用于篩選藥物的報告基因細胞模型及其構建方法

專利名稱：：用于篩選藥物的報告基因細胞模型及其構建方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，更具體的，本發明涉及一種獨特的基因構建物，含有所述構建物的載體，含有所述載體的細胞，所述細胞可作為模型用于蛋白激酶c信號通路調節藥物的篩選。
背景技術：
：隨著現代生物技術的快速發展，基于細胞的藥物篩選模型被廣泛應用于新藥開發，特別是在對大量化合物的高通量篩選中。蛋白激酶C(PKC)是一類Ca2+、磷脂依賴性的蛋白激酶，在跨膜信號傳遞過程中起重要作用，介導多種膜受體，如G蛋白偶聯受體，酪氨酸激酶受體等的跨膜信號轉導。受體激活后導致下游信號分子的活化，如G蛋白、PLC等，這些信號分子再進一步活化PKC，進而引起基因的轉錄。TPA反應元件(TRE)是與PKC信號偶聯的反應元件，當PKC激活后會導致轉錄因子AP-1與TRE的結合，從而激活TRE下游的基因轉錄[參見NetDasEvcimen，GeorgeL.King,TheroleofproteinkinaseCactivationandthevascularcomplicationsofdiabetes,PharmacologicalResearch55(2007)498-510]。PKC與多種疾病相關，如腫瘤侵襲、糖尿病綜合癥、脈管類疾病等，目前正作為一個熱門的藥物靶點進行新藥開發。已上市的PKC抑制劑有禮來公司的ruboxistaurin[參見BirchKA,HeathWF，HermelingRN,JohnstonCM,Stra,L，DellC，SmithC，WilliamsonJR,Reifel-MillerA，LY290181,aninhibitorofdiabetes-inducedvasculardysfunction,blocksproteinkinaseC_stimulatedtranscriptionalactivationthroughinhibitionoftranscriptionfactorbindingtoaphorbolresponseelement,Diabetes.1996May;45(5):642-50]，用于治療糖尿病視網膜綜合癥，另外還有多個PKC抑制劑正在進行臨床研究，包括治療糖尿病微血管并發癥的PKC-P抑制劑，治療乳腺癌的PKC-a反義藥物Affinitak，治療多形性成膠質細胞瘤的4enzastaurin等[參見EricChurchill,GrantBudas，AliceVallentin,TomoyoshiKoyanagi，andDariaMochly-Rosen，PKCIsozymesinChronicCardiacDisease:PossibleTherapeuticTargets1Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2008.48:20.1-20.31]。PKC信號通路還與多種細胞膜受體的功能相關，可以通過檢測PKC的激活間接監測受體的活性，從而用于受體的藥物篩選。G蛋白偶聯受體是人體內最主要的一類與疾病相關的細胞膜受體超家族，其內源配體囊括了激素，神經遞質，細胞因子，鈣離子，以及感官刺激等[參見NeubigRR，SiderovskiDP,RegulatorsofG-proteinsignallingasnewcentralnervoussystemdrugtargets,NatRevDrugDiscov.2002Mar;1(3):187-97]。市場上有近2/3的藥物都通過作用于GPCR起效，在藥物開發中具有巨大價值。綜上，本領域還有必要進一步開發調節PKC信號通路的物質，建立篩選PKC信號通路調節物質的模型或方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種可用于篩選調節蛋白激酶C(PKC)信號通路的物質的細胞模型及其用途。本發明的目的還在于提供基于所述細胞模型來篩選調節PKC信號通路的物質的方法。在本發明的第一方面，提供一種構建物，所述構建物從5'端到3'端依次含有式I所示的結構A—B—C(式I)其中，A具有SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列(較佳的，A由SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列構成)；B為巨細胞病毒(CMV)啟動子序列；C為報告基因序列。