萘雙加氧酶植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：萘雙加氧酶植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物遺傳育種領(lǐng)域，尤其涉及帶有惡臭假單胞菌(/^ewt/owo"w pz^Wfl )萘雙加氧酶基因序列表達(dá)載體的構(gòu)建，更具體的 涉及利用農(nóng)桿菌(Jgra6"cfeWww ^附e/a"'e"s)將萘雙加氧酶基因表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化到植物中，從而促使植物對(duì)萘的降解。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)及其衍生 物是一類(lèi)廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物。多環(huán)芳烴含有兩個(gè)或兩個(gè)以上 苯環(huán)的碳?xì)浠衔铮煞譃榉枷愠憝h(huán)和非芳香稠環(huán)型，環(huán)境污染研究中的 多環(huán)芳烴 -般是指芳香稠環(huán)型，其中16種多環(huán)芳烴化合物已被美國(guó)環(huán)保 局列入優(yōu)先控制的污染物黑名單。多環(huán)芳烴大多是石油、煤等化石燃料以 及木材、天然氣、有機(jī)高分子化合物、紙張、作物秸稈和煙草等含碳?xì)浠?合物的物質(zhì)經(jīng)不完全燃燒或在還原性氣氛中經(jīng)熱分解而生成的，PAHs環(huán) 數(shù)相對(duì)豐度可以反映來(lái)自熱解或石油類(lèi)污染,通常4環(huán)及4環(huán)以上PAHs主 要來(lái)源于化石燃料高溫燃燒,而2環(huán)和3環(huán)PAHs則來(lái)源于石油類(lèi)污染。-般而言2 — 3環(huán)的低分子量PAHs具有顯著的急性毒性，而某些高分子量的 PAHs則具有潛在的致癌性，有很強(qiáng)的致畸、致癌和致突變作用。近些年，隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的加快，土壤中多環(huán)芳烴(PAHs)的污染 程度越來(lái)越重，工業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)尤為突出。由于土壤有機(jī)質(zhì)對(duì)PAHs具有很 強(qiáng)的吸附作用，有機(jī)質(zhì)含量高時(shí)PAHs易富集，有機(jī)質(zhì)含量與PAHs殘留量 存在顯著相關(guān)性。土壤中多環(huán)芳烴污染的主要途徑有污水灌溉、大氣沉降、 廢物傾倒和工業(yè)漏滲。多環(huán)芳烴化合物(PAHs)由于水溶性差，辛醇-水 分配系數(shù)高，常被吸附于土壤顆粒上。因此，該類(lèi)化合物易于從水中分配 到生物體內(nèi)、沉積層中，土壤就成為PAHs的主要載體。多環(huán)芳烴在環(huán)境 中不斷積累，其半衰期從幾個(gè)月到幾年不等。多環(huán)芳烴進(jìn)入土壤后，由土 壤表面污染進(jìn)一歩導(dǎo)致下層土壤污染，甚至地下水污染。治理多環(huán)芳烴化合物(PAHs)污染主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物 修復(fù)。同其它有機(jī)污染物相比，多環(huán)芳烴化合物在土壤中比較穩(wěn)定，利用 促使其揮發(fā)和降解的物理化學(xué)方法很難去除，國(guó)內(nèi)外正在篩選高效的吸附 劑及臭氧化降解途徑。近年來(lái)，生物修復(fù)技術(shù)為PAHs的降解提供了新的 途徑，生物降解在污染物的遷移轉(zhuǎn)化直至最終消失的過(guò)程中占重要地位(Berardez et s丄 Environmental Science & Technology 2004， 15: 5878-5887)。生物修復(fù)(Bioremediation)的基礎(chǔ)是自然界中微生物對(duì)污染物的 生物代謝作用，因此早期的生物修復(fù)主要指微生物修復(fù)。微生物修復(fù)已經(jīng) 發(fā)展出一系列技術(shù)，如現(xiàn)場(chǎng)處理、就地處理和生物反應(yīng)器，其中生物反 應(yīng)器在修復(fù)多環(huán)芳烴污染的土壤中研究較多。許多細(xì)菌、真菌和藻類(lèi)自身 都有一定的降解PAHs的能力，因此在PAHs污染的土壤中，經(jīng)過(guò)自然馴化， 可以找到大量的能降解多環(huán)芳烴的微生物。近年來(lái)人們對(duì)降解多環(huán)芳烴的 微生物進(jìn)行了廣泛的研究，常見(jiàn)微生物有紅球菌屬(朋oAcoc"w)、假單 月包菌屬(尸se〃c/o/ 7(9/7SS)、 分枝桿菌(#yco^acteri〃/z )、 芽孢桿菌屬 (fed"7A/5")、 黃桿菌屬(/^7araZ^cten'脂)、氣單胞菌屬(^ero膨/7a5")、 拜 葉氺木克氏菌屬(Sej」'e777cAj'a)、 棒4犬木干菌屬(6brj77e厶sc teri〃/z ) 、■藍(lán)纟冚菌 (6>a/7o/ <3cterj'<3)、，敫i求菌屬(^z'crococciAs) 、 i若卡氏菌屬(yVocaro7a)禾口 弧菌屬(W6r")等。由于微生物種類(lèi)不同以及多環(huán)芳烴較難在環(huán)境中降解，所以降解 PAHs的途徑就有較大的差別。微生物產(chǎn)生加氧酶的能力決定了多環(huán)芳烴 的降解程度。多環(huán)芳烴的最初氧化，即苯環(huán)加氧是控制PAHs生物降解反 應(yīng)速度的關(guān)鍵步驟。其中，對(duì)好氧細(xì)菌降解多環(huán)芳烴的研究主要集中在假 單胞菌的萘降解途徑的分析上。以此為例，假單胞菌是通過(guò)羥基化作用分 角軍蔡，i亥過(guò)程由蔡雙力口氧酷(naphthalene dioxygenase ND0 EC: 1. 14. 12. 12)系統(tǒng)的參與。目前對(duì)該酶的研究結(jié)果主要來(lái)自惡臭假單胞菌 (尸酒J,腐G7菌株，該菌中萘加氧酶(EC: 1.14.12.12) 系統(tǒng)的三個(gè)組分分別是鐵硫黃素蛋白還原酶NahAa (EC: 1.14.12.12)、 鐵氧還蛋白NahAb和加氧酶(EC: 1.14.12.12)，加氧酶由大亞基NahAc 和小亞基NahAd組成四聚體，電子從NAD(P)H通過(guò)鐵硫黃素蛋白還原酶和鐵氧還蛋白向加氧酶?jìng)魉?