物為只采用胰蛋白酶酶解大豆所得的產物。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種與現有的僅用胰蛋白酶酶解大豆制備雙歧桿菌生長促進因子的方法相比，具有更好的促進雙歧桿菌的繁殖和生長效果的新方法，以及由該方法制得的雙歧桿菌生長促進因子。本發明的方法為在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，更佳的還加入胰蛋白酶，將其與中性蛋白酶共同酶解大豆(Glycinemax(L.)Merrill),即制得本發明的雙歧桿菌生長促進因子。其中，所述的大豆的用量較佳的為7.99-20.00%;所述的水較佳的為去離子水，水的用量較佳的為79.80-92.00%;當僅用中性蛋白酶酶解豆漿時，中性蛋白酶的用量較佳的為0.01-0.2%;當用中性蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解時，中性蛋白酶的用量較佳的為0.005-0.1%，胰蛋白酶的用量較佳的為0.005-0.1%;上述百分比皆為占水、大豆和蛋白酶總質量的百分比，所述的蛋白酶為中性蛋白酶或中性蛋白酶加胰蛋白酶。其中，對各原料的要求為本領域常規要求，如胰蛋白酶的酶活為2000-2500u/mg;中性蛋白酶的酶活為100-130u/mg;大豆中水溶性蛋白230.0%，雜質^1.0%，水分^14.0%，子葉變色粒^5.0%;水較佳的為去離子水，去離子水中Na+S0.1%，SiO2<0.05%，pH值二6.5-7.5;百分比為質量百分比。其中，所述的酶解按本領域常規酶解方法操作。優選工藝步驟及其條件如下(1)向水和大豆混合磨槳制得的豆漿中加入酶進行酶解，之后加熱酶解液。所述的豆漿可采用市售的豆漿或按本領域常規方法自制。制備方法較佳的為將7.99-20.00%的大豆和自來水在40-8(TC混合3-10小時，之后用去離子水沖洗，再加入79.80-92.00%的去離子水混合磨漿，加熱到60-10(TC，維持2-20分鐘，冷卻至42'C，用氫氧化鈉調節豆漿pH為7.5-8.0。所述的酶解的溫度較佳的為30-60°C，酶解的時間較佳的為2-10小時。酶解之后，加熱酶解液的溫度較佳的為60-10(TC，加熱時間為2-20分鐘。(2)離心取上清液，微孔濾膜抽濾，濃縮，葡聚糖凝膠柱層析，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，濃縮至干即可。所述的離心取上清液的較佳操作為先以3024g的速度離心10-50分鐘，取上清液，之后再以10000-20000g的速度離心10-50分鐘。所述的微孔濾膜的孔徑較佳的為0.45^tm。所述的濃縮可采用旋轉蒸發儀進行濃縮，較佳的濃縮至蒸發前體積的1/6-1/5。所述的葡聚糖凝膠較佳的為葡聚糖凝膠SephadexG15。柱層析較佳的條件為濃縮物加入量為1毫升；洗脫液為質量百分比為0.01%-0.1%的乙酸銨，洗脫液用量為柱體積的2.5-3.5倍；洗脫液流速為0.4毫升/分鐘。洗脫液以收集波長為280nm的洗脫液為準，一般在洗脫7小時15分鐘至8小時20分鐘的時段進行收集。本發明還涉及由上述方法制得的雙歧桿菌生長促進因子。該雙歧桿菌生長促進因子可與益生菌合用，用于酸奶或豆酸奶的發酵；也可加入豆漿或牛奶中，用于促進雙歧桿菌的生長繁殖，提高雙歧桿菌的濃度，從而有利于雙歧桿菌生物制品的生產。本發明中所有的原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于首次用中性蛋白酶或中性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，酶解大豆，制成雙歧桿菌生長促進因子。其在促進雙歧桿菌生長的方面的效果大于僅用胰蛋白酶酶解得到的促進因子。該促進因子能很好促進益生菌的生長繁殖，提高雙歧桿菌的濃度和活菌數，活菌數是未添加此因子的10倍。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。雙歧桿菌丹麥丹尼斯克公司胰蛋白酶國藥集團化學試劑有限公司中性蛋白酶無錫市雪梅酶制劑科技有限公司葡聚糖凝膠型號為SephadexG15:GEHealthcareBio-sciencesAB公司凝膠柱型號為1.6X100cm層析柱上海錦華層析設備廠MRS培養基德國MerckkGaA公司下述各實施例中的大豆的水溶性蛋白=30.0%，雜質=1.0%，水分=14.0%，子葉變色粒=5.0%;去離子水中Na+=0.1%，SiO2=0.04%，pH值二7.0;百分比為質量百分比；實施例l、3和5中胰蛋白酶的酶活為2000u/mg;中性蛋白酶的酶活為100u/mg;實施例2、4、68和對比實施例中胰蛋白酶的酶活為2500u/mg;中性蛋白酶的酶活130u/mg。下述各實施例中的百分比皆為質量百分比。實施例1雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆8.00%和自來水于451:混合8小時，用去離子水沖洗，添加去離子水91.99%,磨漿，于65"C水浴加熱18分鐘，冷卻至42'C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟①制得的豆漿中添加中性蛋白酶O.OP/。，于35。C酶解8小時，于70。C水浴加熱18分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為IO分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為15000g，離心時間為35分鐘;④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.04%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。實施例2雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆'8.00。/。和自來水于4(TC混合10小時，用去離子水沖洗，添加去離子水91.99%，磨漿，于60。C水浴加熱20分鐘，冷卻至42"C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟①制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.005%和中性蛋白酶0.005%，于30'C酶解10小時，于6(TC水浴加熱20分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為IO分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為10000g，離心時間為50分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.01%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量450ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。