專利名稱：定向積累殺念菌素單一組份fr-008-iii的基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物醫藥技術領域的菌株，特別是一種定向積累殺念 菌素單一組份FR-008-III (Candicidin D)的基因工程菌株。
技術背景鏈霉菌屬原核生物界放線菌目鏈霉菌科，是土壤中主要的微生物類群之一。 很多聚酮類抗生素產生于這類細菌，并且己廣泛應用于醫用、獸用及農用，這包 括紅霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿維菌素(抗寄生的)和納巴霉素(免 疫抑制劑)等。聚酮合酶(PKS)是可以催化合成一大類長度、功能基團和環化狀態不同的 聚酮大環內酯類天然產物的多功能酶類。PKS催化模式類似于經典的脂肪酸合成 酶(FAS)的功能模式。聚酮合酶分為I型(Type I PKS)和II型(Type II PKS) 兩類。大環內酯類化合物如殺念菌素、紅霉素以及夾竹桃霉素等由I型聚酮合酶 負責合成。I型聚酮合酶體系由幾個多功能酶組成，每個多功能酶都包含參與聚 酮生物合成過程所需的各種催化功能域，這包括酰基轉移酶(AT)、酮基合成 酶(KS)、酰基載體蛋白(ACP)、酮基還原酶(KR)、脫水酶(DH)或烯醇還原酶(ER)。其中KS、 AT、 ACP是負責聚酮鏈延伸所必須的功能域，其余非必須的功 能域(KR、 DH、 ER)則負責聚酮鏈上功能基團(酮基，羥基，碳碳單鍵或雙鍵) 的變化。由于每一功能域只參與整個聚酮碳鏈合成中的一步生化反應，這樣聚酮 鏈的長短以及功能團的變化便取決于聚酮合酶上功能域的數量，種類及其排列組 合。II型聚酮合酶與I型聚酮合酶的差別僅在于前者的功能域在聚酮鏈延伸的 反應步驟中被重復使用。七烯大環內酯類抗生素殺念菌素(FR-008/Candicidin)由鏈霉菌FR-008(Str印tomyces sp. FR-008)產生，其合成機制已被闡明，屬于典型的I型聚 酮合酶工作模式。文獻報道七烯大環內酯類抗生素對真菌細胞膜中數量最大的固醇麥角固醇具有很大的親和性，從而對真菌細胞具有選擇性的毒性。殺念菌素是治療人類嚴重系統性真菌感染最重要的抗生素之一。殺念菌素復合物的主要包含 三個組份FR-008-III (Candicidin D)、 FR-008-V和FR-008-VI，其中以 FR-008-III (Candicidin D)為主要活性組份。根據殺念菌素生物合成模型以及殺念菌素3個組份的結構差異，推測殺念 菌素生物合成過程中的兩個催化功能域(KR21和DH18)的非完全活性可能導致 了殺念菌素3個組份的同時生成。通過在染色體上定點突變的方法使KR21和 DH18功能域失去催化活性，從而得到相應的突變株。對突變株發酵產物的高壓 液相和質譜分析(LC-MS)結果印證了這一推論，即KR21功能域的突變失活導致 了 FR-008-V的丟失；DH18功能域的突變失活導致了 FR-008-VI的丟失；KR21和 DH18功能域均突變失活后，僅定向積累FR-008-III (Candicidin D)。發明內容本發明的目是獲得能單一積累殺念菌素復合物中最具藥用價值的定向積累 殺念菌素單一組份FR-008-ni的基因工程菌株，使得本發明可以大規模生產高 純度的殺念菌素有效組份。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明在殺念菌素產生菌鏈霉菌 FR-008染色體上引入基因突變，從而導致殺念菌素生物合成途徑中的位于聚酮 合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位 點均發生了突變，KR21突變為聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸突變為苯丙氨 酸；DH18突變為聚酮合酶FscE第3084位組氨酸突變為酪氨酸以及第3083位 天冬氨酸突變為纈氨酸。該基因改造所得到的工程菌株ZYJ-6僅生產殺念菌素活 性組份FR-008-111，而不再積累原始組份FR-008-V和FR-008-VI。該基因工程菌株的構建方法 (一)確定功能域KR21 (存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶 FscE)的催化活性位點。(二)設計并構建分別用于對KR21和DH18的催化活性位 點進行突變的同源重組載體pJTU573和pJTU572。(三)把pJTU573通過接合 轉移導入菌鏈霉菌FR-008進行同源重組。(四)首先通過硫鏈絲菌素抗性影印篩 選，進而通過PCR以及對PCR產物酶切驗證和測序驗證的方法最終篩選到KR21突變株。