專利名稱：：一種含cox-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤基因靶點(diǎn)的重組質(zhì)粒，具體涉及一種含COX-2基因啟動(dòng)子和熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用途徑。
背景技術(shù)：
：環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素(PGs)合成過程中一個(gè)重要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而維持機(jī)體的各種病理生理過程。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的環(huán)氧化酶至少有COX-l和COX-2兩個(gè)同工酶，COX-l在組織中的表達(dá)相當(dāng)穩(wěn)定，對(duì)維持胃和腎功能的平衡發(fā)揮重要的作用，而COX-2的表達(dá)在不同的組織、不同的狀況下變動(dòng)很大，它的主要產(chǎn)物是環(huán)前列腺素和PGE2。現(xiàn)有技術(shù)公開了COX-2基因全長(zhǎng)8.3kb，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，定位于第1號(hào)染色體lq252~253，由5'端0.8kb的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游區(qū)，6kb的蛋白質(zhì)編碼區(qū)以及1.5kb3'端非編碼區(qū)組成，其mRNA約4.5kb，基因編碼603或604個(gè)氨基酸，含有17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽，與COX-l有59%-61%的同源性。在其5'旁側(cè)區(qū)，含有幾個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25bp位處共同的TATA框序列。一個(gè)C/EBP基序，兩個(gè)AP-2位點(diǎn)，三個(gè)SPi位點(diǎn)，兩個(gè)NF-KB位點(diǎn)，一個(gè)CRE基序和一個(gè)EST-1位點(diǎn)。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)，COX-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10個(gè)外顯子編碼。在3'旁側(cè)區(qū)，整個(gè)3'UTR包含于外顯子10，其間無內(nèi)含子存在，有三個(gè)富含腺嘌呤核苷酸的序列MTAAA，相互之間相隔280bp。研究發(fā)現(xiàn)COX-2存在于某些細(xì)胞中，主要定位于核膜。因此，COX-2產(chǎn)生的PGs產(chǎn)物可進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明cox-2不僅是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而且其表達(dá)和與腫瘤的發(fā)生、增殖、分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等方面有重要作用。COX-2主要通過以下途徑導(dǎo)致胃癌的發(fā)生(1)COX作為一種刺激因子在靜息狀態(tài)下不表達(dá)，只有在某些惡性細(xì)胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，COX-2的轉(zhuǎn)錄后失控，使COX-2過度表達(dá)，COX-2的過氧化酶活化可催化一系列異體氧化反應(yīng)，參與氧化誘癌途徑，從而形成致癌物。(2)COX-2通過催化形成PGs促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，COX-2通過催化反應(yīng)可產(chǎn)生PGG、PGH、PGE，其中PGE為其主要代謝產(chǎn)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞粘附，抑制具有免疫調(diào)節(jié)功能的淋巴因子的產(chǎn)生，抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖，降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的局部免疫反應(yīng)。(3)COX-2過度表達(dá)可增加PGE2的合成，PGE2誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并刺激bcl—2蛋白表達(dá)，降低介導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P(TGF-P)2型受體水平，降低介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的E—牽丐粘蛋白(E—cadherin)活性，從而抵抗各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，引起腫瘤的發(fā)生。(4)COX-2促進(jìn)PG合成的增加如PGE,、PGE2和15d-PGJ等作用于EP2、EP4及PPARr等，通過EP/cAMP等途徑激活各種胞內(nèi)激酶如PKA、Ras蛋白活性，誘導(dǎo)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，參與腫瘤新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。(5)COX-2可使細(xì)胞周期存在明顯G!期推遲，而且CzelinDt蛋白激酶、Rl^激酶和細(xì)胞周期依賴激酶(CDK4)活性明顯下降，這樣通過阻礙細(xì)胞周期，阻止延長(zhǎng)細(xì)胞生存期，增強(qiáng)對(duì)胞外基質(zhì)的粘附，而異常延長(zhǎng)細(xì)胞生存期使一系列基因突變，促進(jìn)腫瘤形成。另外，Cox-2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞相關(guān)血管的生成，增加癌細(xì)肥的侵襲性，激活基質(zhì)金居蛋白酶2降解細(xì)胞外基質(zhì)，產(chǎn)生促血小板凝集的血栓垸等，從而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。COX-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程中起著重要的作用，參與了腫瘤形成的多個(gè)環(huán)節(jié)。