專利名稱：同時(shí)檢測(cè)番茄TY-1基因和Mi基因的雙重PCR方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同時(shí)檢測(cè)番茄TY-1基因和Mi基因的檢測(cè)方法。
技術(shù)背景 '
番茄黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl virus)病和根結(jié)線蟲(chóng) (Root-knotoematode)病是兩種世界性病害。TY-1基因和Mi基因分別是 番茄抗黃化曲葉病毒和根結(jié)線蟲(chóng)病的重要基因。
隨著近年來(lái)番茄黃化曲葉病毒病和根結(jié)線蟲(chóng)病在國(guó)內(nèi)的逐年加重，選 育含有TY-1基因和Mi基因的番茄品種變得愈加迫切。
目前，文獻(xiàn)Zamir, D., Ekstein畫(huà)Michelson, L, Zakay, Y., Navot， N.,Zeidan， M.， Sarfatti, M., Eshed, Y.， Harel， E., Pleben,T.， Van-Oss, H,， Jedar, N., Rabino witch, H. D. and Czosnek, H," 1994， Mapping and introgression of a Tomato yellow leaf curl virus tolerance gene，Ty-1 .Theoretical and Applied Genetics,88:141 146報(bào)道發(fā)現(xiàn)了番茄抗黃化曲葉病毒病Ty-l基因的CAPS 標(biāo)記，文獻(xiàn)Williamson, V. M.， Ho， J. Y., Wu, F. F., Miller, N., and Kaloshian， I., 1994 A PCR國(guó)based marker tightly linked to the nematode resistance gene, Mi, in tomato. Theoretical and Applied Genetics, 87， 757-763報(bào)道，獲得了番茄抗 根結(jié)線蟲(chóng)病Mi基因的CAPS標(biāo)記。
目前，常規(guī)的檢測(cè)TY-l基因和Mi基因的方法，如Zamir,D文獻(xiàn)公開(kāi)的方 法，但是，該方法存在一個(gè)明顯的缺陷是，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)TY-l基因和Mi基 因，因此，鑒定時(shí)間長(zhǎng)、鑒定成本高，不能滿足有關(guān)方面的需要
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種同時(shí)檢測(cè)番茄TY-l基因和Mi基因的雙重PCR 方法，旨在節(jié)省鑒定時(shí)間、降低實(shí)驗(yàn)成本，加快番茄Ty-l基因和Mi基因的 聚合育種進(jìn)程。
本發(fā)明的方法，包括如下步驟
(1)將PCR體系按照如下的程序進(jìn)行PCR反應(yīng) 95。C變性5min，然后94。C變性lmin、 6KC退火lmin、 72。C延伸2min， 35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，獲得PCR產(chǎn)物，4'C保存； 所說(shuō)的PCR體系為水溶液，組分和含量為 模板DNA 20ng/L Ty-l引物 0.2umol/L Mi引物 0.2umol/L 10xbuffer 2ul/L Mg2+ 3.5mmol/L dNTPs 250umol/L Taq酶 0.2uL /L
所說(shuō)的模板DNA指的是番茄DNA，制備方法如下
1、 取番茄嫩葉放入研缽中，加入液氮，研磨成粉末狀，取40mg裝入2mL 的圓頭離心管中。
2、 加入700ulCTAB提取液，劇烈搖晃，使CTAB提取液與樣品充分混 合均勻。
(100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 20 mmol/L EDTA， 1.4 mol/L NaCl， 3%CTAB， 2%PVP， 2%p-巰基乙醇)
3、 65。C水浴lh。
4、 置于4"C冰箱或室溫冷卻至15"C以下。 ''
5、 加入700^il24:l氯仿/異戊醇，上下緩慢顛倒混勻，抽提15min至溶 液呈乳濁狀，保證樣品和氯仿充分混合。
6、 12000rpm離心10min。
7、 取上清液于1.5ml離心管中，加入等體積的預(yù)冷一2(TC的異丙醇，輕 輕上下顛倒混勻。
8、 一2(TC冰箱靜置3h以上。
9、 12000rpm離心10min，棄上清液。用70°/。乙醇洗滌沉淀2次。
10、 吹干DNA，讓乙醇揮發(fā)干凈。
11 、加200 TE 65 °C水浴溶解DNA 。
(TE : 10mmol/L Tris-Hcl和l腿ol/LEDTA， PH二8) Ty-l引物序列
CAPS IF: 5 ，- TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT畫(huà)3' CAPS 1 R: 5 ，-CGGATGACTTCAATAGCAATGA -3'
Mi引物序列
CAPS2 F: 5，曙TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3' CAPS2 R: 5 ，-GCCAGAGATGATTCGTGAGA -3'; 10xbuffer為一種PCR反應(yīng)緩沖液，為10 50mmol/LTris-Hcl(PH8.3 8.8)，可采用上海生工公司的產(chǎn)品； M^+來(lái)源于氯化鎂的化合物;'dNTPs為一種PCR反應(yīng)必須物，其化學(xué)名稱為三磷酸脫氧核苷酸，可
采用上海生工公司的產(chǎn)品；
T'aq酶化學(xué)名稱為耐熱DNA聚合酶?？刹捎蒙虾Ｉ?公司的產(chǎn)品；
(2) 酶切產(chǎn)物的制備 將酶切體系在65。C保溫1.5h，獲得及酶切產(chǎn)物；
所說(shuō)的酶切體系為水溶液，組分和含量為
