專利名稱：：一種利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素h產量的方法
技術領域：
：本發明屬抗生素生產領域，特別是涉及一種利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法。技術背景至今共有8種冬青生菌素(代號分別為AH)被人們所發現，它們的來源、分子式和分子結構以及性質見下表1。1971年，日本學者Hayakawa首次在山毛櫸樹枯萎葉片中分離出來的柱枝雙孢菌屬冬青生菌(Q///"^oc/ai//ww///c/co/a)MFC-870中發現冬青生菌素H。冬青生菌素H(ilicicolinH)的分子式為C27H31N04，為淺黃色片狀晶體，dragendorff試劑測試陰性，具有抗真菌活性，它的作用機制在最近才被闡明在酵母中可作用于線粒體，抑制電子在呼吸鏈泛醌位點中的傳遞。研究冬青生菌素H毒性時，發現在50^g，mL—1濃度下，它對大鼠肝細胞線粒體沒有顯著活性(不出現腫脹、變形)，對大鼠肝細胞的IQo約為lrr^mL—1。據此推測它可能是一種對人類低毒，對部分真菌高毒的化合物，具有潛在的開發應用前景。_表l冬青生菌素家族(Ilicicolins)_<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>目前以鐮刀菌生產冬青生菌素H存在產量低的問題，通過利用優化后的鐮刀菌發酵培養基，產量僅比未優化前提高23倍；而利用優化后的鐮刀菌發酵培養條件(例如搖床轉速、培養溫度、初始pH等)時，產量也提高不多。因此針對產量低的問題，應考慮次級代謝產物生物合成中產物的合成前體是調控代謝向次級代謝產物積累的方向進行、并且增加其產量的一個重要因素。由于鐮刀菌代謝冬青生菌素H的代謝途徑尚未有文獻報道，不能全面了解冬青生菌素H在鐮刀菌中的生物合成途徑，故而不清楚對冬青生菌素起積極作用的因素，例如有關酶ParkSRIInternational生物組織化學實驗室的Tanabe和Urano通過利用放射性元素13C標記醋酸鹽、14C和15N標記苯丙氨酸研究冬青生菌素H的生物合成途徑，發現冬青生菌素H是經過一系列碳架重排合成，證實其前體是醋酸鹽和苯丙氨酸。隨后，1998年英國的學者Moore等在利用球孢白僵菌研究布氏白僵菌素生物合成途徑時發現酪氨酸同樣是冬青生菌素H的前體。因此，向發酵培養基中添加苯丙氨酸、酪氨酸以及乙酸鹽，都可能會促進冬青生菌素H在另一真菌——鐮刀菌內的生物合成。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，該方法操作簡單、轉化率高、產量穩定、環保，可為工業化大規模生產冬青生菌素H提供新的思路和途徑。本發明的一種利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，包括如下步驟(1)鐮刀菌F^an'wmo;c^pon/mATCC11711菌株(購自美國菌種保藏中心)的種子培養將12片1cm直徑的鐮刀菌瓊脂培養物置于成分包括210g七.1葡萄糖，0.22.5g-L—'蛋白胨，0.21.5g七"酵母浸膏，0.53g七"NaCl的種子培養基中，在2035。C，100—250r/min條件下培養2030h;(2)鐮刀菌Fwrahwm0;9;577wwwATCC11711菌株的發酵培養以4—10%接種量將鐮刀菌種子液轉接至成分包括515g丄"葡萄糖/蔗糖，0.53g丄"蛋白胨，0.21.5g-I/1酵母浸膏，13g'L"NaCl的發酵培養基，并于048h內將2.520mg丄"酪氨酸添加入培養基，100130。C時滅菌1040min后，在2035。C，100—250r/min條件下培養35d;(3)發酵培養結束后通過過濾或離心得到菌絲體，以24倍于菌絲體體積的丙酮浸泡菌絲體浸泡抽提過夜，或經超聲波處理1035min后再高速離心收集抽提液；為了獲得菌絲體干重，可將菌絲體置于烘箱中烘至恒重后稱重；(4)利用高效液相色譜和薄層層析分析得到抽提液中冬青生菌素H的濃度。步驟(1)所述的種子培養基成分包括5g七"葡萄糖，lg七"蛋白胨，0.5g丄"酵母浸膏，lg.L"NaCl。步驟(1)所述的發酵培養基成分包括10g七"葡萄糖/蔗糖，2g丄"蛋白胨，lg七"酵母浸膏，2g七"NaCl。