，促進(jìn)加氧酶將兩個(gè)氧原子加到萘的一個(gè)苯環(huán)上。微生物修復(fù)雖然具有很多優(yōu)點(diǎn)，如成本低，只有物理化學(xué)處理的 1/3左右；處理靈活，可以進(jìn)行原地或異地處理。但是由于微生物生長(zhǎng)受 溫度、氧氣、水分、酸堿度和土壤的微生物環(huán)境影響，常常導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果 出入很大，造成該方法難以得到廣泛應(yīng)用。利用植物治理土壤污染是一類(lèi)節(jié)能且對(duì)環(huán)境相對(duì)安全的方法。與微生 物修復(fù)相比，植物修復(fù)更適應(yīng)原地修復(fù)，它具有修復(fù)面積大、投資少、不 破環(huán)場(chǎng)地結(jié)構(gòu)、不引起地下水二次污染等優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)重金屬和有機(jī)污染物 的處理中已顯示明顯的有效性，有的已經(jīng)達(dá)到野外應(yīng)用的水平。從國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀來(lái)看，對(duì)多環(huán)芳烴污染土壤的植物修復(fù)研究主要集中在從自然界中篩選具有特異同化能力的植物。但是Ellwart P.等人 (Processing symposium on soil organic matter studies 1997， 291—298)進(jìn) 行的大田試驗(yàn)顯不大多數(shù)農(nóng)作物根系不具有吸收多環(huán)芳烴的能力近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)了有些植物能降解多環(huán)芳烴化合物，如高羊茅 草、黑麥草和苜蓿草等，其對(duì)多環(huán)芳烴污染的土壤均有不同程度的修復(fù)作用。申請(qǐng)?zhí)枮?0041001763.1中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了在多環(huán)芳烴污染 的土壤中種植黑麥草或紅三葉植物，再向土壤中施加易降解的非離子表面 活'性劑聚氧乙烯去水山梨醇單油酸脂或月桂醇聚氧乙烯醚溶液，對(duì)多環(huán)芳 烴等有機(jī)污染土壤的修復(fù)效果好。但是該方法必須種植黑麥草或紅二葉植 物的情況下才能實(shí)施。對(duì)多環(huán)芳烴的吸收速率取決于植物種類(lèi)和土壤中多環(huán)芳烴濃度，土壤 屮多環(huán)芳烴濃度越高，能吸收多環(huán)芳烴的植物其多環(huán)芳烴吸收量則越多。 大部分研究表明，植物能部分代謝多環(huán)芳烴，這為植物修復(fù)土壤中多環(huán)芳 烴提供了支持。植物主要通過(guò)兩種機(jī)制清除土壤中的多環(huán)芳烴污染(1) 直接吸收作用，黑麥草可從環(huán)境中直接吸收大量的苯并芘等多環(huán)芳烴化合 物，導(dǎo)致土壤和水體中多環(huán)芳烴化合物含量大幅下降；(2)釋放分泌物促 進(jìn)植物根際微生物的生長(zhǎng)，微生物加速污染物降解。孫鐵珩(應(yīng)用生態(tài)學(xué) 報(bào)，1999,10， 225-229)研究多環(huán)芳烴降解時(shí)發(fā)現(xiàn)，多環(huán)芳烴降解速率 與植物根區(qū)微生物正相關(guān)。土壤微生物本身能降解多環(huán)芳烴，但在苜蓿草存在的情況下，降解能力提高2-4. 7%，而接種菌根菌能提高黑麥草在高濃度多環(huán)芳烴中的存活率，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。申請(qǐng)?zhí)枮?0051003845.3中 國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了利用紫花苜蓿(Medicago Sativa)，并且選用菌根 真菌和根瘤菌雙接種極顯著地促進(jìn)了紫花苜蓿根區(qū)土壤中多氯聯(lián)苯、多環(huán) 芳烴的降解能力，但是該方法仍然沒(méi)有擺脫利用特殊植物和微生物聯(lián)合對(duì) 土壤中的多環(huán)芳烴進(jìn)行降解的缺陷。由于大多數(shù)農(nóng)作物根系不吸收多環(huán)芳烴，所以必須依賴(lài)有限的植物種 類(lèi)或通過(guò)特定植物與微生物共同作用的方式實(shí)現(xiàn)土壤中的多環(huán)芳烴進(jìn)行 降解。發(fā)明內(nèi)容為了解決上述利用植物治理土壤污染中的問(wèn)題，促使植物根系對(duì)土壤 中的多環(huán)芳烴的降解，本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開(kāi)一種帶有微生物萘雙加軾酶基因序列的載體。本發(fā)明又一個(gè)目的在于公開(kāi)一種帶有微生物萘雙加氧酶基因序列的 載體構(gòu)建方法。本發(fā)明再--個(gè)目的在于公開(kāi)…種利用農(nóng)桿菌將萘雙加氧酶表達(dá)載體在培rr植物以促使降解土壤中萘的應(yīng)用。本發(fā)明所述的微生物萘雙加氧酶為惡臭假單胞菌(Ae W，o/7M p""Wa) G7菌株中的萘加氧酶(EC: 1.14.12.12)系統(tǒng)，三個(gè)部分分別 是鐵硫黃素蛋白還原酶NahAa、鐵氧還蛋白NahAb和加氧酶，加氧酶由 大亞基NahAc和小亞基NahAd組成四聚體。各個(gè)部分的基因經(jīng)過(guò)采用植 #勿{扁'愛(ài)密石馬(參考Kawabe Wa/， fe/7es s/7t/"e/ etic 6>5^e/ s， 2003， 78， 343-352)進(jìn)行改造后的具體編碼序列分別為NahAa (SEQ. ID No. 1)5'ATGGAATT(;TTGATTCAACCAAACAATCGCTTGATTTCTTTTAGTCCAGGTGCCAACTTGTTGGAAGTTTTGNahAb (SEQ. ID No. 2)5TTGCGTGTAATGATTGATTTGTCTGGTGAGTTTTAA 3' NahAc (SEQ. ID No. 3)懸Ad (SEQ. ID No. 4)5TTCTTGTGA 3'本發(fā)明所述的載體是在pYPX245 (AY178049)植物表達(dá)載體(具體系列公布在National Center for Biotechnology Information, NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站上)的BamHI和Sacl酶切位點(diǎn)之間插入NahA基因編碼序列， 從而構(gòu)建成pYPXnahA重組質(zhì)粒。