酶切體系為.-
PCR產(chǎn)物0.35uL/L， T^I酶0.05uL/L， BufferO.l uL/L，
(3) 配置2. 5%的瓊脂糖凝膠，加入lpLEB (0.5jig/ml)倒入膠槽中， 插入梳子，待膠凝固后檢測(cè)。分別取10uLPCR產(chǎn)物和10uL酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢 測(cè)，終結(jié)果用EB染色，采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照；
所說(shuō)的EB的化學(xué)名稱為溴化乙錠，可采用市售產(chǎn)品，如上海生工公司 的產(chǎn)品，染色方法，為現(xiàn)有技術(shù)，如Williamson, V.M.文獻(xiàn)報(bào)道的方法； Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)為一種通用的系統(tǒng)，可釆用Bio-RAD公司的產(chǎn)
叩？
(4) 結(jié)果分析抗感基因型酶切前都成398bp和750bp的特異片斷。 經(jīng)TaqI酶切后，純合含Ty-l和Mi基因的材料成570bp、 303bp、 180bp、 95bp的特異片段，雜合含Ty-l和Mi基因的材料成750bp、 570bp、 398bp、 303bp、180bp、95bp的特異片段，雜合含Ty-l純合含Mi基因的材料成570bp、 398bp、 303bp、 180bp、 95bp的特異片段，雜合含Mi純合含Ty-l基因的材料成750bp、 570bp、 303bp、 180bp、 95bp的特異片段，純合不含Ty-l和
Mi基因的材料不被酶切。
'
圖1為實(shí)施例1中，酶切前的照片。
圖2為實(shí)施例1中，酶切后的照片。
圖3為實(shí)施例2中，酶切前的照片。
圖4為實(shí)施例2中，酶切后的照片。
本雙重PCR技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)1、在一個(gè)PCR中同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)基因， 所用的時(shí)間只是分別檢測(cè)兩個(gè)基因所用時(shí)間的一半，大大節(jié)省了鑒定時(shí)間； 2、大大節(jié)約了PCR所用的藥品，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
取番茄2300品種的嫩葉，采用Williamson, V.M文獻(xiàn)公開(kāi)的方法，分 別提取DNA，為模板DNA。
番茄2300為上海農(nóng)科院園藝所番茄組選育的高代自交系。 (1)將PCR體系按照如下的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)
95。C變性5min，然后94。C變性lmin、 61。C退火lmin、 72。C延伸2min， 35個(gè)循環(huán)，最后72t:延伸10min，獲得PCR產(chǎn)物，4tM呆存；
所說(shuō)的PCR體系為水溶液，組分和含量為-
模板DNA 20ng/L
Ty-l引物 0.2umol/L
Mi引物 0.2umol/L10xbuffer 2ul/L
Mg2+ 3.5mmol/L
dNTPs 250umol/L '
Taq酶 0.2uL /L Ty-1引物序列
CAPS IF: 5 ， - TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3'
CAPS1 R: 5，-CGGATGACTTCAATAGCAATGA -3'
Mi引物序列
CAPS2 F: 5 ， -TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3' CAPS2 R: 5 ，-GCCAGAGATGATTCGTGAGA -3';
(2) 酶切產(chǎn)物的制備
將酶切體系在65。C保溫1.5h，獲得及酶切產(chǎn)物；
所說(shuō)的酶切體系為水溶液，組分和含量為
PCR產(chǎn)物0.35uL/L， ra《I酶0.05uL/L， BufferO.l uL/L，
(3) 配置2. 5%的瓊脂糖凝膠，加入lpLEB (0.5嗎/ml)倒入膠槽中， 插入梳子，待膠凝固后檢測(cè)。分別取10uLPCR產(chǎn)物和10uL酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢 測(cè)，終結(jié)果用EB染色，采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照；
所說(shuō)的EB的化學(xué)名稱為溴化乙錠，可采用市售產(chǎn)品，如上海生工公司 的產(chǎn)品，染色方法，為現(xiàn)有技術(shù)，如Williamson, V.M.文獻(xiàn)報(bào)道的方法； Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)為一種通用的系統(tǒng)，可采用Bio-RAD公司的產(chǎn)P
BO 5
分析結(jié)果如圖1和圖2，結(jié)果表明，番茄2300不含TY-l基因和Mi基 因。('由于番茄2300酶切前后都成750、 398bp的條帶，所以番茄2300不 含TY-1基因和Mi基因)。
實(shí)施例2
取番茄2583或2697品種的嫩葉，采用Williamson, V. M文獻(xiàn)公開(kāi)的方 法，分別提取DNA，為模板DNA。
番茄2583或2697為上海農(nóng)科院園藝所番茄組選育的品種。 (1)將PCR體系按照如下的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)
95。C變性5min，然后94。C變性lmin、 61。C退火lmin、 72。C延伸2min， 35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，獲得PCR產(chǎn)物，4卩保存；