(五)同樣方法，把pJTU572導入KR21突變株進行同源重組，最終篩選 到KR21和DH18雙突變株ZYJ-6。本發明定向生產殺念菌素單一組份FR-008-III,其產量是野生型菌株該組 份產量的120-130%，而FR-008-III是殺念菌素3個主要組分中最具藥用價值 的成份。通過該工程菌可以大規模生產高純度的殺念菌素有效組份，所以具有顯 著的工業應用價值。本發明定向積累殺念菌素單一組份FR-008-III的基因工程菌株，其工程菌 ZYJ-6己提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏登記編號 為CGMCC NO. 2394，保藏期限為2008. 03. 07日起的30年。
圖1:突變株ZYJ-6和野生型菌株(鏈霉菌FR-008)之間的衍生關系。KR21 屬于聚酮合酶FscF的一個功能域。聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸(Y)突變為 苯丙氨酸(F)，從而導致功能域KR21活性位點發生了突變。DH18屬于聚酮合 酶FscE的一個功能域。聚酮合酶FscF第3084位組氨酸(H)突變為酪氨酸(Y) 以及第3083位天冬氨酸(D)突變為纈氨酸(V)，從而導致功能域DH18活性位 點發生了突變。突變株ZYJ-6則包含了上述功能域KR21和DH18的雙突變。星號 表示突變后的功能域。Apol和BsrGI分別代表突變后引入的限制性酶切位點。 方框內的堿基序列表示限制性酶識別序列。圖2:突變株ZYJ-6和鏈霉菌FR-008野生型菌株發酵產物的HPLC (高壓液 相)檢測結果。V， III以及VI分別代表FR-008-V， FR-008-III和FR-008-VI。 ZYJ-6突變株僅生產FR-008-in，而不再積累原始組份FR-008-V和FR-008-VI。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保 護范圍不限于下述的實施例。實施例一通過先引入KR21突變后再引入DH18的突變從而獲得雙突變株 ZYJ-6(一)質粒的構建(用于導入宿主并和染色體發生同源重組以便獲得目標突變)(1)用于KR21功能域突變的質粒構建EcoRI和Kpnl酶解鏈霉菌FR-008文庫柯斯質粒pHZ220后回收3615-bp EcoRI-KpnI DNA片段作為PCR模板，引物Pl和P3用來擴增528-bp DNA片段； P4和P2用來擴增618-bp DNA片段。P3和P4有18-bp的重疊，在該重疊區域引 入突變位點(Y1526F),同時引入DNA限制性酶切位點(ApoI)以便該突變的篩 選(如圖l所示)。通過第二次PCR (引物為P1和P2;模板為瓊脂糖膠回收后的 兩個PCR產物各取1/100加入PCR體系)得到1146-bp DNA片段。1146-bp DNA 片段被克隆在T-vector (得到質粒pJTU566)上并經過測序確認正確后又被酶解 成849-bp SacI-Sf il DNA片段。849-bp SacI-Sf il DNA片段被用來替換3615-bp EcoRI-Kpnl DNA片段(由EcoRI-Kpnl酶解pHZ220后回收得到，并克隆在pIJ2925 載體上而得到質粒pJTU569)內部對應的區域從而得到質粒pJTU571。重組后的 3615-bp EcoRI-Kpnl DNA片段包含了目標突變位點和分布于突變位點兩邊的用 于和染色體發生同源交換的兩個臂(分別為1948-bp和1667-bp)。該3615-bp DNA重組片段最終被克隆在pHZ1358 (大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒)BamHI位點， 從而得到用于和染色體發生同源重組的質粒pJTU573。PCR反應引物PI, 5' -CCGCCTCACCCAACTGCC-3' P3， 5' -GCGACGAAATTTGCCTGGCCG-3' P4, 5，-CCA GGCAAATTTCGTCGCCGC-3'P2, 5'-GGGGAG CCGCTGTCGTAGA-3'(下劃線表示引入的限制性酶切位點 Apol)PCR反應體系0. 1 模板DNA，引物各50 pmol， 4 W DMSO， 2 W Mg2+ ， 5 W dNTP， 5 W緩沖液和1個單位KOD DNA聚合酶(TOYOTA)，加純水到50 Pl。 PCR反應的循環條件為95°C (5分鐘)；32個循環的95°C (30秒)，60°C (306秒)和68。C (36秒)；最后是68。C 5分鐘。(注引物為Pl和P2的第二輪PCR 延伸時間為66秒)。