該表達(dá)載體還包含GUS報(bào)告基因和帶內(nèi) 含子卡那霉素抗性標(biāo)記基因(參考中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL00119594. 8)。'具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的NahA基因編碼序列是通過(guò)口蹄疫病毒2A 蛋白(NP一740461，以下簡(jiǎn)稱(chēng)2A蛋白)將萘雙加氧酶四個(gè)亞基的核苷酸 序列依次串聯(lián)所形成的融合基因，串聯(lián)的具體形式為NahAa-2A蛋白一 Nah Ab — 2 A蛋白一 Nah Ac — 2A蛋白一NahAd，當(dāng)這些蛋白在植物中表達(dá)后， 能夠被準(zhǔn)確地切割成獨(dú)立的NahAa、 NahAb、 NahAc禾卩NahAd。更具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的口蹄疫病毒2A蛋白全部使用植物偏愛(ài)的 三聯(lián)子密碼，其基因序列具體為CTGTTGAATTTCGATCTTCTTAAGCTTGCTGGTG ATGTTGAATCCAACCCAGGTCCA (SEQ. ID No. 5)。本發(fā)明所述的帶有微生物萘雙加氧酶基因序列的載體通過(guò)如下方法1、萘雙加氧酶各亞基基因的合成具體合成力'法參考Ai-Sheng Xiong， Quan_Hhong Yao， Ri-He Peng，Xian Li ， Huiqin Fan, Zong-ming Cheng and Yi Li ， 7V〃c7eic爿cic/7fesesrc力，2004， 32(12)， e98:l 10引物均為5'端至3'端，其中末端字母"Z"表示"正向"，"F"表示"反向"。萘雙加氧酶a亞基合成引物NahAalZ:AACTTGTTGGAAGNahAalF:TCCAACAAGTTGGCACCTGGACTNahAa2Z:GGTAATTGANgLhAa2F:TCAGTAACANahAa3Z: TGGCTNahAa3F: AATGCTCNahAa4Z: TCATCAAGNahAa4F: CTGGATGANahAa5Z: CGAGTTCTNahAa5F: TTAGCNahAa6Z: TGATCAAGNahAa6F: AACCAGCCNahAa7Z: GTACTTCNahAa7F: TTTGNahAa8Z: GGTGGGACNahAa8F: ACACAACANahAa9Z:TTCGGTGNahAa9F: AGATGGGGTNahAalOZ: TCATACNahAa跳 AGTTGTGGANahAallZ: CATTTCTTTGNahAallF: TTTTTCGANahAal2Z: TTGGANahAal2F: CAAGATGCTTGGTAAC萘雙加氧酶b亞基合成引物NahAblZ: GTCCTCNahAblF: CTGGGATNahAb2Z: TGCACGCANahAb2F: TCGGTAGNahAb3Z: CGACGTC薩TCNahAb3F: CTTGATGNahAb4Z:NahAb4F: GT萘雙加氧酶c亞基合成弓 NahAclZ:TTGNahAclF: GTCAAACCANahAc2Z: GATTCTTNahAc2F: AGAACANahAc3Z: T TGGTNahAc3F: GACGAGANahAc4Z: GTTTCGNahAc4F: GTTACCNahAc5Z: GGTGAGTNahAc5F: TCCTTTTGCNahAc6Z: CTTCGATNahAc6F: AGATGAANahAc7Z: GTGGTTTNahAc7F: GAAGNahAc8Z: GATGCATNahAc8F: AAGTTTTCNahAc9Z: CTGTTCTGNahAc9F: CAGCCAANahAclOZ: TGGTGNahAclOF: CATCCCACNahAcllZ: CGGTGATGNahAcllF: TTGTTCANahAcl2Z: GTGTTCAGGTCAA GAGGATTT'G
TATCCTTC
CAACATG
TCATC
AGGATGT
AACCCAAG
TCGTGCTT
CACGA
CGAACTCAGCCCAGTTGGA (SEQ. ID No.70) 萘雙加氧酶d亞基合成引物
TTTCTTC
CGTCGTGTTGGACAT
NahAd2F: GCTTCCC
NahAd3Z: GCGT
NahAd3F: GTGAAAT
NahAd4Z: GTATCGAG
NahAd4F: CAATTGC
NahAd5Z: GCTGCAC
NahAd5F: ATTGGT
NahAd6Z: GTT( GGTAGAT
NahAd6F: CACGACG
NahAd7Z: TGGATTAC
NahAd7F: GAATCGCTGGACC
2、萘雙加氧酶各亞基基因與口蹄疫病毒2A蛋白的串聯(lián) 通過(guò)連續(xù)延伸PCR，將口蹄疫病毒2A蛋白與萘雙加氧酶歩驟1所得 的四個(gè)亞基基因序列串聯(lián)形成融合基因NahA。(參考上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999， 15， 11一16)
3、 pYPXnahA表達(dá)載體的構(gòu)建
本發(fā)明利用BamHI和Sacl進(jìn)行雙酶切后，通過(guò)T4 DNA連接酶將步驟 2中得到的融合基因NahA的萘雙加氧酶基因與含有雙35S啟動(dòng)子的 pYPX245 (AY178049)植物表達(dá)載體連接。
4、 獲得pYPXnahA表達(dá)載體
在上述步驟3之后，通過(guò)質(zhì)粒純化得到該表達(dá)載體。
本發(fā)明所述的利用農(nóng)桿菌將萘雙加氧酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中方法 的具體歩驟為
1、載體的導(dǎo)入