所說(shuō)的PCR體系為水溶液，組分和含量為
模板DNA 20ng/L
Ty-l引物 0.2umol/L
Mi引物 0.2umol/L
10xbuffer
Mg2+
dNTPs
2ul/L
3.5mmol/L 250umol/L
Taq酶 0.2uL/L Ty-l引物序列
CAPS IF: 5 ，- TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3 ， CAPS1 R: 5'-CGGATGACTTCAATAGCAATGA -3，Mi引物序列
CAPS2 F: 5 ，-TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3' CAPS2 R: 5'-GCCAGAGATGATTCGTGAGA -3，；
(2) 酶切產(chǎn)物的制備
將酶切體系在65X:保溫1.5h，獲得及酶切產(chǎn)物；
所說(shuō)的酶切體系為水溶液，組分和含量為
PCR產(chǎn)物0.35uL/L， 7^I酶0.05uL/L, BufferO.l uL/L，
(3) 配置2. 5%的瓊脂糖凝膠，加入肌EB (0.5ug/ml)倒入膠槽中， 插入梳子，待膠凝固后檢測(cè)。分別取IO uL PCR產(chǎn)物和IO uL酶切產(chǎn)物進(jìn)行 檢測(cè)，終結(jié)果用EB染色，采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照；
所說(shuō)的EB的化學(xué)名稱為溴化乙錠，可采用市售產(chǎn)品，如上海生工公司 的產(chǎn)品，染色方法，為現(xiàn)有技術(shù)，如Williamson, V.M.文獻(xiàn)報(bào)道的方法； Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)為一種通用的系統(tǒng)，可采用Bio-RAD公司的產(chǎn)
P
P口 S
拍照分析結(jié)果如圖3和圖4，結(jié)果表明，番莉2583不含TY-1基因和 Mi基因，2697雜合含TY-1基因和雜合Mi基因。
權(quán)利要求
1.同時(shí)檢測(cè)番茄TY-1基因和Mi基因的雙重PCR方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將PCR體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；Ty-1引物序列CAPS1 F5’-TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3’CAPS1 R5’-CGGATGACTTCAATAGCAATGA-3’Mi引物序列CAPS2 F5’-TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3’CAPS2 R5’-GCCAGAGATGATTCGTGAGA-3’；(2)酶切產(chǎn)物的制備將酶切體系在65℃保溫1.5h，獲得及酶切產(chǎn)物；(3)分別取PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，終結(jié)果用EB染色，采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將PCR體系按照如下的 程序進(jìn)行PCR反應(yīng)95。C變性5min，然后94。C變性lmin、 61。C退火lmin、 72。C延伸2min， 35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的PCR體系為水溶 液，組分和含量為模板DNA 20ng/L Ty-1引物 0.2umol/L Mi引物 0.2umol/L10xbuffer 2ul/L Mg2+ 3.5mmol/L dNTPs 250umol/L Taq酶 0.2uL /L所說(shuō)的模板DNA指的是番茄DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的酶切體系為水溶 液，組分和含量為PCR產(chǎn)物0.35uL/L， T^I酶0.05uL/L， BufferO.l uL/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，分別取 10 uL PCR產(chǎn)物和10 uL酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)番茄TY-1基因和Mi基因的雙重PCR方法，包括如下步驟(1)將包括Ty-1引物和Mi引物序列的PCR體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物(2)將酶切體系在65℃保溫1.5h，獲得酶切產(chǎn)物；(3)將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，終結(jié)果用EB染色，采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析結(jié)果。本發(fā)明雙重PCR技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)1.在一個(gè)PCR中同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)基因，所用的時(shí)間只是分別檢測(cè)兩個(gè)基因所用時(shí)間的一半，大大節(jié)省了鑒定時(shí)間；2.大大節(jié)約了PCR所用的藥品，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101638683SQ20081004108
公開(kāi)日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者萬(wàn)延慧, 力 于, 朱為民, 朱龍英 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院