在另一優選例中，所述的構建物從5'端到3'端依次含有式II所示的結構A—B—C—D(式II)其中，D為Zeocin抗性基因序列;在另一優選例中，所述的報告基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因，禾口/或熒光素酶(luciferase)基因。在另一優選例中，所述的綠色熒光蛋白是增強的綠色熒光蛋白(EGFP)。在另一優選例中，所述的報告基因是綠色熒光蛋白基因和熒光素酶基因的融合基因。在另一優選例中，綠色熒光蛋白基因位于熒光素酶基因的下游。在另一優選例中，A、B、C或D各元件之間為可操作地相連接。在另一優選例中，A、B、C或D各元件之間具有0-1000bp的間隔序列。優選的，A、B元件之間具有0-20bp(更佳的0-10bp，如3bp)的間隔序列；B、C元件之間具有0-1000bp(如735bp)的間隔序列；C、D元件之間具有0-600bp(如371bp)的間隔序列。在本發明的第二方面，提供一種載體，所述的載體中含有所述的構建物。在本發明的第三方面，提供一種細胞，所述細胞具有蛋白激酶C信號通路；并且，所述細胞含有所述的載體；或其基因組中整合有所述的構建物。在另一優選例中，所述的細胞是真核細胞。在另一優選例中，所述的細胞選自(但不限于)CH0細胞，HEK-293細胞或Hela細胞。在另一優選例中，所述的細胞含有Gi/o偶聯的G蛋白偶聯受體(GPCR，如CCR5)或酪氨酸激酶受體(也是PKC通路成員)。在本發明的第四方面，提供所述的細胞的用途，用于篩選調節(如激活或抑制)蛋白激酶C(PKC)信號通路的物質(如小分子、化合物或多肽)。在另一優選例中，所述的細胞用于蛋白激酶C激活劑(如激動劑)或抑制劑(如拮抗劑)的篩選，或用于G蛋白偶聯受體的激活劑或抑制劑的篩選。在本發明的第四方面，提供一種篩選調節蛋白激酶C信號通路的潛在物質的方法，所述方法包括(1)將候選物質給予所述的細胞；和(2)檢測所述細胞中報告基因的表達情況；其中，若所述候選物質可提高報告基因的表達，則表明該候選物質是激活蛋白激酶C信號通路的潛在物質；若所述候選物質可降低報告基因的表達，則表明該候選物質是抑制蛋白激酶C信號通路的潛在物質。在另一優選例中，步驟(l)包括在測試組中，將候選物質加入到所述的細胞(或細胞培養物)中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中報告基因的表達，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的所述的細胞；如果測試組中報告基因的表達在統計學上高于(優選顯著高于，如高50°/。以上，較佳的高100%以上；更佳的高200。/。以上)對照組，就表明該候選物是激活蛋白激酶C信號通路的潛在物質；如果測試組報告基因的表達在統計學上低于(優選顯著低于，如低50%以上，較佳的低100%以上；更佳的低200%以上)對照組，就表明該候選物是抑制激活蛋白激酶C信號通路的潛在物質。在另一優選例中，所述方法還包括步驟對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于調節蛋白激酶C信號通路有用的物質。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖l顯示了重組報告基因載體的示意圖。圖2顯示了PKC激動劑在轉染了報告基因載體的HEK-293細胞中可激活熒光素酶的表達。其中，A，轉染了報告基因質粒但未加入PKC激動劑刺激的細胞；B，轉染了報告基因質粒同時還加入100nMPKC激動劑刺激的細胞；C，裂解細胞后檢測得到的熒光素酶活性與gal(beta-gal)活性的比值比較(n二2，平均值士標準偏差)。圖3顯示了PKC激動劑在轉染了報告基因載體的Hela細胞中可激活熒光素酶的表達。其中，A，轉染了報告基因質粒但未加入PKC激動劑刺激的細胞；B，轉染了報告基因質粒同時還加入100nMPKC激動劑刺激的細胞，C，裂解細胞后檢測得到的熒光素酶活性與P-gal活性的比值比較(n二2，平均值士標準偏差)。