實施例3雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆9.00。/。和自來水于8(TC混合3小時，用去離子水沖洗，添加去離子水90.96%,磨漿，于10(TC水浴加熱2分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調節pH值至7.5;②向步驟①制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.025%和中性蛋白酶0.025%，于6(TC酶解2小時，于100。C水浴加熱2分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為50分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45nm微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/6，得濃縮物；離心力為20000g，離心時間為10分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0,1%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量630ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。8實施例4雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆10.00%和自來水于60"混合4小時，用去離子水沖洗，添加去離子水89.95%，磨漿，于95。C水浴加熱4分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟①制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.02%和中性蛋白酶0.02%，于43。C酶解8小時，于95。C水浴加熱9分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為35分鐘；◎將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45)im微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為20000g，離心時間為25分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.05%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。實施例5雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆11.1P/。和自來水于53"C混合5小時，用去離子水沖洗，添加去離子水88.83%，磨漿，于90。C水浴加熱5分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.03%和中性蛋白酶0.03%，于42"酶解8小時，于9(TC水浴加熱10分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為30分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為18000g，離心時間為30分鐘；④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.05%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。實施例6雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆15.00。/。和自來水于70。C混合4小時，用去離子水沖洗，添加去離子水84.88%，磨漿，于80'C水浴加熱12分鐘，冷卻至42"C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.06%和中性蛋白酶0.06%，于44'C酶解7小時，于85。C水浴加熱15分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為25分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為15000g，離心時間為45分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.06%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。實施例7雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆20.00%和自來水于64"混合4.5小時，用去離子水沖洗，添加去離子水79.80%，磨漿，于75"C水浴加熱15分鐘，冷卻至42°C,用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟①制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.1%和中性蛋白酶0.1%，于44。C酶解7小時，于80。C水浴加熱20分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為40分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45nm微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為16000g，離心時間為40分鐘；④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.06%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。實施例8雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆漿將大豆20.00%和自來水于64°(:混合4.5小時，用去離子水沖洗，添加去離子水79.80%，磨漿，于75。C水浴加熱15分鐘，冷卻至42°C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟①制得的豆槳中添加中性蛋白酶0.2n/。，于44'C酶解7小時，于80'C水浴加熱20分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為40分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45)im微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為16000g，離心時間為40分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.06%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。