包括農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一電擊法導(dǎo)入載體一培養(yǎng) .2、轉(zhuǎn)化到植物中
農(nóng)桿菌介導(dǎo)將萘雙加氧酶基因轉(zhuǎn)化到水稻中的具體方法參考劉巧 全，植物生理學(xué)報(bào)，1998， 24(3)， 259 271
農(nóng)桿菌介導(dǎo)將萘雙加氧酶基因轉(zhuǎn)化到煙草和番茄的具體方法參考美
國(guó)發(fā)明專(zhuān)利US6， 323， 396，
農(nóng)桿菌粘花法轉(zhuǎn)化將萘雙加氧酶基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中的具體方法參 考Plant J. 1998， 16， 735 - 743
通過(guò)上述方法轉(zhuǎn)化的攜帶有假單胞菌雙加氧酶基因的植物能持續(xù)表 達(dá)萘雙加氧酶，并能促使植物參與萘的降解，從而可以為植物修復(fù)萘污染 提供有益的幫助。為這方面的植物品種提供了新選擇，克服了對(duì)特定植物 單獨(dú)或與微生物相組合實(shí)現(xiàn)土壤植物修復(fù)的依賴(lài)。
含有萘雙加氧酶基因的植物安全穩(wěn)定，對(duì)植物生長(zhǎng)沒(méi)有不良影響，對(duì) 環(huán)境污染很小。


圖lpYPXnahA萘雙加氧酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建； 圖2萘雙加氧酶基因轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)出萘的耐受能力，其中CK表示對(duì) 照植株，Sl、 S3、 S7和S12為轉(zhuǎn)基因植株，WT表示野生型植株。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明 本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō) 明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或 者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā) 明的權(quán)利要求范圍中。
本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自西格瑪一奧德里奇(Sigma — Aldrich)公司。
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒(méi)有特別注明，均參考自《分子克隆》 -書(shū)(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版 社。)
實(shí)施例l:按照植物偏愛(ài)密碼重新合成編碼萘雙加氧酶系統(tǒng)a、 b、 c和
d亞基基因。
引物均為5'端至3'端，其中末端字母"Z"表示"正向"，"F" 表小"反向"。
萘雙加氧酶a亞基基因合成引物 NahAalZ:
AACTTGTTGGAAG
NahAalF: TCCAACAAGTTGGCACCTGGACT
NahAa2Z: GGTAATTGA
NahAa2F: TCAGTAACANahAa3Z: TGGCT
NahAa3F: AATGCTC
NahAa4Z: TCATCAAG
NahAa4F: CTGGATGA
NahAa5Z: CGAGTTCT
NahAa5F: TTAGC
NahAa6Z: TGATCAAG
NahAa6F: AACCAGCC
NahAa7Z: GTACTTC
NahAa7F: TTTG
NahAa8Z: GGTGGGAC
NahAa8F: ACACAACA
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〕TTGATCATCTGGCA
〕TTANahAa9F: AGATGGGGT
NahAalOZ: TCATAC
NahAalOF: AGTTGTGGA
NahAallZ: CATTTCTTTG
NahAallF: TTTTTCGA
NahAal2Z: TTGGA
NahAal2F: CAAGATGCTTGGTAAC
萘雙加氧酶b亞基基因合成引
NahAblZ: GTCCTC
NahAblF: CTGGGAT
NahAb2Z: TGCACGCA
NahAb2F: TCGGTAG
NahAb3Z: CGACGTC
NahAb3F:CTTGATG
NahAb4Z:
NahAb4F: GT
萘雙加氧酶c亞基基因合成引物 NahAclZ:
TTG
NahAclF: GTCAAACCA
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TGGTG
CATCCCAC
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NahAc1 IF: TTGTTCA
NahAc12Z: GTGTT
NahAc12F:CAGGTCAA
NahAcl3Z: GAGGATTTG
NahAcl3F: TATCCTTC
NahAcl4Z: CAACATG
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萘雙加氧酶d亞基基因合成引
NahAdlZ: TTTCTTC
NahAdlF: CGTCGTG
NahAd2Z: TTGGACAT
:TCTTGGGGCTTCCC
GCGT
GTGAAAT
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TGGATTAC
GAATCGCTGGACC