圖4顯示了PKC激動劑以及CCR5激動劑在CH0/CCR5/luc細胞系中均可激活報告基因的表達。其中，A，未加入激動劑剌激的CH0/CCR5/luc細胞；B，加入100nMPKC激動劑PMA刺激的CH0/CCR5/luc細胞；C，加入10nMCCR5激動劑RANTES刺激的CH0/CCR5/luc細胞；D，裂解細胞后檢測得到的熒光素酶活性比較(『2，平均值士標準偏差)。圖5顯示了CCR5激動劑RANTES對CH0/CCR5/luc細胞系中報告基因的激活作用呈濃度依賴性。其中，A，CH0/CCR5/lucG4克隆；B，CH0/CCR5/lucE8克隆；C，CH0/CCR5/lucA10克隆;D，CH0/CCR5/lucHll克隆；E，CH0/CCR5/lucD2克隆；包括5個RANTES的濃度梯度0.1nM，1nM，3.16nM，10nM，和IOOnM。(n=2，平均值士標準偏差)。圖6顯示了PKC抑制劑在轉染了報告基因載體的Hela細胞中可抑制PMA引起的報告基因的表達。其中，PKC抑制劑為Ro-318220(Ro)，所用濃度為luM。圖7顯示了CCR5拮抗劑在CH0/CCR5/luc細胞系中可抑制報告基因表達的激活。四個CCR5拮抗劑作為篩選樣品，其CCR5活性在其他實驗中己知。DMSO作為陰性對照。(n=2，平均值士標準偏差)。8具體實施方式本發明人經過深入研究和設計，在質粒載體中組合兼容包括12-0-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)反應元件(TRE)、巨細胞病毒(CMV)啟動子、報告基因和抗性基因的元件，這些元件可良好的配合，在轉染入哺乳動物細胞后，可在細胞內高靈敏度地報告蛋白激酶C信號通路的情況。如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置于相對于報告基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被"可操作地連接"到該核酸序列上。構建物及載體本發明提供了一種構建物，所述構建物從5'端到3'端依次含有TRE重復序列，CMV啟動子序列，和報告基因序列。所述的TRE是作為與PKC信號偶聯的反應元件，當PKC被激活或被抑制后，可導致轉錄因子AP-1與TRE發生反應，從而啟動TRE下游基因的表達。本發明的構建物中，TRE的下游基因為報告基因，因此可通過檢測報告基因的表達方便地得知PKC的激活或抑制情況。本發明采用TRE重復序列，比采用單一TRE具有更好的反應靈敏性。單個的TRE由9個堿基組成ATGAGTCAG。優選的，所述的TRE重復序列含有9個TRE序列(9XTRE);更優選的，所述的9個TRE序列之間不含有其它間隔性的堿基序列(即具有SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列)。本發明人發現，相對于有間隔序列的情況，采用9個連續串聯的TRE序列(其中無間隔堿基序列)制備構建物，在轉入細胞并制備成細胞篩選模型后，當受到PKC調節劑刺激時，細胞模型的敏感性更理想。所述的"啟動子"是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5'端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。本發明釆用CMV啟動子，所述的CMV啟動子適用于作為真核表達啟動子。作為本發明的優選方式，所述的報告基因啟動子為去除增強子的CMVmin啟動子，這是由于CMV本身具有很強的啟動子活性，其自帶的增強子可一定程度提高信號本底，并且去除增強子的CMV更有利于TRE增強子與報告基因的直接偶聯，所述啟動子例如可從pcDNA3質粒上頁通過PCR或酶切的方式獲得。在CMV啟動子的下游為報告基因，所述的報告基因與CMV啟動子可操作的相連接，所述的報告基因可以是不影響所述TRE重復序列的反應狀態、可在CMV啟動子的啟動下表達、且可指示(或被檢測到)表達情況的基因。作為本發明的優選方式，所述的報告基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因，禾B/或熒光素酶(luciferase，Luc)基因。GFP作為一種標記蛋白，其內源熒光基團在受到紫外光或藍光激發時可高效發射清晰可見的綠光。