步驟(2)優選酪氨酸前體的添加量為12.5mg七—1。步驟(2)優選酪氨酸前體的添加時間為發酵Oh，即配制發酵培養基時直接加入。步驟(3)利用G3坩堝進行過濾操作，在9000—18000r/min條件下離心1030min。步驟(4)所述的薄層層析是在HSGF254型的預制硅膠板上點樣，展開劑為乙酸乙脂和石油醚的混合物，v/v=2:3，用254nm波長的紫外燈觀察。步驟(4)所述的高效液相色譜分析在規格為150mmX4.60mm，5pm的配備色譜柱PhenomenexLunaC18或C8柱的液相色譜儀上進行，流動相為乙腈-水緩沖液，v/v=30:70，檢測波長為254nm,流速為1.0mL/min。所述的培養鐮刀菌生產冬青生菌素H的過程是間歇式或分批補料式。有益效果(1)本方法操作簡單、穩定、可控性強，利用鐮刀菌發酵生產抗生素一冬青生菌素H，安全環保；(2)利用前體物質酪氨酸可以有效提高鐮刀菌合成冬青生菌素H的產量，為工業化生產提供新的思路和途徑。圖1為酪氨酸濃度對冬青生菌素H產量的影響；.圖2為酪氨酸適宜添加時間的選擇；圖3為添加酪氨酸后鐮刀菌合成冬青生菌素H與對照組的歷程比較。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例11.鐮刀菌Fw^n'w附o;c少5poramATCC11711菌株的種子培養鐮刀菌ATCC11711菌株種子培養基5g七"葡萄糖，lg七"蛋白胨，0.5g七"酵母浸膏，1g'U1NaCl,pH自然；以鐮刀菌ATCC11711菌株為生產菌種，在28。C，120r/min條件下培養24h。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養鐮刀菌ATCC11711菌株發酵培養基10g'L—'葡萄糖，2g'L"蛋白胨，1g丄"酵母浸膏，2g'L/1NaCl，一定濃度的酪氨酸，pH自然；以5%接種量，在28。C，120r/min條件下培養4d。發酵結束后利用G3坩堝過濾或離心(9000—18000r/min)得到菌絲體，并置于烘箱中烘至恒重測得菌絲體干重；利用2倍于菌絲體體積的丙酮浸泡抽提菌絲體過夜或以超聲波處理15min后再高速離心收集抽提液；利用高效液相色譜分析得到的抽提液中冬青生菌素H的濃度。實驗中以未加酪氨酸的發酵培養為對照。3.酪氨酸的添加方式在配制鐮刀菌的發酵培養基時直接添加酪氨酸至10.0mg七—1,然后在11(TC條件下滅菌30min。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。薄層層析條件在HSGF254型的預制硅膠板上點樣，選用乙酸乙脂和石油醚的混合物(2:3，v/v)為展開劑，展開后取出、晾干，利用254nm波長的紫外燈進行觀察。高效液相色譜條件在配備色譜柱PhenomenexLunaC18(150mmX4.60mm，5pm)或C8柱的液相色譜儀上進行分析，分析條件流動相為乙腈-水緩沖液(30:70，v/v)，檢測波長為254nm，流速為1.0mL/min。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為15.8mg七人與菌絲體干重比為4.8mgf1，冬青生菌素H的平均產率為5.3mg七+cT1，與對照組相比依次提高了50.6%、87.6%和50.6%。實施例21.鐮刀菌ATCC11711菌株的種子培養同實施例l。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養同實施例l。3.酪氨酸的添加方式在配制鐮刀菌的發酵培養基時直接添加酪氨酸至12.5mg七—1，然后在110'C條件下滅菌30min。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。同實施例1。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為20.0mg丄"，與菌絲體干重比為5.9mg'g"，冬青生菌素H的平均產率為6.7mg丄+cT1，與對照組相比依次提高了卯.6°/。、128.1%和90.6%。實施例31.鐮刀菌ATCC11711菌株的種子培養同實施例l。