以NahAa 1-NahAa 12引物對(duì)為引物，利用PCR (Polymerase Chain Reaction)進(jìn)行擴(kuò)增NahAa片段。在50l4反應(yīng)體系中，NahAalF-NahAal2Z 共22個(gè)引物的添加量為2ng， NahAalZ和NahAal2F 2個(gè)引物添加量為30ng， 擴(kuò)增條件(Protocol)依次為94°C，預(yù)熱lmin; 94°C， 30s; 50°C， 30s; 72°C， lmin。共25個(gè)循環(huán)。以NahAbl-NahAb4引物對(duì)為引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增NahAb片段，在 反應(yīng)體系中，NahAblF-NahAb4Z共6個(gè)引物的添加量為2ng， NahAblZ和 NahAb4F 2個(gè)引物添加量為30ng，擴(kuò)增條件(Protocol)依次為94°C，預(yù) 熱l min; 94。C，30s; 50°C， 30s; 72°C， lmin。共25個(gè)循環(huán)。以NahAcl-NahAc12引物對(duì)為引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增NahAc片段，在 5014反應(yīng)體系中，NahAclF-NahAcl6F共31個(gè)引物的添加量為2ng， NahAclZ 和NahAcl7F2個(gè)引物添加量為30ng，擴(kuò)增條件(Protocol)依次為94°C， 預(yù)熱lmin; 94。C，30s; 50°C， 30s; 72°C， lmin。共25個(gè)循環(huán)。以NahAdl-NahAd7引物對(duì)為引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增NahAd片段， 在50W反應(yīng)體系中，NahAdlF-NahAd7Z共22個(gè)引物的添加量為2ng， NahAdlZ和NahAd7F 2個(gè)引物添加量為30ng，擴(kuò)增條件(Protocol)依 次為94°C,預(yù)熱lmin; 94。C，30s; 50°C ， 30s; 72°C， lmin。共25個(gè)循 環(huán)。PCR結(jié)束后，1% (W/V)瓊脂糖膠電泳后回收，分別取回收產(chǎn)物直接 與T/A克隆載體(寶生物工程(大連)有限公司，D103A)相連。fC連接過(guò) 夜，42。C熱激后，高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。實(shí)施例2:萘雙加氧酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建將合成的萘雙加氧酶四個(gè)亞基NahAa、 NahAb、 NahAd和NahAd與口蹄疫病 毒2A蛋白植物偏愛(ài)編碼序列串聯(lián)(參考上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999， 15， 11 — 16)，分別合成卜 NahAaZ: NahAaF:GAAGNahAbZ:TTGAAG NahAbF:GTCG力J引物，其中末端字母"Z"表示"正向"，"F"表示"反向"GAGAGGATCCATGGAATTGTTGATTCAACCAAACAGACAAGNahAdF: GAGCATGAGCTCTCACAAGAAGACCATCAAG以NahAaZ-NahAdF為引物，利用PCR將NahA四個(gè)亞基串連，在5(￥1反應(yīng) 體系中，NahAaF-NahAdZ共6個(gè)引物的添加量為2ng， NahAaZ和NahAdF 2個(gè) 引物添加量為30ng，擴(kuò)增條件(Protocol)依次為94°C，預(yù)熱lmin; 94 。C，30s; 50。C，30s; 72。C，4min。共25個(gè)循環(huán)。分別用BamHI和SacI (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行雙酶切， 問(wèn)收DNA片段，通過(guò)T4DNA連接酶將萘雙加氧酶融合基因與含有雙35S啟動(dòng) 子的pYPX245質(zhì)粒(AY178049 NCBI)連接一純化，酶切鑒定和序列測(cè)定 獲得丫含有萘雙加氧酶基因的重組質(zhì)粒pYPXnahA (參考《分子克隆》一 書(shū)(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版社)。 該表達(dá)載體還包含GUS報(bào)告基因和帶內(nèi)含子卡那霉素抗性標(biāo)記基因。實(shí)施例3:農(nóng)桿菌培養(yǎng)和植物轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105、 LBA4404、 GV3101或AGL-1菌株 (the American Type Culture Collection, ATCC)。質(zhì)粒經(jīng)電擊法導(dǎo) 入農(nóng)桿菌中。挑取單菌到25mlYEB培養(yǎng)基(加有50mg/l利福平)培養(yǎng)過(guò) 夜，取5ml菌液轉(zhuǎn)接到lOOmlYEB培養(yǎng)基(加有50mg/l利福平)，培養(yǎng) 至0。固=0. 7-0. 8，菌液冰上放置10分鐘，6000g， 4°C，離心10min。去 上清收集菌體，加入100ml無(wú)菌雙蒸水清洗兩次。加入4mll0y。 (V/V)甘 油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到50ml離心管。6500g4°C，離心10min。收集菌體，加 入500^110% (V/V)甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到1.5ml離心管，所得即為感受態(tài) 菌體。取感受態(tài)細(xì)胞，加入重組質(zhì)粒pYPXnahA。混勻，轉(zhuǎn)到0. lcm電擊杯中。電擊參數(shù)200 Q ， 1. 7KV， 2. 5F，電擊后立即加入800PlS0C 培養(yǎng)液。培養(yǎng)1小時(shí)后，取100m涂抗性板含lOOu g/ml氯霉素YEB培 養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，2『C培養(yǎng)。擬南芥粘花法轉(zhuǎn)化含目的質(zhì)粒(pYPXnahA)的農(nóng)桿菌菌株單菌落接菌在5毫升含100 )x g/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中28。C培養(yǎng)2天。將5毫升菌液轉(zhuǎn)到500毫升的液體LB 培養(yǎng)基中28°〇培養(yǎng)16-24小時(shí)(0D=1. 5-2. 0)。液體可以在4。C保存30天， 室溫下離心收集菌體，4000g離心10分鐘。用等體積5% (W/V)的新鮮蔗糖 溶液懸浮。加入O. 02。/o的Silwet-77 (購(gòu)自廈門(mén)泰京生物技術(shù)有限公司)混勻后 轉(zhuǎn)移到燒杯中。