所述的GFP還包括在野生型GFP基礎上進行改進的蛋白，比如進行基因優化(如去除隱蔽性內含子等)；或通過氨基酸替換提高GFP脫輔基蛋白在高溫(如37'C)條件下的正確折疊，以及改變GFP光譜特性等。因此，作為本發明的優選方式，所述的GFP是增效的綠色熒光蛋白(EGFP)，EGFP為對綠色熒光蛋白進行改進后的蛋白，與GFP具有很高的同源性，在表達后發光的效果更為理想。本領域人員很容易獲得GFP或EGFP的序列，例如，可從pEGFP-Nl質粒上通過PCR或酶切的方式獲得。熒光素酶作為報告基因有如下特點l)本底低熒光素酶本身在哺乳動物細胞中無表達，與特定的反應元件偶聯后可用于特定藥物的篩選；2)反應敏感熒光素酶介導的化學發光反應效率高，發光強，易于檢測；3)反應迅速熒光素酶介導的發光反應速度快，每個樣品僅需幾秒種的檢測時間；4)底物清潔熒光素底物反應敏感且不含同位素，有益于生態環境的保護。作為本發明的優選方式，所述的報告基因是GFP和Luc的融合基因。釆用GFP作為報告基因，可在不裂解細胞的情況下、通過較為直觀的方法觀察到細胞內GFP的表達的情況(呈現綠色)；釆用Luc作為報告基因，需要將細胞裂解，加入熒光素酶底物，測得的結果準確性高。因此將兩者進行融合來作為報告基因，將更有利于藥物篩選過程中對結果的判斷。作為本發明的特別優選的方式，所述的構建物中，在報告基因的下游，還包含有Zeocin抗性基因序列。本領域人員可理解，不同抗性基因對于其上下游的一些元件的功能、或對于目的基因的表達可產生不同的影響，因而需要在構建時選擇合適的抗性基因。而采用Zeocin作為抗性基因來制備構建物，Zeocin的表達對于TRE的反應影響較小，且可良好地用于穩定轉染細胞株的篩選和單克隆。在所述的構建物中，A、B、C或D各元件之間以可操作的方式進行連接，各種功能性元件的操作性連接方式是本領域人員所熟知的。通常，A、B、C或D各元件之間具有0-1OOObp的間隔序列。本發明還提供了一種載體，所述的載體含有前面所述的構建物。所述的表達載體是適合于哺乳動物細胞的克隆和表達的載體。作為本發明的優選方式，所述的表達載體是PGL系列載體，更優選的為PGL-3載體。含有所述構建物的PGL-3載體在轉入細胞并制備成細胞篩選模型后，細胞模型的敏感性特別好。所述的載體中還可以含有一些對于TRE的反應或報告基因的表達沒有負面影響作用的其它元件。細胞模型及用途本發明還提供一種細胞，所述細胞具有蛋白激酶C信號通路；并且，所述細胞含有前面所述的載體；或其基因組中整合有前面所述的構建物。所述的細胞對于檢測蛋白激酶C信號通路的變化特別敏感，可作為良好的藥物篩選細胞模型。作為本發明的優選方式，所述的細胞是真核細胞。蛋白激酶C信號通路廣泛分布于真核細胞特別是哺乳動物細胞內。作為本發明的優選方式，所述的細胞選自(但不限于)CH0細胞，服K-293細胞或Hela細胞。所述的細胞帶有真核抗性，所述的真核抗性為Zeocin抗性，可良好地用于穩定轉染細胞株的篩選和單克隆。本發明的細胞可作為細胞模型，用于篩選調節(如激活或抑制)蛋白激酶C(PKC)信號通路的物質，也即篩選蛋白激酶C信號通路的激活劑(如激動劑、上調劑等)或抑制劑(如拮抗劑，下調劑等)。所述的物質例如小分子物質、化合物或多肽。作為本發明的優選方式，所述的細胞還含有Gi/o偶聯的G蛋白偶聯受體(如CCR5)或酪氨酸激酶受體。上述受體存在于細胞膜上，與PKC信號通路相關。例如，CCR5在被激活后，可引起下游信號分子的活化，再進一步活化PKC，進而引起基因的轉錄。因此，可通過檢測PKC的激活間接監測細胞膜相關受體的活性，從而用于受體的藥物篩選。本發明還提供了一種構建報告基因細胞模型的方法，包括以下步驟(1)將EGFP序列連接到pGL3載體上的熒光素酶基因序列的下游，連接后得到熒光素酶與EGFP的融合基因；(2)將zeocin抗性基因連接到(l)獲得的載體中熒光素酶與EGFP的融合基因的下游，用于真核抗性篩選；(3)將CMVmin啟動子連接于(2)獲得的載體上熒光素酶與EGFP的融合基因的上游，構成真核表達元件；(4)將9個串聯的TRE序列連接到(3)獲得的載體上；(5)在哺乳類動物細胞中轉染(4)獲得的質粒，培養轉染的細胞，zeocin篩選兩周后挑選單克隆，培養成細胞系。在另一優選例中，EGFP序列通過NcoI酶切位點與pGL3質粒上的熒光素酶基因連接構成熒光素酶與EGFP融合蛋白。