PCR產物末端加A (以便于克隆在T-Vector)堿基的條件為50 PCR產 物，5 W dATP， 2個單位Tag DNA聚合酶，5 W緩沖液，2 W Mg2+，加純水至 50 Pl. 72°C 20分鐘。(2)用于DH18功能域突變的質粒構建用于DH18功能域活性位點相應編碼堿基突變的兩個同源交換臂分別由PCR 擴增獲得。PCR模板為鏈霉菌FR-008文庫柯斯質粒pHZ220的DNA。擴增1475-bp DNA片段所用引物為DH18P1和DH18P2;擴增1203-bp DNA片段所用引物為 DH18P3和DH18P4。突變位點分別通過引物DH18P2和DH18P3引入，同時又引入 限制性酶切位點BsrGI以便于突變篩選(如圖1所示)。1475-bp PCR產物插入 pBluescript II SK(+) EcoRV位點后得到質粒pJTU568,并進行了測序驗證。 1203-bp PCR產物克隆在T-Vector上而得到質粒pJTU565,并進行了測序驗證。 從pJTU565酶解得到的1. 2 kb BsrGI-Kpnl DNA片段被插入到pJTU568相應位點 后得到質粒pJTU570，從而使得兩個同源交換臂在BsrGI位點拼接.該2. 6 kb 重組片段又被BamHI從pJTU570上切出，進而又插入到pHZ1358載體BamHI位點 而得到同源重組質粒pJTU572。PCR引物DH18P1， 5，-GACACGGAGTCCCCCGAGCCCCAGG-3' DH18P2， 5， -CCG ACGGTGTACACGGCGAGCCAGG -3' DH18P3， 5，-CCTGGCTCGCCGTGTACACCGTCGG-3'DH18P4, 5'-CGCCCGAGAGCGGACCGAGGAGTTG-3'(下劃線表示引入的限制性酶 切位點BsrGI) PCR條件1475-bp PCR產物(引物為DH18P1和DH18P2)由KOD DNA聚合酶 (TOYOTA)擴增。PCR反應體系同上。PCR反應的循環條件為95°C (5分鐘); 32個循環的95 °C (30秒)，57°C (30秒)和68 °C (90秒)；最后是68 °C 5分鐘。1203-bp PCR產物(引物為:DH18P3和DH18P4)由Tag DNA聚合酶擴增。PCR條件PCR反應體系0. 1 Pg模板DNA，引物各40 pmol， 3 W DMSO, 2 Pi Mg2+ ， 3 W dNTP， 4 W緩沖液和1個單位Tag DNA聚合酶，加純水到40 W。 PCR反 應的循環條件為95°C (5分鐘)；32個循環的95。C (30秒)，60°C (30秒)和 72°C (20秒)；最后是72。C 5分鐘。(二) 把用于和染色體發生同源重組的質粒導入野生型宿主 通過電轉把PHZ1358衍生質粒(pJTU572或pJTU573)分別導入大腸桿菌ET12567 (攜帶接合轉移輔助質粒pUZ8002)中，以便于pJTU572或pJTU573在輔助 質粒pUZ8002的協助，通過接合轉移進入受體鏈霉菌FR-008細胞中。先在合適 的抗生素存在下培養攜帶pUZ8002和待轉移質粒的大腸桿菌，12小時后收集菌 體，用新鮮LB培養基洗滌菌體3次備用。作為受體的鏈霉菌孢子需經熱激和預 萌發處理。將鏈霉菌孢子懸浮于TES緩沖液(5ml 0.05mol/L， pH8.0)中，在 5(TC水浴中熱激5min，冷卻至室溫后加入等體積2X孢子預萌發培養基(Difco 酵母粉1%， Difco酪蛋白氨基酸1%， CaCl2 0.01mol/L)， 37。C搖床(250rpm)培 養2h，離心收集孢子并重新均勻懸浮于適量的LB培養基中，按108:108與大腸 桿菌細胞等量混合后涂在培養平板(2%瓊脂糖，2%甘露醇，2%黃豆餅粉， pH7.2 7.5)上，進行細菌雙親接合轉移。11小時后用含萘啶酮酸(抑制大腸桿 菌的生長)和硫鏈絲菌素(導入質粒帶有此抗性)的lml無菌水覆蓋平板(終濃 度萘啶酮酸50ng/mL;硫鏈絲菌素25 ng/mL)，置3(TC培養3天后即可看到 轉移接合子。(三) 突變株的篩選和驗證 從覆蓋板上挑選單個接合轉移子接種到抗性(硫鏈絲菌素)平板上進一步確認抗性，再轉接到不加抗生素(硫鏈絲菌素)的平板上進行松弛培養，進而通 過抗性平板和非抗平板影印實驗篩選到若干硫鏈絲菌素敏感的菌株(突變株的備 選株)。以備選株總DNA作為PCR模板；引物Pl和P4用于KR21突變的篩選， 1146-bp源自于突變株KR21突變的PCR產物可以被ApoI酶解為528-bp和618-bp DNA片段，而源自于野生型的同樣大小PCR產物不能被Apol酶解；引物DH-test-L 和DH-test-R用于DH18突變的篩選，706_bp源自于DH18突變的PCR產物可以 被BsrGI酶解為244-bp和462_bp DNA片段，而源自于野生型的PCR產物不能被BsrGI酶解。