每個(gè)菌株用300毫升轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)2-3缽。隔7天后再轉(zhuǎn)化1 次。將擬南芥倒置后浸入菌液中IO秒鐘。蓮座和花序都要侵染。侵染后將 轉(zhuǎn)化植株菌液烘干3-5秒。用保鮮膜將轉(zhuǎn)化植株密封，平放16-24小時(shí)。轉(zhuǎn) 化后不要放置在高溫和強(qiáng)光下。揭開(kāi)保鮮膜，保持一定濕度，再生長(zhǎng)1個(gè)W 后收種子。利用50Pg/mL潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株篩選。煙 一:和番茄轉(zhuǎn)化挑選較飽滿的種子，用75%的酒精清洗1分鐘，次氯酸鈉加1滴土溫20 滅菌10分鐘，種子鋪在MS培養(yǎng)基上，28度培養(yǎng)待發(fā)芽。將煙草幼葉，番茄 子葉或下胚軸剪成lcm2，放入MS+萘乙酸(NAA1) (lug/ml)+細(xì)胞分裂素(BA2) (4ug/ml)的培養(yǎng)基中，22度培養(yǎng)1天。農(nóng)桿菌培養(yǎng)0D0. 8-1. 0后離心5000g 離心8分鐘，無(wú)菌水清洗一次，等體積MS培養(yǎng)液懸浮侵染8分鐘后，吸干放 置在MS十NAA1+BA2的培養(yǎng)基中，22度共培養(yǎng)3天。然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS+ 口引哚乙酸(0. lug/ml)+玉米素(2ug/ml)+羧節(jié)青霉素(500ug/ml)+卡那霉素 (50ug/ml)培養(yǎng)2-3周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS十卩引哚乙酸(O. lug/ml)+玉米素 (2ug/ml) +羧芐青霉素(500ug/ml) +卡那霉素(100ug/ml)培養(yǎng)2-3周，最后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+n引哚乙酸(0. lug/ml)培養(yǎng)。水稻轉(zhuǎn)化N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，去殼的種子，授粉后12-15天的幼胚，經(jīng)表面 消毒后接種到N6D2培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，水解乳蛋白(上海生物工程有限公 司)500mg/L，蔗糖30g/L， 2，4-二氯苯氧乙酸鈉鹽2mg/L，植物凝膠(Sigma 一Aldrich) 2. 5g/L， pH5. 8)中誘導(dǎo)愈傷組織；培養(yǎng)4-7天后取愈傷組織進(jìn)行 轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌培養(yǎng)0D600 (0.8-1.0)后離心5000g離心8分鐘，雙蒸水清洗 一次，等體積MS培養(yǎng)液懸浮侵染8分鐘后，吸干放置在MS+NAA1+BA2的培養(yǎng) 基中，22度共培養(yǎng)3天。然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基加入羧芐青霉素(500ug/ml)和 潮霉素(HAT) (50ug/ml)，轉(zhuǎn)化后的愈傷在含有和的抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 4 代，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(2mg/L激動(dòng)素KT);幼芽長(zhǎng)至2mm轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng) 基(1 / 2MS+0. 5mg / L U引哚丁酸)。以上培養(yǎng)基中分別加入500mg / L酶水 解乳蛋白，0 700 mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30 80g/L，瓊脂6克。 pH5.8。繼代周期為25d。將淡黃色的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，30d 左右分化出芽。光照強(qiáng)度1500 20001x， 12 14h/d。從獲得的抗性植株中取一部分葉子，侵入含有X-GLUC的染色液中， 篩選葉片變藍(lán)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)，提取葉片總DNA，參照《分子 克降》的方法，以NahAaZ和NahAdF為引物對(duì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢 測(cè)，擴(kuò)增條件(Protocol)為:94。C，預(yù)熱lmin; 94。C，30s; 60。C，30s; 72。C，4mm。共25個(gè)循環(huán)。從分子水平上證明目的基因是否導(dǎo)入。實(shí)施例4:萘雙加氧酶基因轉(zhuǎn)化植物后對(duì)萘的降解 多環(huán)芳烴對(duì)很多植物的根有毒害作用，芘對(duì)小麥根毒害的敏感區(qū)間濃 度為0 300mg/kg; 土壤中芘的50%小麥根伸長(zhǎng)抑制率濃度為500mg/kg PAHs的生態(tài)毒性與其溶解度和結(jié)構(gòu)有關(guān),且隨著溶解度的增大和苯環(huán)數(shù)目 的減少而增加，因此萘的毒害是多環(huán)芳烴中對(duì)植物根生長(zhǎng)毒害最深的(參考周立祥，中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2005,25(5)， 563-566)。因此可以用根的生 長(zhǎng)情況反映植物對(duì)萘的降解能力。將蘸花法轉(zhuǎn)化到擬南芥后，收取擬南芥種子，在50mg/L的MS培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)，從培養(yǎng)基中篩選獲得正常生根的萌發(fā)種子，移植到土壤中，與這 些轉(zhuǎn)基因植株依次定名為Sl， S2, S3……S12共12株，將這些轉(zhuǎn)化擬南 芥株系自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，移栽到含有 100mg/mL萘的MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察植物的發(fā)芽和根長(zhǎng)情況(見(jiàn)圖 2)。