在本發明的一個優選例中，所述的細胞選自HEK-293和Hela。在本發明的一個優選例中，所述的細胞為CHO/CCR5(即含有CCR5的CHO細胞)。篩選方法本發明以TRE作為分子靶點，可進行針對PKC信號轉導通路的藥物篩選，包括(但不限于)PKC激活劑或抑制劑的篩選，或偶聯PKC信號轉導通路的細胞受體(如G蛋白偶聯受體或酪氨酸激酶受體)激活劑或抑制劑的篩選。因此，本發明提供了一種篩選調節蛋白激酶C信號通路的潛在物質的方法，所述方法包括將候選物質給予所述的細胞；和檢測所述細胞中報告基因的表達情況；其中，若所述候選物質可提高報告基因的表達，則表明該候選物質是激活蛋白激酶C信號通路的潛在物質；若所述候選物質可降低報告基因的表達，則表明該候選物質是抑制蛋白激酶C信號通路的潛在物質。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到蛋白激酶C信號通路的變化，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的所述的細胞。作為本發明的一種優選方式，應用PKC激動劑來激活所述細胞中的PKC信號通路，從而篩選可拮抗PKC激動劑對于PKC信號通路的激活作用的拮抗劑。12在本發明的一些實例中，提供了篩選PKC信號通路的拮抗劑方法，包括先釆用PKC激動劑(如佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯，PMA)激活細胞內的PKC信號通路，然后用候選藥物處理細胞，觀察候選藥物處理前后細胞內的報告基因的表達情況，如被PKC激動劑激活的PKC信號通路在候選藥物處理后表達比處理前顯著降低，則該候選藥物是潛在的PKC信號通路的拮抗劑。作為本發明的一種優選方式，應用表達G蛋白偶聯受體的所述細胞模型來篩選，從而篩選通過調節G蛋白偶聯受體而影響PKC信號通路的調節劑。在本發明的一些實例中，提供了篩選G蛋白偶聯受體激動劑或拮抗劑的方法。例如，篩選G蛋白偶聯受體拮抗劑(如完全拮抗劑或者部分拮抗劑)的方法包括先應用G蛋白偶聯受體(如CCR5)激動劑(如可選自RANTES、MIP-la或MIP-l(3)處理細胞，然后用候選藥物處理細胞，觀察候選藥物處理前后細胞內的報告基因的表達情況，如被G蛋白偶聯受體激動劑激活的PKC信號通路在候選藥物處理后表達比處理前顯著降低，則該候選藥物是潛在的PKC信號通路的拮抗劑，或是潛在的G蛋白偶聯受體的拮抗劑。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，可對這些物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于調節蛋白激酶C信號通路有用的物質。因此，本發明還包括一類通過本發明的篩選方法獲得的調節PKC信號通路或細胞受體的調節劑。本發明的主要優點在于(1)首次在質粒載體中優化組合了TPA反應元件(TRE)、巨細胞病毒(CMV)啟動子、報告基因和抗性基因，這些元件可良好的配合，在轉染入哺乳動物細胞后，可在細胞內高靈敏度地報告蛋白激酶C信號通路的情況。(2)本發明的細胞模型可用于對多個藥物靶點進行篩選，以及進行針對多種適應癥的藥物篩選，包括糖尿病，慢性心臟病，HIV感染，自身免疫性疾病等°(3)本發明可高通量化，可快速、簡便地篩選藥物，適合用于大規模的藥物篩選。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例l熒光素酶和EGFP融合蛋白表達載體的構建以pEGFP-Nl(Clontech)為模板，用PCR的方法獲得EGFP基因片段，并在引物兩端分別設計限制性內切酶酶切位點HindIII和BspHI。pGL3(promega)用HindIII，Ncol雙酶切后，酶切產物與載體質粒pGL3酶切片段連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，抽提質粒，并進行雙酶切鑒定。經鑒定連接成功的質粒記為pGL3-EGFP，在導入細胞后可表達EGFP與螢光素酶(luciferase)的融合蛋白。EGFP引物序列Ph5GCAGATCTTCATGAGTCAGACAGGCGTGTACGG3(SEQIDNO.1);P2:5AGGAAGCTTCGGTCCCGGTG3(SEQIDNO.2)。