專利名稱：：枯草芽孢桿菌酯酶及其用于生產(chǎn)l-薄荷醇的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株耐受高底物濃度的枯草芽孢桿菌以及利用該菌株所產(chǎn)的酯酶催化^-薄荷酯的對(duì)映選擇性水解生產(chǎn)z-薄荷醇的應(yīng)用和方法。
背景技術(shù)：
：薄荷醇有八種異構(gòu)體，它們的呈香性質(zhì)各不相同，其中/-薄荷醇不但具有特殊香氣和香味而且還有清涼效果，被大量用于香煙、化妝品、牙膏、口香糖、甜食、藥物和涂擦劑中，是目前世界上銷量最大的香料化合物之一。/-薄荷醇主要是從天然植物一薄荷中提取的，所以又叫天然薄荷醇。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們物質(zhì)水平的不斷提高，對(duì)薄荷產(chǎn)品的需求也日益上升。然而，由于受天氣、季節(jié)、區(qū)域和市場(chǎng)價(jià)格等的影響，天然薄荷醇已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代工業(yè)迅猛增長(zhǎng)的需要。為了彌補(bǔ)市場(chǎng)上天然薄荷醇的不足，人們通過合成的方法來制備薄荷醇。然而由于合成的薄荷醇多數(shù)是外消旋混合物，相對(duì)于天然薄荷醇，雖也有清涼效果，但是由于其中"-薄荷醇的存在，其氣味和味道均明顯劣于天然存在的/-薄荷醇。所以，為了使人工合成的薄荷醇得到實(shí)際應(yīng)用，必須將w-薄荷醇的對(duì)映體進(jìn)行拆分，得到具有和天然薄荷醇相同香氣和香味的單一構(gòu)型/-薄荷醇。盡管合成法制備的/-薄荷醇需要從外消旋體中進(jìn)行分離，分離步驟多且得率不高，但所得產(chǎn)物的品質(zhì)并不亞于從薄荷葉中提取的天然薄荷醇，而且合成的z-薄荷醇具有產(chǎn)量高和價(jià)格低的優(yōu)勢(shì)。^-薄荷醇對(duì)映體的拆分通常使用的技術(shù)主要包括化學(xué)與物理相結(jié)合的方法和生物催化手性拆分的方法。所謂的化學(xué)與物理相結(jié)合的拆分方法，一種是通過光學(xué)活性試劑的方法拆分，即利用光學(xué)活性試劑與^-薄荷醇反應(yīng)生成的兩種非對(duì)映體化合物的物理性質(zhì)的不同，通過分步結(jié)晶將其分開，然后分別進(jìn)行水解，從而實(shí)現(xiàn)^-薄荷醇分離的一種技術(shù)。例如，光學(xué)活性試劑一薄荷氧基乙酸與W-薄荷醇進(jìn)行酯化反應(yīng)，然后通過分步結(jié)晶的方法將這兩種非對(duì)映化合物分離，繼而水解得到單一構(gòu)型的薄荷醇。另外一種是通過非光學(xué)活性試劑的方法拆分，即在外消旋混合物的飽和溶液中，加入單一對(duì)映體作為晶種，相應(yīng)構(gòu)型的對(duì)映體就會(huì)被優(yōu)先誘導(dǎo)結(jié)晶而析出，而另一種對(duì)映體仍保留在溶液中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)體分離的一種技術(shù)。例如，Harrmann&Reimer公司(J.Fleischer,K.Bauer,R.Hopp,DE2109456,1971;USPatent3491381，1976)報(bào)道了將薄荷醇的外消旋體通過化學(xué)的方法轉(zhuǎn)酯化生成相對(duì)應(yīng)的安息香酸薄荷酯的外消旋體，然后引入具有光學(xué)活性的安息香酸薄荷酯的左旋對(duì)映體晶種，誘導(dǎo)安息香酸薄荷酯中的左旋對(duì)映體優(yōu)先結(jié)晶析出，從而實(shí)現(xiàn)這兩種薄荷酯對(duì)映體的分離。分離后/-安息香酸薄荷酯再進(jìn)行化學(xué)水解，即可得到/-薄荷醇單一對(duì)映體。上述這種分離方法存在很多缺點(diǎn)。首先，適合手性拆分的化合物類型不多，價(jià)格昂貴，且通常無法回收利用。其次，這種方法工藝繁瑣，需要反復(fù)多次的分步結(jié)晶，損失比較大，拆分產(chǎn)率較低，且在生產(chǎn)過程中為了使外消旋混合物飽和，經(jīng)常采用間歇式結(jié)晶，這無疑延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，增加生產(chǎn)成本。上述這些缺點(diǎn)極大地限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用步伐。所謂生物催化的手性拆分方法，即是指利用微生物或酶對(duì)外消旋混合物中某一個(gè)異構(gòu)體具有高度的立體化學(xué)選擇性，而對(duì)另一個(gè)異構(gòu)體不起催化作用(或作用很小)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)映體分離的一種技術(shù)。由于該法反應(yīng)條件溫和，低能高效，綠色環(huán)保，最近幾十年來引起了人們極大的關(guān)注。從上世紀(jì)80年代起，^-薄荷醇的生物催化手性拆分就引起了國(guó)內(nèi)外的很大關(guān)注。