轉(zhuǎn)基因植物在含有萘的平板上，種子的發(fā)芽率比非轉(zhuǎn)基因植物提高2.6倍。轉(zhuǎn)基因植物在含有萘的平板上，根長(zhǎng)比非轉(zhuǎn)基因植物提高55%倍。序列表<110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>萘雙加氧酶表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用 <130〉 0811326 <160> 5<170> Patentln version 3.3<210> 1 <211〉987 <212> DNA<213>植物偏愛(ài)密碼子編碼來(lái)自惡臭假單胞菌G7菌株萘加氧酶a亞基基因 <400〉atggaattgt tgattcaacc a^c犯tcgc ttggaagttt tgcgtgaa犯tggtgttgct ggtacttgcc gttgtcgtgt tactgatggt Ltg(;caaact tggtagatga gcatLatgtt, tgtgctatcg a犯tcccaga aactgatgaa ggUiCtgttg ttgctgttga gtctccaact gct,tiagccat tcgtigttctc tccaggtcaa gctcgtccgt attcaatggc tggttLgcca aaggttccag gtggtcgtgt aactgagtat atcaagttgt ctggtccatt gggtacggct ttgtgtgUg gtggtgggac tggtttggct tiagttgggta tgacaaaccc catxttgttg Lacgatgctg tigcgtttgca taaeittggct gttattgcta tgggtccaat taatgagtct gaaaaagac已tcatttcttt ggctgggtgg gttgaagcg'L Lgtgcaccgt taccaagcat gatgccttct: atcctggtgg satctg-a<210> 2 <211> 324 <212> DNA<213>植物偏愛(ài)密碼子編碼來(lái)自惡臭假單胞菌G7菌株萘加氧酶b亞基基因 <400>ttgatttcttttagtccaggtgccaacttg60atttcttactctggtatgtctggtcgttgc120ctggtaattgattctggtgctggatctggt180Uggcttgtcaatctgttttgactcataat240atcgttactcatccagctcg300gtcgtttgcgtgt已cgtttg360tatgctaxattgcagttctctccagagcat420gaLgatcaagccacatacgc480gttttcgagcatgttcgtg已a(bǔ)ggtacttct540tatttgcgtccggtccaatg600ccagtgttgtcgattgttcgtggtgctttg660tatttcggtgttcgctctcagcaagatttg720gctgatcatctgttcatact780caacgtgctggtttggttactgatgtta/tc840cgtgcttacttgtgtggtgc900cttggaatattatttatgcc960 987atgactgaaaaatggattga agc兆ttgct ttgtctgata tcccagaagg tgatgttttg60ggtgtaactgtagagggcaa ggagttggct ttgtacgaag tggaaggtga aatctacgct120accgacaacttgtgcacgca tggtgctgct cgcatgtctg atggttattt ggsgggtxga180gcccattgca tcaaggtcgt tttgacgttt gtacaggcag agccttgtgt240gctccagtgacagaga已cat caaaacatat gcagtcaaga ttgagaactt gcgtgtaatg300attgatttgtctggtgagtt ttaa324<210> 3 <211> 1350 <212>DNA<213>植物偏愛(ài)密碼子編碼來(lái)自惡臭假單胞菌G7菌株萘加氧酶c亞基基因 <400>cttggtatctgaatctggttgcacttgatt60catgg.tgatgccagcacgaattgagaactatcttcgctcgtaactggttg120tlxttgactcatgattctttgattccatctccaggtgattatgttaccgc180atcgacgaggtaatcgtttctegtcagtetgatggttcgattcgtgcattettgaaegt t240LglxgtcaccgttggttaacgctgtiagctggtaacgcMagggtttcgtt300tgctcttaccatggttggggtttcggttcca^ggtgagttgcagtctgttccattcgag360卿gagttgtacggtgagtctttgaacaag犯gtgtttgggtttg卿gaagttgctegt420g'ttgagtctttccatggtttcatc tatggttgettcgateaggaggctcc480g-at Uicttgggtgatgctgcttggtacttggagecaatettcaagcattctggtggtttg540gtxcaccaggcaaggttgttactgg犯ggc600aacttcgtgggtgatgcataccacgtgggttggacgcacgcgtcttctttgcgttctgga660gagtctatcttcgcttctttggctggtaacgctgttetgecaccagaaggtgcaggtttg720cc犯gtatggt