實施例2插入真核抗性基因的報告基因載體構建將pSV40/Zeo2質粒(購自invitrogen)用Bamffl和SalI雙酶切，回收得到的l.lkb條帶，與pGL3-EGFP的BglII和SalI雙酶切產物連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑取5個單克隆在大腸桿菌內擴增，抽提質粒，并進行雙酶切鑒定。鑒定成功后的質粒記為pGL3-EGFP-Zeo。實施例3插入真核表達調控元件的報告基因載體構建以pcDNA3為模板，用PCR的方法拉CMVmllin啟動子，并在引物兩端分別設計限制性內切酶酶切位點BglII和HindIII，酶切產物與載體質粒pGL3-EGFP-Zeo酶切產物連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑取5個單克隆在大腸桿菌內擴增，抽提質粒，并進行雙酶切鑒定。鑒定成功后的質粒記為pGL3-CMVmin-EGFP-Zeo。根據TRE的序列，設計9個串聯的TRE，并在體外人工合成兩條互補單鏈，序列兩端分別設計KpnI和BglII的酶切位點，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。體外將兩條單鏈退火，退火產物與pGL3-CMVmin-EGFP-Zeo酶切產物直接連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑取5個單克隆在大腸桿菌內擴增，抽提質粒，并進行雙酶切鑒定。鑒定成功后的質粒記為pGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo，并送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序，以鑒定所有反應元件序列的正確性。報告基因載體的模式圖如圖l。CMVmin引物序列P3:5-3GGAAGATCTGTAGGCGTGTACGG(SEQIDNO.3);P4:5-3CCCAAGCTTGGGTCTCCCTATA(SEQIDNO.4)。串聯的TRE引物序列P5:5-3CATGAGTCAGATGAGTCAGATGAGTCAGATGAGTCAGATGANO.5);(其中，前后的C作為粘性末端)；P6:5-3(SE(5IDNO.6)。實施例4PKC激動劑在HEK-293細胞中可激活報告基因的表達HEK-293細胞(人胚胎腎細胞，購自ATCC)用含10%胎牛血清的MEM細胞培養液，放于含5%002的37'C細胞培養箱中培養。HEK-293細胞以每孔20000個的密度鋪24孔板，24小時后細胞匯合度約90%。用磷酸鈣法轉染(分子克隆實驗方法，第二版，787792頁)，每孔轉染200ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質粒，同時轉染50ngp-gal質粒作為轉染內參。轉染后8小時換新鮮培養液，37°C，5%<302條件下培養過夜。轉染后24小時用無血清培養液換液，繼續培養24小時。然后在細胞培養體系中加入終濃度為100riM的PKC激動齊lJPMA(購自Sigma)，培養12小時后熒光顯微鏡下觀察熒光。然后吸取培養液，加入熒光素酶裂解液(購自Promega)，裂解10分鐘后，將細胞裂解液置-8(TC保存待檢測。檢測之前室溫化開細胞裂解液，并在室溫平衡至少30分鐘。平衡好的細胞裂解液再分別測試P-gal活性和熒光素酶活性。取10ul裂解液，加入40ulTris和50ul(3-gal檢測緩沖液，37'C培養2小時后加入100ulNaHC03終止反應，在酶標儀上用405nM的濾片檢測讀數。另取取20ul裂解液，加入10ul熒光素酶底物(購自Promega)，在微盤冷光檢測儀(Microlumatplus,購自perkinelmer)上讀數。結果表明，磷酸鈣轉染后的293細胞成功表達了(3-gal，見圖2A,其讀數用于排除轉染率上的誤差(即作為basal)。報告基因質粒也成功表達，在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光，見圖2B。在100nM的PMA刺激的細胞中，綠色熒光強度顯著強于未刺激的細胞，而熒光素酶活性則比未刺激的細胞提高了約IO倍，見圖2C。