到目前為止，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，主要是利用微生物或酶不對(duì)稱催化酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，或者不對(duì)稱催化酯的對(duì)映選擇性水解反應(yīng)。1981年，Omata等(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol,,1981,11(4)，199隱204)利用固定化的及/zoifoton^avar.texensis細(xì)胞在水飽和的正庚垸中立體選擇性水解d-琥珀酸薄荷酯，得到>99%^的/-薄荷醇，但是得到的產(chǎn)物濃度低于15mM，而且細(xì)胞活性也不高，反應(yīng)48h后轉(zhuǎn)化率只有30%。2004年，Gatfield等(GatfieldI丄.，HilmerJ.M.,etal.,USPatent6706500，2004)利用重組的Omt/WaragosaLipaseLIPl催化^-安息香酸薄荷酯的對(duì)映選擇性水解制備/-薄荷醇，雖然該酶催化所得的產(chǎn)物/-薄荷醇純度很高(66|3>99%)，但是該反應(yīng)的底物濃度非常低(0.5mM)，沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。南非的CSIR組織(ChaplinJ.A.，GardinerN.S.,etal.，WO0236975,2002)利用來自尸;yewcfowomw/Mora:era的脂肪酶AmanoAK對(duì)映選擇性地轉(zhuǎn)酯化拆分^-薄荷醇制備/-薄荷醇，但是該過程的轉(zhuǎn)化率也較低，只有20%左右。綜上所述，利用生物催化法拆分d-薄荷醇，雖然已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，具有廣闊的發(fā)展前景，但是目前仍普遍存在著底物或產(chǎn)物濃度低，轉(zhuǎn)化率低等這樣或那樣的缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)的存在勢(shì)必造成反應(yīng)體系中產(chǎn)物濃度不高，給產(chǎn)品的分離帶來很大的困難，增加分離的成本，因而在很大程度上影響其工業(yè)化的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于(l):提供一株能夠?qū)τ尺x擇性地催化水解高濃度底物的產(chǎn)酯酶的枯草芽孢桿菌；(2):提供一種利用該酯酶催化￡//-薄荷醇的芳香酸酯或者脂肪酸酯的對(duì)映選擇性水解生產(chǎn)高濃度產(chǎn)物/-薄荷醇的應(yīng)用和方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明提到的枯草芽孢桿菌(Saa7/^w^/toECU0554)，是本發(fā)明的發(fā)明人從來自山東的土壤樣品中，經(jīng)初篩、復(fù)篩及分離純化而得到的一株能夠產(chǎn)酯酶和耐受高濃度底物的新菌株。根據(jù)它的16SrDNA序列，鑒定為5ac/Z/iwwto'fo。該菌株已于2008年6月18日保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC),保藏號(hào)為CGMCC2548。本發(fā)明的菌種具有如下微生物學(xué)特征1.形態(tài)特征桿狀，很少成鏈，染色均勻，鞭毛側(cè)生，為內(nèi)生孢子，大小為0.70.9pmX1.52.0|irn。2.平板固體培養(yǎng)基上的菌落特征(30'C，24h):圓形，14mm;培養(yǎng)初期為透明、粘稠狀，而后菌落表面出現(xiàn)褶皺。3.生長(zhǎng)環(huán)境可在溫度1050'C下生長(zhǎng)，pH3~8,鹽濃度0~10%的條件下生存。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌5fld〃w仰6"foCGMCC2548可用于催化JZ-薄荷醇的芳香酸酯或者脂肪酸酯的對(duì)映選擇性水解生產(chǎn)/-薄荷醇，包括如下步驟(1)對(duì)枯草芽孢桿菌5""7/""^拙5。01^(^2548進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成及濃度(g/L):甘油10~80，蛋白胨1~20，酵母膏120，NaCl0.1~3，MgS040.13和KH2P040.1~3，pH5~9,基于培養(yǎng)基體積，接種量為1~10%(v/v)，培養(yǎng)溫度為1540'C，培養(yǎng)時(shí)間為1248h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集細(xì)胞或經(jīng)過進(jìn)一步處理制備粗酶。(2)將上述步驟(l)制備所得的生物催化劑(細(xì)胞或粗酶)加入到含有助溶劑的緩沖液中，催化底物酯的對(duì)映選擇性水解，然后從反應(yīng)混合物中收集水解生成的產(chǎn)物一光學(xué)純的Z-薄荷醇，具體步驟如下對(duì)映選擇性地催化水解的反應(yīng)條件細(xì)胞濃度為10200g/L，酯酶濃度為1100g/L，底物濃度為10500mM，反應(yīng)溫度為2045'C，pH5~9.5，反應(yīng)時(shí)間為0.524h。