因此，對(duì)腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中COX-2活性檢測(cè)可以作為監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要手段，同時(shí)COX-2在細(xì)胞中的基因表達(dá)水平也可以作為抗腫瘤藥物篩選的一個(gè)重要指標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，該報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因(luc+)。本發(fā)明通過提取人COX-2基因啟動(dòng)子，以含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic的質(zhì)粒為載體，插入COX-2基因啟動(dòng)子，構(gòu)建一種含COX-2基因啟動(dòng)子和螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒。所述的重組質(zhì)粒，其特征是含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因/wc+、多酶切位點(diǎn)和p-內(nèi)酰胺酶基因；所述的p-內(nèi)酰胺酶基因是氨芐青霉素抗性基因；所述的重組質(zhì)粒中的COX-2基因啟動(dòng)子序列中包含NF-kB、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)和TATA框，其長(zhǎng)度為252-700bp，優(yōu)選序列長(zhǎng)度為562bp;所述的含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒選自pGL3-BasicVector4818bp、pGL3-enahncerVector5064bp、pGL3-promoterVector5010bp或pGL3陽(yáng)con加lVector5256bp，優(yōu)選pGL3-BasicVector4818bp;本發(fā)明所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其中的載體質(zhì)粒和COX-2基因啟動(dòng)子都含有BglII和HindIII雙酶切位點(diǎn)。本發(fā)明通過下述方法和步驟構(gòu)建所述的含有COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，第一步制備含有COX-2基因啟動(dòng)子基因組DNA(1)提取含有COX-2基因啟動(dòng)子基因組DNA:(2)擴(kuò)增、純化COX-2基因啟動(dòng)子目的片段；第二步大量制備pGL3-Basic載體質(zhì)粒；第三步構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)COX-2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒(1)含有COX-2基因啟動(dòng)子目的片段和pGL3-Basic載體質(zhì)粒的雙酶切；(2)酶切后COX-2基因啟動(dòng)子目的片段和pGL3-Basic載體質(zhì)粒的酶連；(3)篩選連接后的重組質(zhì)粒并大量擴(kuò)增制備。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含上述COX-2基因啟動(dòng)子和螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的用途，所述的重組質(zhì)粒主要應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選和評(píng)價(jià)，尤其是以COX-2基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物的篩選或評(píng)價(jià)，所述的抗腫瘤藥物包括抗腫瘤的化學(xué)、生物類藥物或中藥復(fù)方、中藥單體或單味中藥提取物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案將上述的含螢火蟲熒光素酶的pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒聯(lián)合含海腎熒光素酶的pRL-SV40內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，使其能在細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染后，通過使用熒光素酶快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩種熒光素酶活性，反映抗腫瘤藥物對(duì)COX-2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，評(píng)價(jià)藥物的抗癌效能。本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)含有COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因重組質(zhì)粒以COX-2基因?yàn)榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物的篩選用途第一步腫瘤細(xì)胞的鋪板(1)將腫瘤細(xì)胞按一定比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中；(2)使細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至達(dá)到90%-95%匯板；第二步質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1)將培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清無抗菌素的培養(yǎng)基；(2)將重組質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體按一定比例加入到細(xì)胞中；(3)轉(zhuǎn)染3-5h后將培養(yǎng)液全部吸棄，加含血清和抗菌素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);第三步加入抗腫瘤藥物處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(1)選擇不同的時(shí)間點(diǎn)加入藥物處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；(2)或加入不同的濃度的藥物處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；第四步檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的雙熒光素酶活性(1)轉(zhuǎn)染后2-96h后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸棄，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；(2)按雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的雙熒光酶活性。