源自于KR21突變和DH18突變的PCR產物被分別克隆在T-Vector 上進行測序驗證，從而最終確證了目標突變的正確性。KR21突變株PCR篩選條件弓1物P1禾口P4。PCR反應體系:0.05 Pg模板DNA，引物各20 pmol， 1 W DMSO, 1 W Mg2+， 2 Hi dNTP， 2 W緩沖液和0. 5個單位Tag DNA聚合酶，加純水到20 Pl。 PCR 反應的循環條件為95°C (5分鐘)；32個循環的95°C (30秒)，60°C (30秒) 和72'C (22秒)；最后是72°C 5分鐘。DH18突變株PCR篩選條件引物DH-test-L， 5'-GCTCTACCGTCCGCTTCGCC-3' DH-test-R， 5， -CTGTGTCCAGGTGGCGTCCG-3，PCR反應條件復性64'C，延伸15秒.其余同KR21突變株篩選.(四) 雙突變株(ZYJ-6)的獲得先把同源重組質粒pJTU573通過接合轉移導入鏈霉菌FR-008細胞中發生同 源重組，篩選并得到KR21突變株。再把質粒pJTU572導入KR21突變株細胞內通 過同源重組對DH18進行突變，最終篩選得到KR21和DH18雙突變菌株ZYJ-6。(五) 突變菌株的發酵培養平板發酵2%瓊脂糖，2%甘露醇，2%黃豆餅粉(煮沸熬制后過濾去渣)， pH7.2 7.5，孢子接種，30°C， 6天。 (六)抗生素的分離純化刮取平板孢子，稱量后用10倍體積甲醇超聲萃取3次。合并萃取液4(TC旋 轉蒸干后重溶于少量體積甲醇，0. 25uM濾膜過濾后-2(TC避光保存以備檢測。 (七)LC-MS對發酵產物檢測高壓液相色譜-質譜聯用(LC一MS)檢測結果表明突變株ZYJ-6僅生產 FR-008-III (Candicidin D)，而不再積累原始組份FR-008-V和FR-008-VI。 HPLC檢測結果如圖2所示。LC一MS是在安捷倫公司的Agilent 1100 series LC/MSD Trap system上進 行。高壓液相工作條件為柱子(agilent Eclipse XDB-C18， 4.6X250 mm);流速0. 6 ml/min;流動相45%乙晴和55% 5. 5 mM NH4AC (pH 4. 5);檢測波長 380 nm;柱溫25°C。質譜工作條件負離子模式；干燥氣流10 1/min;噴霧器壓力50psi; 干燥氣溫350°C;轟擊電壓1. 0-1. 8 V。實施例二先把同源重組質粒pJTU572通過接合轉移導入鏈霉菌FR-008細胞中發生同 源重組，篩選并得到DH18突變株。再把質粒pJTU573導入DH18突變株細胞內通 過同源重組對KR21進行突變，最終篩選得到KR21和DH18雙突變菌株ZYJ-6。
權利要求
1.一種定向積累殺念菌素單一組份FR-008-III的基因工程菌株，其特征在于，在殺念菌素產生菌鏈霉菌FR-008染色體上引入基因突變，從而導致殺念菌素生物合成途徑中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位點均發生了突變，所述的菌種保藏編號為CGMCC NO2394。
2. 根據權利要求l所述的定向積累殺念菌素單一組份FR-008-I11的基因工 程菌株，其特征是，所述的KR21突變為聚酮合酶FscF上第1526位酪氨酸突 變為苯丙氨酸。
3. 根據權利要求l所述的定向積累殺念菌素單一組份FR-008-I11的基因工 程菌株，其特征是，所述的DH18突變為聚酮合酶FscE上第3084位組氨酸突 變為酪氨酸以及第3083位天冬氨酸突變為纈氨酸。
全文摘要
本發明涉及的是一種生物醫藥技術領域的定向積累殺念菌素單一組份FR-008-III(Candicidin D)的基因工程菌株。在染色體上引入基因突變，從而導致殺念菌素生物合成途徑中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位點均發生了突變，KR21突變為第1526位酪氨酸(Y)突變為苯丙氨酸(F)；DH18突變為第3084位組氨酸(H)突變為酪氨酸(Y)以及第3083位天冬氨酸(D)突變為纈氨酸(V)。本發明定向生產殺念菌素單一組份FR-008-III，其產量是野生型菌株該組份產量的120-130％，而FR-008-III是殺念菌素3個主要組分中最具藥用價值的成份。通過該工程菌可以大規模生產高純度的殺念菌素有效組份。
文檔編號C12P19/00GK101260380SQ20081003582
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月10日 優先權日2008年4月10日
發明者周永軍, 李家良, 由德林, 白林泉, 鄧子新 申請人:上海交通大學