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養除了配制培養基時不加酪氨酸以及發酵培養基在12rC條件下滅菌20min之外，其它同實施例1。3.酪氨酸的添加方式當培養時間為12h時，往鐮刀菌發酵培養基中添加無菌酪氨酸至12.5mg七"。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。同實施例1。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為17.98mg七—1，與菌絲體干重比為5.5mgf1，冬青生菌素H的平均產率為5.99mg'L+d—1，分別比對照組提高了71.2%、114.1%和71.2%。實施例41.鐮刀菌ATCC11711菌株的種子培養同實施例l。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養除了配制培養基時不加酪氨酸以及發酵培養基在12rC條件下滅菌20min之外，其它同實施例1。3.酪氨酸的添加方式當培養時間為24h時，在鐮刀菌發酵培養基中添加無菌酪氨酸至12.5mg丄"。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。同實施例1。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為15.86mg丄-1，與菌絲體干重比為4.99mg.g—1，冬青生菌素H的平均產率為5.29mg七+cT1，分別比對照組提高了51.1%、94.3%和51.1%。實施例51.鐮刀菌ATCC11711菌株的種子培養同實施例1。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養除了配制培養基時不加酪氨酸以及發酵培養基在12rC條件下滅菌20min之外，其它同實施例1。3.酪氨酸的添加方式，在鐮刀菌發酵培養基中添加無菌酪氨酸至12.5mg七'1。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。同實施例l。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為14.76mg七"，與菌絲體干重比為5.17mgf1，冬青生菌素H的平均產率為4.92mg丄十d—1，分別比對照組提高了40.6%、101.3%和40.6%。實施例61.鐮刀菌ATCC11711菌株的種子培養同實施例1。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養除了配制培養基時不加酪氨酸以及發酵培養基在12rC條件下滅菌20min之外，其它同實施例1。3.酪氨酸的添加方式當培養時間為12h時，在鐮刀菌發酵培養基中添加酪氨酸至5mg七—1，24h時在鐮刀菌發酵培養基中再添加酪氨酸至5mg.L-'。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。同實施例1。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為15.81mg丄"，與菌絲體干重比為4.82mgf1，冬青生菌素H的平均產率為5.27mg丄"'d—1，分別比對照組提高了50.6%、87.7%和50.6%。實施例71.鐮刀菌ATCC11711菌株的種子培養同實施例1。2.鐮刀菌ATCC11711菌株的發酵培養鐮刀菌ATCC11711菌株發酵培養基15g丄"葡萄糖，2g丄"蛋白月東，lg丄"酵母浸膏，2g'L"NaCl，一定濃度的酪氨酸，pH自然；以5%接種量，在28。C,120r/min條件下培養4d。配制培養基時不加酪氨酸，而發酵培養基在12rC條件下滅菌20min。其它同實施例1。3.酪氨酸的添加方式當培養時間為36h時，在鐮刀菌發酵培養基中添加無菌酪氨酸至10mg七—1。4.采用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析冬青生菌素H的濃度。同實施例l。5.實驗結果冬青生菌素H與發酵液體積比值為16.45mg七—"，與菌絲體干重比為4.87mgf1，冬青生菌素H的平均產率為5.48mg丄+d",分別比對照組提高了56.7%、89.6%和56.7%。權利要求1.