本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)雙熒光素酶報(bào)告基因法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等。(2)雙熒光素酶報(bào)告基因法同時(shí)具有靶向性的特點(diǎn)，能夠特異性檢測(cè)啟動(dòng)子中特定序列的啟動(dòng)活性。(3)雙熒光素酶報(bào)告基因克服了轉(zhuǎn)染效率對(duì)結(jié)果的影響。圖1.COX-2基因啟動(dòng)子擴(kuò)增引物序列，其中，上游引物27bp，含有1個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)堿基；下游引物28bp，含有1個(gè)BglII酶切位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)堿基。圖2.COX-2基因啟動(dòng)子片段的克隆，Marker為DL2000,其中，1、2、3、4為COX-2基因啟動(dòng)子片段(562bp)。圖3.pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒的HindIII和BglII雙酶切檢測(cè)，其中，Marker為DL2000，1為pGL3-BasioCOX-2-promoter重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果(562bp);2為pGL3-Basic-COX-2-promoter重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果(4818+562bp);3為pGL3-Basic-COX-2-promoter重組質(zhì)粒(5380bp)。圖4.pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)結(jié)果。圖5.pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖6.不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞后的螢火蟲熒光素酶活性的比較。圖7不同藥物對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞后COX-2活性的影響。具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用PCR的方法，將從人外周血白細(xì)胞或人其它細(xì)胞中擴(kuò)增出COX-2基因啟動(dòng)子序列和經(jīng)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增出的pGL3-Basic載體質(zhì)粒，經(jīng)純化、測(cè)序鑒定后，運(yùn)用酶切、連接等基因重組手段，得到重組質(zhì)粒PGL3-Basic-COX-2-promoter。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，制備出的含有COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使其能在細(xì)胞中表達(dá)，通過檢測(cè)雙熒光素酶活性來反映抗腫瘤藥物對(duì)COX-2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，從而應(yīng)用于耙向篩選抗腫瘤藥物。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所涉及的腫瘤細(xì)胞，如人胃癌細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，MKN45細(xì)胞，含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic的質(zhì)粒載體為現(xiàn)有技術(shù)，所涉及的基因組DNA純化試劑盒，生化試劑均可市購(gòu)。實(shí)施例1人基因組DNA的提取含有COX-2基因啟動(dòng)子基因組DNA提取自正常人外周血白細(xì)胞或人其它細(xì)胞，采用基因組DNA純化試劑盒或組織、細(xì)胞基因組DNA純化試劑盒的操作方法通過下述步驟進(jìn)行提取(1)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1次，加入胰蛋白酶溶液(0.1-0.25%)消化處理。800rpm室溫離心10min，收集106—107個(gè)細(xì)胞，去除上清，(2)用200nl溶液PL重懸細(xì)胞，加入20nl蛋白酶K和20(Hil溶液BL,混勻，(3)70。C水浴10min，混勻2-3次，(4)加入20(Hil無水乙醇，混勻，(5)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟(4)所得溶液全部加入吸附柱中，12000rpm室溫離心lmin，倒掉濾液，(6)向吸附柱中加入500pl溶液PP，12000rpm室溫離心lmin，倒掉濾液，(7)向吸附柱中加入500nl漂洗液GW，12000rpm室溫離心lmin，倒掉濾液，(8)將吸附柱于12000rpm室溫離心2min，除去殘留的漂洗液GW,將吸附柱室溫放置數(shù)min，晾干吸附材料中的漂洗液，(9)取出吸附柱，放入1.5ml離心管，加入60-100^U預(yù)熱(7(rC)的洗脫液EB(10mMTris-HCLPH8.5)靜置2min,12000卬m室溫離心lmin，收集DNA溶液，(10)用P/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA的大小及濃度，(11)用10mMTris-HCLPH7.5稀釋DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm處吸光值A(chǔ)260，用Tris-HCLPH7.5作為空白對(duì)照，按如下公式計(jì)算雙鏈DNA(dsDNA)或單鏈DNA(ssDNA)的濃度dsDNA濃度=A26()x50x稀釋倍數(shù)ng/mlssDNA濃度=A26(jx40x稀釋倍數(shù)嗎/ml(12)用10mMTris-HCLPH7.5稀釋DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A26Q和A280，計(jì)算A260/A28o比值；結(jié)果顯示純化得DNA片段1.8<A26o/A28o〈2.0,則表明DNA無蛋白污染，純度較高，對(duì)下游分子實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生影響。