專利名稱：：一種微量dna的多重pcr檢測方法
技術領域：
：本發明屬核酸檢測領域，特別是涉及一種通過改變引物濃度和引物添加方式的多重PCR技術實現對微量DNA的超靈敏檢測。技術背景聚合酶鏈式反應(PCR)是現今生物檢測中最常用的擴增技術，它能將某一DNA片段在幾個小時內擴增幾十萬至百萬倍。并且隨著熒光定量PCR的普及和應用，目標序列的定量也能準確的完成。但是一般PCR僅應用一對引物，通量低，而且對起始模板濃度有要求，靈敏度低。但對于很多研究來說，起始樣本的DNA非常有限，尤其是一些很珍貴的臨床樣本，比如受精卵，激光捕獲顯微切割獲得的細胞等。因此，建立一種通量高、靈敏度高的方法用于分析少量細胞DNA顯得十分迫切和必要。多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性的引物，針對多個DNA模板或者同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。這一概念由Charnberian等NucleicAcidsRes.1988,16:11141-11156率先于1988年提出。由于多重PCR同時擴增多個目的基因，具有節省時間、降低成本、提高效率的優點，特別是節省珍貴的實驗樣本，所以一經提出，即得到眾多研究者的青睞，并且發展迅速，在生命科學的各個領域，多重PCR已經成為一項成熟而重要的研究手段。由于多重PCR要求在同一反應體系中進行多個位點的特異性擴增，因而技術難度增大。一個理想的多重PCR反應體系，并非單一PCR的簡單混合，需要針對目標產物，進行全面分析、反復實驗，建立適宜的反應體系和反應條件。大量的實驗表明，多重PCR的主要技術問題在于引物的設計，組合和濃度優化。目前的研究在對多重PCR的引物優化主要從兩個方面進行一方面是對引物的設計進行序列間的比對，減少引物之間的互補和配對幾率；另一方面是在實驗中對各位點引物的濃度條件進行摸索，調整各組引物的相對濃度，以達到各位點平衡而高效的擴增。這樣的優化對于正常的多重PCR反應效果很好，但是對于微量DNA的多重PCR效果不明顯，因為在正常的多重PCR反應中，由于模板分子數比較多，引物和模板之間的相互作用比較容易進行；但是，當模板的濃度過低，比如低于100個分子時，由于分子之間的相互作用減少，引物和模板之間就很難發生退火反應，而另一方面，由于引物很多，濃度很高，分子數大大過量，引物自身進行反應形成二聚體的幾率就大大增加，其結果就導致體系中各組分在形成二聚體的過程中大量消耗，而無法完成目的產物的擴增。1989年發展出了一種BoosterPCR的方法NucleicAcidsRes，1989，17:5407，可以解決低模板量下的PCR擴增問題。其原理是在低模板分子數的情況下，同時降低引物的濃度，使得引物和模板之間的作用，與引物和引物之間的作用的相對比例增加，使反應向目的片段的擴增方向進行。具體操作為開始幾個循環中保持引物的低濃度，以確保開始擴增的準確性。在目的片段的數量有了一定的增加以后，然后在后面的循環中，將引物的濃度提高，保證擴增的效率。整個操作簡單易行，可以有效地對微量模板DNA進行檢測，但是此方法僅限于單一位點分析，無法進行多位點分析。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種微量DNA的多重PCR檢測方法，是一種超靈敏的多重PCR方法來檢測微量DNA，該方法通過改變多重PCR反應中引物濃度和引物添加方式來解決低模板量下的PCR擴增問題。整個方法操作過程簡單，不需要專業人員，特異性高，并且靈敏度與PCR效率都很高，在實際應用中有廣泛的應用前景。本發明的一種微量DNA的多重PCR檢測方法，包括以下步驟-(1)待檢樣本DNA的抽提；(2)以上面抽提得到的DNA為模板，選取引物1進行PCR反應；(3)反應進行至15個循環的時候，將含有另外引物2的工作液補加到反應體系中，繼續進行未完成的反應；(4)將PCR反應產物進行巢式PCR，分析結果。所述DNA的抽提可以采用常規酚-氯仿抽提法，或用試劑盒抽提。所述的步驟(2)中選取的引物l至少為一對。所述的步驟(3)中補加的引物2至少為一對。所述的步驟(2)與(3)所加的引物區別在于擴增的目的片段不同，步驟(3)所加的引物是用于對步驟(2)沒有擴增的基因進行擴增。本發明為了避免引物過多造成的競爭抑制問題，采用低引物濃度和引物"補加"方式來進行多重PCR反應。本發明的有益效果(1)本發明在對微量DNA進行檢測時，避免了多重PCR過程中引物過多造成的競爭抑制問題，可用于起始樣本非常有限的DNA，尤其是一些很珍貴的臨床樣本，如受精細胞等；(2)特異性、靈敏度、PCR效率高；(3)成本低；(4)整個方法操作過程簡單，不需要專業人員，易于自動化，在實際使用中有廣泛的應用前景。圖1是用降低引物濃度和引物"補加"方式來進行多重PCR反應的示意圖，按照圖示所標記，(A)為選取一些引物進行PCR反應；(B)為反應進行至15個循環的時候，將含有另外引物的工作液補加到反應體系中；(C)為反應繼續進行，直到完成未完成的反應。