一種利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，包括(1)鐮刀菌FusariumoxysporumATCC11711菌株的種子培養將鐮刀菌1～2片1cm直徑的瓊脂培養物置于成分包括2～10g·L-1葡萄糖，0.2～2.5g·L-1蛋白胨，0.2～1.5g·L-1酵母浸膏，0.5～3g·L-1NaCl的液體種子培養基中，在20～35℃，100-250r/min條件下培養18～30h；(2)鐮刀菌FusariumoxysporumATCC11711菌株的發酵培養以4-10％接種量將鐮刀菌種子液轉接至成分包括5～15g·L-1葡萄糖/蔗糖，0.5～3g·L-1蛋白胨，0.2～1.5g·L-1酵母浸膏，1～3g·L-1NaCl的發酵培養基，并于0～48h內將2.5～20mg·L-1酪氨酸添加入培養基，100～130℃時滅菌10～40min后，在20～35℃，100-250r/min條件下培養3～5d；(3)發酵培養結束后通過過濾或離心得到菌絲體，以2～4倍于菌絲體體積的丙酮浸泡菌絲體浸泡抽提過夜，或經超聲波處理10～35min后再高速離心收集抽提液；如需得到菌絲干重，則將菌絲體置于烘箱中烘至恒重后稱重；(4)利用高效液相色譜和薄層層析分析得到抽提液中冬青生菌素H的濃度。2.根據權利要求1所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于步驟(1)所述的種子培養基成分為5g七"葡萄糖、lg七"蛋白胨、0.5g七—〗酵母浸膏或1g七—1NaCl。3.根據權利要求1所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于步驟(2)所述的發酵培養基成分為10g丄"葡萄糖/蔗、2g七—'蛋白胨、lg-L—1酵母浸膏或2g七—1NaCl。4.根據權利要求1所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于步驟(2)所述的酪氨酸前體的添加在配制發酵培養基時加入，添加量為12.5mg丄-1。5.根據權利要求1所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于步驟G)所述的過濾是利用G3坩堝進行的。6.根據權利要求1所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于步驟(4)所述的薄層層析是在HSGF254型的預制硅膠板上點樣，展開劑為乙酸乙脂和石油醚的混合物，v/v=2:3，用254nm波長的紫外燈觀察。7.根據權利要求1所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于步驟(4)所述的高效液相色譜分析在規格為150mmX4.60mm，5pm的配備色譜柱PhenomenexLunaC18或C8柱的液相色譜儀上進行，流動相為乙腈-水緩沖液，v/v=30:70，檢測波長為254nm，流速為1.0mL/min。8.根據權利要求15任一項所述的利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，其特征在于所述的培養鐮刀菌生產冬青生菌素H的過程是間歇式或分批補料式。全文摘要本發明涉及一種利用添加酪氨酸提高鐮刀菌合成冬青生菌素H產量的方法，包括如下步驟(1)將鐮刀菌FusariumoxysporumATCC11711菌株置于種子培養基中，在20～35℃，100-250r/min條件下培養18～30h；(2)將鐮刀菌ATCC11711種子液以4-10％接種量轉接至發酵培養基，并于0～48h內加入2.5～20mg·L<sup>-1</sup>酪氨酸，除菌后，在20～35℃，100-250r/min條件下培養3～5d；(3)過濾或離心得到的菌絲體置于烘箱中烘至恒重，再經丙酮浸泡抽提或超聲波處理離心收集抽提液；(4)利用高效液相色譜和薄層層析分析得到抽提液中冬青生菌素H的濃度。該方法操作簡單、產量穩定、可為工業化生產冬青生菌素H提供新的思路和途徑。文檔編號C12R1/77GK101260418SQ20081003650公開日2008年9月10日申請日期2008年4月23日優先權日2008年4月23日發明者楓洪,晨鄧申請人:東華大學