實(shí)施例2PCR擴(kuò)增COX-2基因啟動(dòng)子根據(jù)已知人的COX-2基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)并合成兩端引物上游(5'端)弓i物包含COX-2基因啟動(dòng)子互補(bǔ)堿基，一個(gè)HindIII識(shí)別位點(diǎn)，三個(gè)保護(hù)堿基，5，-CCCAAGCTTCCTGGACGTGCTCCTGAC-3，。下游(3'端)弓l物包含COX-2基因啟動(dòng)子互補(bǔ)堿基，一個(gè)BglII識(shí)別位點(diǎn)，二個(gè)保護(hù)堿基，5，-GAAGATCTTCCTCGACCCTCTAAAGACG-3，。以基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>反應(yīng)條件如下:過程時(shí)間循環(huán)數(shù)預(yù)變性95°C3min1cycle變性94°C30s、退火65°C45s>■35cycles延伸72°C1min終末延伸72°C5min1cycle保溫4°C擴(kuò)增產(chǎn)物取5^1用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；剩余PCR產(chǎn)物用DNA片段中量純化試劑盒回收純化備用。實(shí)施例3COX-2基因啟動(dòng)子和pGL3-Basic質(zhì)粒的雙酶切及酶連將COX-2promoter回收產(chǎn)物和pGL3-Basic載體質(zhì)粒分別用BglII和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切體系如下pGL3-basic質(zhì)粒/COX-2promoter10nl-30|xlBglII(10，)2.5^1HindIII(10，)2，10xKBuffer5^1ddH2030^1-1OplTotal50pl37'C酶切過夜后，分別取5pl用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察雙酶切的質(zhì)粒分子量及濃度。并分別用DNA片段中量純化試劑盒回收酶切后的pGL3-basic質(zhì)粒和COX-2promoter目的片斷。將酶切回收后的pGL3-Basic載體質(zhì)粒和COX-2基因啟動(dòng)子目的片段在20(^1的離心管中進(jìn)行連接反應(yīng)，酶連體系如下COX-2promoter回收產(chǎn)物(48ng/pl)5plpGL3-basic回收產(chǎn)物(168ng4U)1pl10xBuffer2^1T4DNAligase(5u/pl，F(xiàn)ermentas)1plddH20，Total20^116'C酶連5-8h，或酶連過夜。實(shí)施例4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及擴(kuò)增將DNA連接酶酶連產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化子的平板上挑取單菌落，經(jīng)不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)后用試劑盒抽提法提取質(zhì)粒備用，具體步驟如下(1)取-8(TC保存的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞懸液20(^1，室溫下解凍后，置于冰上，(2)加入20nl連接產(chǎn)物溶液，搖勻，冰上放置30min，(3)42。C水浴中熱擊90秒或37。C水浴5min，熱擊后置冰上冷卻3-5min，(4)向管中加入lmlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻，37°C、250rpm振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)，(5)將上述菌液搖勻后取30(^1涂布于含Amp的篩選平板上，放置半h，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37'C培養(yǎng)16-24h，(6)待培養(yǎng)皿長(zhǎng)出的單菌落后，挑取4個(gè)單菌落加入4個(gè)裝有10mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)的三角瓶中，37°C、250rpm振蕩搖菌過夜(約12-16h)，使含重組質(zhì)粒的大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增，(7)將上述4瓶菌液各取2pl做PCR克隆鑒定，方法及條件同實(shí)施例2，結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見4個(gè)克隆均均出現(xiàn)560bp的目的片段，顯示結(jié)果均為陽(yáng)性。實(shí)施例5pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒的提取pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒的提取按照質(zhì)粒小量提取試劑盒的操作提取，所得質(zhì)粒不含內(nèi)毒素，可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下(1)收菌取5ml上述過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，13000rpm室溫離心lmin，用移液器小心的吸棄上清，(2)重懸菌液將250^1ResuspensionBuffer(己加RNaseA)加入菌液沉淀，Vortex充分懸浮細(xì)菌沉淀，(3)堿裂解將250plLysisBuffer加入重懸菌液，上下翻轉(zhuǎn)6-10次，使菌體裂解不超過5min,至溶液變得清亮，(4)中和加入400^1NentralizationBuffer,上下翻轉(zhuǎn)混合6-10次，室溫靜置5min，13000rpm室溫離心10min，(5)柱預(yù)處理在柱中加入500^1ColumnPreparationBuffer13000rpm室溫離心lmin，棄濾液，(6)柱結(jié)合將上述步驟(4)的上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)處理過的SpinColumn中，13000rpm室溫離心lmin，棄濾液，(7)去蛋白將500(J的ProteinremoveBuffer加入柱中，13000rpm室溫離心30-60s，棄濾液，(8)漂洗將600^1的WashBuffer加入柱中，13000rpm室溫離心30-60s，棄濾液，(9)重復(fù)漂洗重新加60(HU的WashBuffer加入柱中，13000rpm室溫離心30-60s，棄濾液，空柱13000rpm室溫離心2min，室溫下放置3-5min，除去殘留的漂洗液，(10)洗脫將柱按置于新的1.5ml的離心管上，在柱膜的中央加入60-10(HU60'C預(yù)熱的ddH20或ElutionBuffer,室溫靜置lmin，13000rpm室溫離心lmin洗脫DNA,(11)用P/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的質(zhì)粒DNA的大小及濃度。