產(chǎn)物的對(duì)映體過量值(")和底物的轉(zhuǎn)化率采用氣相色譜分析，分析條件如下GammaDexTMl20手性柱(Supelco，30m><0.25mmx0.25pm);以N2作為載氣；進(jìn)樣口溫度280。C，檢測(cè)器溫度350'C;采用程序升溫11(TC保持15min后，以10'C/min的速度升溫至18(TC，保持2min。所述的催化劑可以是枯草芽孢桿菌(Sac!7/ww6"toCGMCC2548)培養(yǎng)后離心收集的濕菌體或冷凍干燥的菌體，也可以是菌體經(jīng)破碎后，通過無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑或聚合物進(jìn)行沉淀所得的粗酶。所述的緩沖液可以是pH為59.5的磷酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液或甘氨酸^NaOH緩沖液。所述的助溶劑可選擇各種與水互溶的有機(jī)溶劑，優(yōu)選的助溶劑為乙醇，加入量為反應(yīng)體積的520。/ov/v。所述的底物包括但不限于氯乙酸薄荷酯，乙酸薄荷酯，丁酸薄荷酯，苯甲酸薄荷酯，琥珀酸薄荷酯。本發(fā)明優(yōu)選的底物為化乙酸薄荷酯。采用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)/-薄荷醇，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，在底物的轉(zhuǎn)化率接近50%時(shí)，所得產(chǎn)物/-薄荷醇的光學(xué)純度在96%^以上，而且催化劑的穩(wěn)定性好，能耐受較高濃度的底物和產(chǎn)物，反應(yīng)條件溫和。使用本發(fā)明的拆分工藝，能簡(jiǎn)單、方便地獲得高光學(xué)純度和高濃度的/-薄荷醇，且該法節(jié)能、環(huán)保，高濃度的產(chǎn)物有利于產(chǎn)物的回收，是一種高效的/-薄荷醇的生產(chǎn)方法，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的闡述。具體實(shí)施例方式通過下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明,但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌A^7/ww6"http://5CGMCC2548的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油30，蛋白胨5，酵母膏5，NaCl1,MgS040.2和KH2P040.5，pH7。12rC高溫滅菌20min。滅菌后冷卻、接種，接種量6。/。(v/v)，在30。C，180rpm轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)18h后，菌體濕重可達(dá)20g/L，產(chǎn)酶可達(dá)97U/L，比活為4.9U/g濕細(xì)胞。實(shí)施例28株候選菌株對(duì)^-乙酸薄荷酯的對(duì)映選擇性水解性能取1.5g各菌株的濕細(xì)胞懸浮于10mL的磷酸鹽緩沖溶液(100mM，pH7.0)中，分別加入20mg的W-乙酸薄荷酯，反應(yīng)混合物在30'C，180rpm的恒溫?fù)u床上反應(yīng)，在表l中所示的時(shí)間取樣，產(chǎn)物和底物經(jīng)乙酸乙酯萃取，無水Na2S04干燥后，再通過手性氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過量值(eep)。各菌株的催化性能如表l所示。表l候選菌株的催化性能比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>EC簡(jiǎn)30249925ECU0544249425ECU0555249925表1說明從土壤中篩選的這8株菌均具有很高的對(duì)映選擇性催化活性，其中ECU0554和ECU0532反應(yīng)速度最快，轉(zhuǎn)化率最高。實(shí)施例3候選菌株對(duì)不同濃度的W-乙酸薄荷酯的耐受能力取1.5g各菌株的濕細(xì)胞懸浮于10mL的磷酸鹽緩沖溶液(100mM,pH7.0)中，分別加入不同濃度的W-乙酸薄荷酯，反應(yīng)混合物在3(TC，180rpm的恒溫?fù)u床上反應(yīng)24h。反應(yīng)后取樣，產(chǎn)物和底物經(jīng)乙酸乙酯萃取，無水Na2S04干燥后，再通過手性氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率。各菌株對(duì)不同濃度的底物耐受情況如表2所示。表2候選菌株對(duì)不同濃度的底物耐受情況的對(duì)比/-薄荷醇濃度(mM)微生物菌株-100mM底物300mM底物500mM底物ECU05544484125ECU0532406960ECU0515351510ECU0561323130ECU0526321220ECU0530262135ECU0544204245ECU0555203940表2說明隨著底物濃度的增加，多數(shù)菌株的活性受到較高底物濃度的抑制，水解產(chǎn)物增加很少甚至減少，而只有菌株ECU0554在較高的底物濃度下(500mM)，仍能維持較高的轉(zhuǎn)化率，得到高濃度的產(chǎn)物，說明該菌株具有很高的底物和產(chǎn)物耐受性，所以該菌株被篩選作為最優(yōu)菌株用于以后的工作。