對比實施例僅添加胰蛋白酶的雙歧桿菌生長促進因子的制造方法①制備豆槳將大豆11.11%和自來水于53"混合5小時，用去離子水沖洗，添加去離子水88.83%,磨漿，于9(TC水浴加熱5分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調節pH值至8.0;②向步驟①制得的豆漿中添加胰蛋白酶0.06。/。，于42'C酶解8小時，于90。C水浴加熱10分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時間為30分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45jiim微孔濾膜抽濾，蒸發水分至體積為蒸發前的1/5，得濃縮物；離心力為18000g，離心時間為30分鐘;④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.05%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測儀檢測，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長促進因子。效果實施例1雙歧桿菌生長促進因子對雙歧桿菌生長的促進作用將實施例18和對比實施例的雙歧桿菌生長促進因子按5%的比例添加至純豆漿培養基中，接種雙歧桿菌，與空白樣(指沒有添加過促進因子的豆漿)在相同條件下進行發酵培養，平板計數雙歧桿菌活菌數來考察雙歧桿菌促進因子的增殖作用。具體步驟如下-(1)浸泡將干豆洗凈，用50'C左右的溫水浸泡5小時；(2)磨漿用水沖洗后，進行磨漿，得空白樣；(3)向步驟(2)中的空白樣中添加雙歧桿菌生長促進因子；(4)滅菌90。C熱處理5分鐘；(5)預熱將步驟(4)得到的豆漿在無菌條件下預熱至約42。C;(6)接種在無菌條件下添加用無菌水溶解的雙歧桿菌菌粉，添加量為0.1g菌粉/100g豆漿；(7)發酵放置于42'C恒溫箱連續發酵7小時；(8)平板計數將發酵好的豆酸奶震蕩均勻，用無菌水按照10"的梯度進行梯度稀釋，使用雙歧桿菌檢驗用培養基TPY瓊脂培養基作培養基，通過平板計數法檢測活菌數，與空白樣相比，實施例18和對比實施例的雙歧桿菌生長促進因子增加的雙歧桿菌活菌的倍數列于表1中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由以上數據顯示，本專利所提及的提取物對雙歧桿菌的生長具有明顯的促進作用。效果實施例2雙歧桿菌生長促進因子對雙歧桿菌生長的促進作用2將實施例5的雙歧桿菌生長促進因子按5%的比例添加至MRS培養基中生長，接種雙歧桿菌，發酵培養，平板計數雙歧桿菌活菌數來考察雙歧桿菌促進因子的增殖作用。具體步驟如下(1)接種在無菌條件下將用無菌水溶解的雙歧桿菌菌粉添加到MRS培養基中，添加量為O.lg菌粉A00g培養基。MRS是微生物領域里常有的培養基，其MRS分別是MAN,ROGOSA，SHARPE三個單詞的縮寫；(2)將實施例5中的雙歧桿菌生長促進因子按5%的比例添加至步驟(1)得到的MRS培養基中生長；(3)發酵放置于42"C恒溫箱連續發酵7小時；(8)平板計數將發酵好的培養基，用無菌水按照10—1的梯度進行梯度稀釋使用雙歧桿菌檢驗用培養基TPY瓊脂培養基作培養基，通過平板計數法檢測活菌數，雙歧桿菌生長促進因子增加的雙歧桿菌活菌的倍數列于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1、一種雙歧桿菌生長促進因子的制備方法，其特征在于在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，即制得雙歧桿菌生長促進因子。2、如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的用量為0.01-0.2%;所述的百分比為中性蛋白酶質量占水、大豆和中性蛋白酶總質量的百分比。3、如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的酶活為100-130u/mg。4、如權利要求1所述的制備方法，其特征在于在水中進行所述的酶解時還加入胰蛋白酶，將其與中性蛋白酶共同酶解大豆。5、如權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的用量為0.005-0.1%;胰蛋白酶的用量為0.005-0.1%;所述的百分比為中性蛋白酶或胰蛋白酶的質量占水、大豆、中性蛋白酶和胰蛋白酶總質量的百分比。6、如權利要求1或4所述的制備方法，其特征在于所述的大豆的用量為7.99-20.00%;所述的水的用量為79.80-92.00%;所述的百分比為大豆或水占水、大豆、和蛋白酶總質量的百分比，所述的蛋白酶為中性蛋白酶，或中性蛋白酶加胰蛋白酶。7、如權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的胰蛋白酶的酶活為2000-2500u/mg。8、如權利要求1所述的制備方法，其特征在于其包含下述步驟(1)向水和大豆混合磨漿制得的豆漿中加入酶進行酶解，之后加熱酶(2)離心取上清液，微孔濾膜抽濾，濃縮，葡聚糖凝膠柱層析，收集紫外光波長為280nm的洗脫液，濃縮至干即可。9、如權利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述的豆漿的pH為7.5-8.0;所述的酶解的溫度為30-60°C，酶解的時間為2-10小時；酶解之后，所述的加熱酶解液的溫度為60-10(TC，加熱時間為2-20分鐘；步驟(2)中，所述的離心取上清液的操作為先以3024g的速度離心10-50分鐘，取上清液，之后再以10000-20000g的速度離心10-50分鐘；所述的微孔濾膜的孔徑為0.45所述的濃縮的操作為濃縮至蒸發前體積的1/6-1/5;所述的葡聚糖凝膠柱為葡聚糖凝膠SephadexG15;柱層析條件為濃縮物加入量為1毫升；洗脫液為質量百分比為0.01%-0.1%的乙酸銨，洗脫液用量為柱體積的2.5-3.5倍；洗脫液流速為0.4毫升/分鐘；在洗脫7小時15分鐘至8小時20分鐘的時段進行收集。10、用權利要求19任一項所述的方法制得的雙歧桿菌生長促進因子。全文摘要本發明公開了一種雙歧桿菌生長促進因子的制備方法在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，即制得雙歧桿菌生長促進因子。本發明還涉及本發明的雙歧桿菌生長促進因子的制備方法制得的雙歧桿菌生長促進因子。本發明首次用中性蛋白酶或中性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，酶解大豆，制成雙歧桿菌生長促進因子。其在促進雙歧桿菌生長的方面的效果大于僅用胰蛋白酶酶解得到的促進因子。該促進因子能很好促進益生菌的生長繁殖，提高雙歧桿菌的濃度和活菌數，活菌數是未添加此因子的10倍。文檔編號C12P21/06GK101643765SQ20081004138公開日2010年2月10日申請日期2008年8月5日優先權日2008年8月5日發明者徐成勇,王蔭榆,郭本恒申請人:光明乳業股份有限公司