實(shí)施例6重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞及雙熒光素酶的檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)人胃上皮癌MKN45細(xì)胞將培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素、lOOpg/ml鏈霉素RPMI-1640完全培養(yǎng)基G7°C5%C02、飽和濕度)中人胃癌MKN45細(xì)胞株，按l-5xl05個(gè)細(xì)胞/孔的量在96孔板中接種指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在37°C5%<:02培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，至細(xì)胞密度達(dá)到90%-95%。將上述常規(guī)培養(yǎng)的人胃上皮癌MKN45細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、陰性對(duì)照組、重組質(zhì)粒組和陽(yáng)性對(duì)照組，分別按如下劑量加入不同的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染(1)空白組等劑量培養(yǎng)液+pRL-SV40(0.2嗎)，n=3，(2)陰性對(duì)照組pGL3-Basic(0.2嗎)+pRL-SV40(0.2嗎)，n=3，(3)重組質(zhì)粒組pGL3-Basic-COX-2promoter(0.2嗎)+pRL-SV40(0.2嗎),n=3，(4)陽(yáng)性對(duì)照組pGL3-Basic-MDRl(0.2嗎)+pRL-SV40C0.2嗎)，n=3，在1.5ml的離心管中配制待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體LiprofectamineTM2000復(fù)合物如下將待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40各0.2pg/孔稀釋至25^1/孔不含血清和抗菌素的RPMI-1640中，用lOOnl的槍混合均勻，然后將轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體懸液(0.5pl/孔)加入25^1/孔不含血清和抗菌素的RPMI-1640中，在室溫溫育5min，，將兩者混合，混勻，靜置20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體結(jié)合；分別吸去96孔板中的完全培養(yǎng)基，用不含血清和抗菌素的RPMI-1640潤(rùn)洗一次，每孔加入lOOpl無血清無抗菌素的RPMI-1640培養(yǎng)基后，在每孔加入62.5^1對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒/脂質(zhì)體混合物，37°C5XC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5h后，吸棄孔中培養(yǎng)液，加入10(^1含血清含抗菌素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)44h后收集樣品，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)；按照KenReal試劑盒說明書指導(dǎo)配制工作液[工作液1:A液(2ml)+B液(40pi)十C液(10pl)混合均勻，用于測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性；工作液2:D液(2ml)+E液(10pi)混合均勻，用于測(cè)定海腎熒光素酶活性]。將各組共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48h后收集；細(xì)胞的裂解取出培養(yǎng)基，用PBS洗一次，加入裂解液20pl/孔(96孔)，室溫?fù)u動(dòng)15min，取15-20細(xì)胞裂解液于1.5ml的離心管中，加入工作液1，設(shè)定延遲2see,發(fā)光儀測(cè)讀10sec;加入工作液2，設(shè)定延遲2sec，發(fā)光儀測(cè)讀10sec，進(jìn)行不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞后的螢火蟲熒光素酶活性比較。表1是不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞后的螢火蟲熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表l.分組第l孔第2孔第3孔AVERAGESDBlank1402671891988Baisc81580281981222C0X-21709021734151758951734042730MDR132171594004920046924287實(shí)施例7COX-2啟動(dòng)子報(bào)告基因重組質(zhì)粒篩選抗腫瘤中藥復(fù)方和單體的研究將上述的重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胃癌MKN45細(xì)胞4h后，將共轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞分別加入下述中藥復(fù)方、單體等藥物，并與療效確切的抗化療藥物5-Fu對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集各組的細(xì)胞，按照實(shí)施例7的方法，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，通過檢測(cè)COX-2啟動(dòng)子重組質(zhì)粒熒光素酶活性的判斷被檢測(cè)藥物的抗腫瘤作用。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，丹參注射液組，黃芪注射液組COX-2啟動(dòng)子重組質(zhì)粒熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05),中藥有效成分華蟾素組、去甲斑蝥素組、丹參酮IIA組、化療藥5-Fu熒光素酶活性明顯降低(尸<0.05)，提示所述藥物有較好的抗腫瘤活性。