tctggcatgggtgtgttgtgggatggttactctggtgtt780cattctgctigatttggttecgeatteggtggttcta已gcagg卿ggttg840tCggtg8tgttcgtgctegtatetategttctcacctcaactgcaccgtt900actctatgttgacctgctctggtgttttcaccc犯tcgat960ccgaggtctggacctacgcaategttgagaaggatatgeeagagg已tttg1020aagcgtcgtttggcagattctgtacagcgtacgttcggtccagctggtttctgggagtct1080gaetgettetagaagtaccaatetegtgat1140tctgatttgttgtcaaacttgggtttcggtacggtgatgctgtttaccca1200ggtgttgttggtaagtctgcaatcggtgagacttcttatcgtggtttxtategtgettae1260caggctcacg tttcttcttc caactgggct gagttcgagg atgcttcttc tacttggcat 1320 actgagttga cgaagactac tgatcgttaa 1350<210> 4 <211> 585 <212> DNA<213>植物偏愛(ài)密碼子編碼來(lái)自惡臭假單胞菌G7菌株萘加氧酶d亞基基因 <400>atgatgatcaacatccaagaagacaagctggtctctgctcacgatgctca agagttcttg60cgtttcttcaattgcc3cgacgctgctttgC33C3ag犯gctaccacgct gctgaaccgg120gaagcgcatttgttggacattcaggcttaccgtgcttggttggagcactg cgttggttct180gaggttcaataxcaggtcat'ttcacgcgaactgcgtgctgcttctgagcg tcgttacaag240ttacaacgagaactttcagcaattgaaagt tcgtatcgag300catcaacttgat c cacaaaactggtctaactctccaaagttgcgtttcac tcgtttcatc360accaatgtccaggctgcacgtgatgtagatgacg犯gagttgttgcacat ccgctctaac420gtcatcttgcaccgtgcacgtcgtggcaatcaggt卿tgtattctacgc tgctcgtgaa480g-HCtiHgtggtLaggtggtgUcgt咖gttggtccagcgatt cgtggatUic540tattgcagacgcacaacttg atggtcttct.tgtga585<210> 5 <21〗〉57 <212〉 DNA< 213 >植物偏愛(ài)密碼子編碼口蹄疫病毒2 A蛋白基因 <400〉ctgttgaatt tcgatcttct taagcttgct ggtgatgttg aatccaaccc aggtcca 5權(quán)利要求
1、一種萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于在pYPX245植物表達(dá)載體的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間插入NahA融合基因編碼序列。
2、 如權(quán)利要求1所述的萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于所述的 NahA融合基因?yàn)榭谔阋卟《?A蛋白與萘雙加氧酶四個(gè)亞基的核苷酸序列串聯(lián)而成c^
3、 如權(quán)利要求2所述的萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于所述的 NahA融合基因串聯(lián)方式具體為NahAa-2A蛋白一NahAb — 2A蛋白一NahAc —2A 蛋白一NahAd。
4、 如權(quán)利要求3所述的萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于所述的 NahA融合基因使用植物偏愛(ài)的密碼序列。
5、 如權(quán)利要求4所述的萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于所述的萘 雙加氧酶四個(gè)亞基的核苷酸序列分別為萘雙加氧酶a亞基(SEQ. ID No. 1)TTGCGTGTAATGATTGATTTGTCTGGTGAGTTTTAA 3' 萘雙加氧酶c亞基(SEQ. ID No. 3)<formula>formula see original document page 3</formula>
6、 如權(quán)利要求2或3或4所述的萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于 所述的口蹄疫病毒2A蛋白基因序列具體為CTGTTGAATTTCGATCTTCTTAAGCTTG CTGGTGATGTTGAATCCAACCCAGGTCCA (SEQ. ID No. 5)。
7、 如權(quán)利要求1所述的萘雙加氧酶植物表達(dá)載體，其特征在于包括如下 方法構(gòu)建1)萘雙加氧酶各亞基基因的合成；2 )萘雙加氧酶各亞基基因與口蹄疫病毒2A蛋白的串聯(lián)； 3)與pYPX245植物表達(dá)載體連接。
8、 一種萘雙加氧酶植物表達(dá)載體的用途，其特征在于將如權(quán)利要求1所 述萘雙加氧酶植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物中，以促使其降解土壤中的萘污染。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種萘雙加氧酶表達(dá)載體pYPXnahA及其構(gòu)建方法，通過(guò)攜帶有該載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物能持續(xù)表達(dá)萘雙加氧酶，并能促使植物參與萘的降解，從而可以為植物修復(fù)萘污染提供有益的幫助。為這方面的植物品種提供了新選擇，克服了對(duì)特定植物單獨(dú)或與微生物相組合實(shí)現(xiàn)土壤植物修復(fù)的依賴(lài)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101333541SQ200810041089
公開(kāi)日2008年12月31日 申請(qǐng)日期2008年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 孫廣東, 彭日荷, 熊愛(ài)生, 田永生, 永 薛, 偉 趙, 金曉芬, 峰 高 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院