實(shí)施例4~7枯草芽孢桿菌酯酶對(duì)幾種^//-薄荷醇的芳香酸酯或脂肪酸酯的酶促水解以從5"c77/mw^加ECU055中的提取的粗酶為催化劑，^-氯乙酸薄荷酯，d-乙酸薄荷酯，d-丁酸薄荷酯，^-苯甲酸薄荷酯為底物，底物濃度為100mM，凍干粗酶粉20mg，0.2mL乙醇，緩沖體系是磷酸鹽緩沖液(200mM,pH7.0)，反應(yīng)總體積為2mL。反應(yīng)混合物在3(TC，180rpm的恒溫?fù)u床上反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間如表3所示，反應(yīng)后取樣，產(chǎn)物和底物經(jīng)乙酸乙酯萃取，無水Na2S04干燥后，再通過手性氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過量值("p)。結(jié)果如表3所示。表3枯草芽孢桿菌酯酶對(duì)幾種W-薄荷醇的芳香酸酯或脂肪酸酯化合物的酶促水解實(shí)施例號(hào)底物反應(yīng)時(shí)間(h)eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)實(shí)施例4d-氯乙酸薄荷酯35.197實(shí)施例5^-乙酸薄荷酯397.749實(shí)施例6W-丁酸薄荷酯692.041實(shí)施例7d-苯甲酸薄荷酯1278.132從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該酯酶雖能快速水解W-氯乙酸薄荷酯，但是該水解過程是非專一性水解，催化其它三種底物的水解都能得到比較高的轉(zhuǎn)化率和^p，但是催化W-乙酸薄荷酯時(shí)，它的活性最高，時(shí)間大大縮短，3h轉(zhuǎn)化率幾乎接近50n/。，不僅反應(yīng)速度快，而其專一性也很高，產(chǎn)物的光學(xué)純度高達(dá)98%"。實(shí)施例8溫度對(duì)d-乙酸薄荷酯的酶促水解的影響將40111§的^-乙酸薄荷酯(0.202mmol)、0.2mL乙醇、20mg凍干的粗酶粉加入到1.8mL磷酸鹽緩沖液(200mM,pH7.0)中，混合均勻后分別置于20，30,40&50°C，180rpm的恒溫?fù)u床上反應(yīng)振蕩反應(yīng)3h。反應(yīng)后取樣，產(chǎn)物和底物經(jīng)乙酸乙酯萃取，無水Na2S04干燥后，再通過手性氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過量值(eep)。如表4所示，溫度在2040'C時(shí)，該酯酶具有很高的轉(zhuǎn)化率，說明該溫度范圍內(nèi)，該酯酶是比較穩(wěn)定的，活性沒有受到很大的損失。溫度超過5(TC時(shí)，該酯酶的轉(zhuǎn)化能力大大下降，這可能是高溫導(dǎo)致該酯酶的催化活性基團(tuán)的構(gòu)型發(fā)生變化，從而導(dǎo)致酶的活性下降。表4溫度對(duì)枯草芽孢桿菌酯酶催化d-乙酸薄荷酯的酶促水解的影響溫度('C)eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)2098.6323097.4474097.6435099.024實(shí)施例9枯草芽孢桿菌酯酶對(duì)不同濃度薄荷酯的酶促水解將濃度為IOO、250和500mM的^-乙酸薄荷酯和0.2mL乙醇加入到磷酸鹽緩沖液(200mM,pH7.0)中，再分別加入相應(yīng)量的酶(20、50&100mg)，反應(yīng)混合物置于30'C，180rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間如表5所示。反應(yīng)后取樣，產(chǎn)物和底物經(jīng)乙酸乙酯萃取，無水Na2S04干燥后，再通過手性氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過量值(eep)。結(jié)果如表5所示。表5枯草芽孢桿菌酯酶對(duì)不同濃度的d-乙酸薄荷酯的酶促水解底物濃度(mM)反應(yīng)時(shí)間(h)產(chǎn)物濃度(mM)"p(%)1003.54998.02506.010297.15006.018297.1表5顯示，該酯酶催化不同濃度的^-乙酸薄荷酯時(shí)，產(chǎn)物濃度隨著底物濃度的增加而增加，最高可達(dá)182mM，且仍保留較高的產(chǎn)物光學(xué)純度。說明較高濃度的底物和產(chǎn)物對(duì)該枯草芽孢桿菌酯酶的活性沒有造成太大的影響，該酯酶可以耐受高濃度的底物和產(chǎn)物。這是至今報(bào)道的生物催化法生產(chǎn)/-薄荷醇的方法中，生成產(chǎn)物濃度最高的例子。所以本發(fā)明的方法具有很廣闊的實(shí)際工業(yè)應(yīng)用前景。實(shí)施例IO/-薄荷醇的克級(jí)制備將3.0g^-乙酸薄荷酯與15mL乙醇和135mL磷酸鹽緩沖液(200mM，pH7.0)混合均勻后，加入0.5g粗酶。反應(yīng)在恒溫30'C的500-mL圓底燒瓶中進(jìn)行，200rpm下機(jī)械攪拌。通過手性氣相色譜監(jiān)測(cè)底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過量值。