在等劑量情況下，抗癌效應(yīng)強(qiáng)度依次為化療藥5-Fu、丹參酮IIA、去甲斑蝥素、華蟾素組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的COX-2啟動(dòng)子報(bào)告基因重組質(zhì)粒能用于篩選抗腫瘤藥物，尤其是用于篩選抗腫瘤中藥復(fù)方和單體。表2是不同藥物對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞后COX-2活性的影響(X1(T2)。表2.對(duì)照組5.863±0.2545-Fu組2.0562±0.4594去甲斑蝥素組2.684±0.0763華蟾素組3.4897±0.8510丹參酮IIA組2.2590±0.3474丹參注射液組5.7380±0.3110黃芪注射液6扁0±0.2120權(quán)利要求1、一種含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因luc+、多酶切位點(diǎn)和β-內(nèi)酰胺酶基因，通過以含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic的質(zhì)粒為載體，插入COX-2基因啟動(dòng)子，構(gòu)建得含COX-2基因啟動(dòng)子和螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒2、按權(quán)利要求l所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述的重組質(zhì)粒中的COX-2基因啟動(dòng)子序列中包含NF-kB、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)和TATA框，其長(zhǎng)度為252-700bp。3、按權(quán)利要求2所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述的COX-2基因啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為562bp。4、按權(quán)利要求1所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述的含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒選自pGL3-BasicVector4818bp、pGL3-enahncerVector5064bp、pGL3-promoterVector5010bp或pGL3-contro1Vector5256bp。5、按權(quán)利要求4所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述的含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因/wc+的質(zhì)粒為pGL3-BasicVector4818bp。6、按權(quán)利要求1所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述的P-內(nèi)酰胺酶基因是氨芐青霉素抗性基因。7、按權(quán)利要求1所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征是其中的載體質(zhì)粒和COX-2基因啟動(dòng)子都含有BglII和HindIII雙酶切位點(diǎn)。8、權(quán)利要求1所述的含COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征是包括以下步驟1)制備含有COX-2啟動(dòng)子基因組DNA(1)提取含有COX-2啟動(dòng)子基因組DNA;(2)擴(kuò)增、純化COX-2基因啟動(dòng)子目的片段；2)大量制備pGL3-Basic載體質(zhì)粒3)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)COX-2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒(1)含有COX-2基因啟動(dòng)子目的片段和pGL3-Basic載體質(zhì)粒的雙酶切；(2)酶切后COX-2基因啟動(dòng)子目的片段和pGL3-Basic載體質(zhì)粒的酶連；(3)篩選連接后的重組質(zhì)粒并大量擴(kuò)增制備。9、權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒在篩選或評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物中的用途。10、按權(quán)利要求9的用途，其中所述的篩選或評(píng)價(jià)是以COX-2基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物的篩選或評(píng)價(jià)，所述的抗腫瘤藥物包括抗腫瘤的化學(xué)、生物類藥物或中藥復(fù)方、中藥單體或單味中藥提取物。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種含有COX-2基因啟動(dòng)子和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過提取人COX-2基因啟動(dòng)子，以含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic的質(zhì)粒為載體，插入COX-2基因啟動(dòng)子，構(gòu)建一種含COX-2基因啟動(dòng)子和螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic-COX-2promoter重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，使其穩(wěn)定表達(dá)。通過檢測(cè)熒光素酶的活性反映COX-2基因啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性，用于靶向篩選抗腫瘤藥物。本發(fā)明具有靶向性強(qiáng)、高效快速、反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適用于以COX-2基因?yàn)榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物大批量篩選。文檔編號(hào)C12N15/63GK101624599SQ20081004052公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者劉寧寧,周利紅,玨孫,琦李,殷佩浩,王金玉,秦建民,范忠澤,許建華,還一平申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院