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作迸一步的闡述，應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1GnRH神經元甲基化的研究-(1)用低熔點瓊脂糖包埋小鼠GnRH神經元細胞500個，抽提DNA;(2)亞硫酸鹽處理抽提的DNA，在這一步大約會有90M的DNA降解掉，因此實際上所留下的DNA相當少；(3)通過NCBI的GeneBank獲取GnRH神經元中可能甲基化的IO個候選基因DNA序列，利用軟件設計引物，并合成相關序列，見表l;并將這些引物各稀釋為10p/mo1。表l引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>GPR54L-FGTTGTTGGGTTAGAAGTTTTGTTTGPR54L-RTCTCACAAACAATAATCTAAAAATAprtL-FGTTGATATTTATTTTTTTTTTGTTTAprtL-RTAAACTTCAAATAACTAACCAAAAERbL-FAGTTTAGAATTTTTGGGGATTTGE亂-RACCTCCTCTACTCCCAAAAAATGabrrlL-FTTTTTTTTTTATTTAGTTGATTTGAGabrrlL-RTTCATATTCTAAACAACCAACATViprlL-FGGAGGGAGAGTAGTTTTAGATTATTViprlL-RTTTCCAAAACTAAAAACTAACCTCCDrd2L-FATGGTTTGAAGGTAAGAATTGGDrd2L-RTACCCTACCCTCTAAAACCACAFgfrlL-FGGTTGTAGTTTGAGAATTATAAGGFgfrlL-RCCCCTAAAACCTAAAAAAAAT(4)取亞硫酸鹽處理后的低熔點瓊脂糖包埋的DNA、引物GnRHL-F、GnRHL-R、P2ry2L誦F、P2ry2L陽R、NmbrL-F、NmbrL-R、GPR54L-F、GPR54L-R、AprtL-F、AprtL-R、高溫聚合酶0.5U、高溫聚合酶緩沖液混合反應，反應條件為95°C，15分鐘(94°C，30秒；45°C，90秒；66°C，90秒)45循環；66°C，IO分鐘；在第十五個循環的時候，將含有剩下5對引物、高溫聚合酶、高溫聚合酶緩沖液的工作液補加到反應中。(5)把PCR反應產物稀釋1000倍，以此為模板用引物分別進行巢式PCR，并將巢式PCR的結果進行測序檢測，分析各序列的甲基化狀態。實施例2口腔粘膜脫落細胞GPR54基因全基因組測序(1)采集20名性早熟患者口腔棉拭子，并用試劑盒抽提DNA。(2)通過NCBI的GeneBank獲取GPR54基因的全基因組序列，對序列分析可知，只要進行4個片段的擴增，即可完全覆蓋GPR54基因的全基因組序列。利用軟件設計引物，并合成相關序列，見表2，并將這些引物各稀釋為10p/mol。表2引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)取口腔棉拭子抽提的DNA、引物L-IF、L-IR、L-IIF、L-IIR、L-IIIF、L-IIIR、高溫聚合酶0.5U、高溫聚合酶緩沖液混合反應，反應條件為95°C，15分鐘(94°C，40秒；59°C，90秒；72°C，90秒)45循環，72°C，10分鐘，在第十五個循環的時候，將含有引物L-IVF、L-IVR、高溫聚合酶、高溫聚合酶緩沖液的工作液補加到反應中。(4)把PCR反應產物稀釋1000倍，以此為模板用引物分別進行巢式PCR，并將巢式PCR的結果進行測序，最后把序列拼接起來，即為全基因組序列，可以進行后續相關研究。權利要求1.一種微量DNA的多重PCR檢測方法，包括以下步驟(1)待檢樣本DNA的抽提；(2)以上面抽提得到的DNA為模板，選取引物1進行PCR反應；(3)反應進行至15個循環的時候，將含有另外引物2的工作液補加到反應體系中，繼續進行未完成的反應；(4)將PCR反應產物進行巢式PCR，分析結果。2.根據權利要求1所述的微量DNA的多重PCR檢測方法，其特征在于所述DNA的抽提采用常規酚-氯仿抽提法，或用試劑盒抽提。3.根據權利要求1所述的微量DNA的多重PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟(2)中選取的引物l至少為一對。4.根據權利要求1所述的微量DNA的多重PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟(3)中補加的引物2至少為一對。5.根據權利要求l、3或4所述的微量DNA的多重PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟(2)與(3)所加的引物區別在于擴增的目的片段不同，步驟(3)所加的引物是用于對步驟(2)沒有擴增的基因進行擴增。全文摘要本發明涉及一種微量DNA的多重PCR檢測方法，通過改變引物濃度和引物添加方式來避免多重PCR技術中引物過多造成的競爭抑制問題，可用于起始樣本非常有限的DNA，尤其是一些很珍貴的臨床樣本，如受精卵，激光捕獲顯微切割獲得的細胞等。本發明整個檢測方案操作過程簡單，特異性高，并且靈敏度與PCR效率都很高，易于自動化，在實際應用中有廣泛的應用前景。文檔編號C12Q1/68GK101245389SQ20081003515公開日2008年8月20日申請日期2008年3月25日優先權日2008年3月25日發明者于明輝,凱李,王劍暉,肖君華,炯陸申請人:東華大學;上海翼和應用生物技術有限公司