9h后停止反應(yīng)，過濾除酶后，用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物和底物，然后通過硅膠柱層析將二者分離，流動(dòng)相為石油醚-乙酸乙酯(30:l，v/v)，收集的組分經(jīng)減壓蒸餾脫除溶劑以及真空干燥后，得到目標(biāo)產(chǎn)物和未反應(yīng)的底物。最后所得的產(chǎn)物為具有特殊香氣的無色固體，分離后總得率為42%(0.98g)，光學(xué)純度為98%"。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)酯酶的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisECU0554，保藏號(hào)為CGMCC2548。2.—種以權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)/-薄荷醇。3.—種以權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)/-薄荷醇，其特征在于將所述的枯草芽孢桿菌^^7/附CGMCC2548進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的細(xì)胞或處理后得到的粗酶作為催化劑，在含有助溶劑的磷酸鹽緩沖液、擰檬酸鹽緩沖液或甘氨酸^NaOH緩沖液中，催化W-薄荷酯的對(duì)映選擇性水解，然后從反應(yīng)混合物中收集水解生成的/-薄荷醇。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成和濃度如下甘油10~80g/L，蛋白胨l~20g/L，酵母膏l(xiāng)~20g/L，NaCl0.1~3g/L,MgS040.1~3g/L和KH2P040.1~3g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為pH5~9，溫度15~40°C，相對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為l~10%v/v,培養(yǎng)時(shí)間為1248h。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，催化劑為下列形式中的任意一種(1)將枯草芽孢桿菌5ac///^w6"fcCGMCC2548進(jìn)行培養(yǎng)后，分離所得的細(xì)胞；(2)采用勻漿方法將上述枯草芽孢桿菌wto'feCGMCC2548的細(xì)胞破碎后，制備得到的粗酶。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的助溶劑為各種與水互溶的有機(jī)溶劑。8.根據(jù)權(quán)利要求3和7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的助溶劑的添加量為反應(yīng)總體積的5~30%。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的底物d-薄荷酯為d-薄荷醇與脂肪族或芳香族羧酸形成的酯。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的底物濃度為10~500mM，反應(yīng)溫度為20~50°C，反應(yīng)時(shí)間為l24h。全文摘要本發(fā)明公開了一株產(chǎn)對(duì)映選擇性酯酶的枯草芽孢桿菌以及利用該酯酶生產(chǎn)高濃度l-薄荷醇的應(yīng)用和方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。所述的酯酶為利用土壤分離菌—保藏號(hào)為CGMCC2548的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisECU0554培養(yǎng)所得的整細(xì)胞或細(xì)胞破碎所得的提取物。采用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌酯酶催化dl-薄荷酯的對(duì)映選擇性水解生產(chǎn)l-薄荷醇的工藝具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，不僅反應(yīng)條件溫和，而且選擇性高，當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化率接近50％時(shí)，產(chǎn)物的光學(xué)純度仍達(dá)96％ee以上。特別是生物催化劑的穩(wěn)定性好，并能耐受較高的底物或產(chǎn)物濃度，產(chǎn)物l-薄荷醇的濃度可達(dá)182mM，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12P7/02GK101338287SQ200810040988公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日發(fā)明者江潘,許建和,郁慧蕾,鄭高偉申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)