實施例5PKC激動劑在Hda細胞中可激活報告基因的表達Hela細胞(人宮頸癌細胞，購自ATCC)用含10。/。胎牛血清的MEM細胞培養液，放于含5%(:02的37'C細胞培養箱中培養。Hela細胞以每孔1500個的密度鋪96孔板，24小時后細胞匯合度約95%。用Lipofectamine(購自Invitrogen)轉染，每孔轉染150ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質粒，同時轉染100ng卩-gal質粒作為轉染內參。轉染后5小時換新鮮培養液，37°C，5%(:02條件下培養過夜。其余操作步驟同實施例4。結果表明，脂質體轉染后的Hela細胞成功表達了p-gal，見圖3A，其讀數用于排除轉染率上的誤差(即作為basal)。報告基因質粒也成功表達，在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光，見圖3B。在100nM的PMA刺激的細胞中，綠色熒光強度顯著強于未刺激的細胞，而熒光素酶活性則比未刺激的細胞提高了IO倍，見圖3C。實施例6PKC抑制劑在Hela細胞中可抑制PMA引起的報告基因表達Hela細胞以每孔1500個的密度鋪96孔板，24小時后細胞匯合度約95%。用Lipofectamine(購自Invitrogen)轉染，每孑L轉染150ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質粒，同時轉染100ng(3-gal質粒作為轉染內參。轉染后5小時換新鮮培養液，37°C，5%(302條件下培養過夜。轉染后24小時用無血清培養液換液，繼續培養24小時。然后在細胞培養體系中加入終濃度為lmM的PKC拮抗劑Ro31-8220(購自Sigma)，37°C，5%(:02條件下預孵育3小時后加入終濃度為10nM的PKC激動劑PMA，培養10小時后收細胞。其余操作步驟同實施例4。結果表明，脂質體轉染后的Hela細胞成功表達了(3-gal，其讀數用于排除轉染率上的誤差(即作為basal)。報告基因質粒也成功表達，在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光。在10nM的PMA刺激的細胞中，熒光素酶活性顯著高于未刺激的細胞，而加入Ro31-8220和PMA的細胞中，熒光素酶的活性與本底表達并無明顯差異，見圖6。說明10nM的PMA對PKC的激動作用被Ro31-8220成功抑制。此結果與其他文獻報道一致，說明本發明構建的報告基因系統可應用于PKC拮抗劑的篩選。實施例7CHO/CCR5細胞系的建立從人白細胞(全血來源上海市血液中心)的總cDNA文庫中通過RT-PCR克隆目的基因，得到編碼CCR5的全長DNA，用限制性內切酶HindlII/Xho1(購自Promega)雙酶切它們的全長DNA及空質粒pcDNA3(購自Invitrogen)，再通過T4連接酶(購自Promega)將它們的全長DNA插入pcDNA3(購自Invitrogen)中，得到質粒pcDNA3-CCR5。質粒的序列通過測序得到確證。CCR5PCR弓l物P7:5-3TCTAAGCTTGGCACGAGTCG3(SEQIDNO.7);P8:5-3TACCTCGAGAACAGGCAACGTA3(SEQIDNO.8)。CHO細胞(中華倉鼠卵細胞，購自ATCC)用含10。/。胎牛血清的a-MEM細胞培養液，放于含5%<:02的37'C細胞培養箱中培養。用Lipofectamine2000分別轉染上述質粒于CHO細胞中。72小時后在培養液中加入600嗎/mlG418(G418為一種抗生素，pcDNA3含G418抗性基因)，維持兩周使得那些有G418抗性的細胞存活下來。接著，用MiniMACs免疫磁珠快速分選法(MiltenyiBiotec公司)篩選表達CCR5的CHO細胞，重復兩次后挑單克隆。FACS(熒光活化的細胞篩選，Fluorescence-activatedCellSorting)檢測細胞表面CCR5表達情況用0.04%EDTA-PBS(PBS:磷酸緩沖溶液)消化細胞，每管加入約106個細胞，用冷的PBS洗兩遍；加入10)ag/ml—抗(小鼠來源anti-CXCRl、anti-CXCR4或anti-CCR5，均購自R&D)100ial，4。C避光孵育lh;用冷的0.1。/。BSA-PBS洗細胞17兩次，加入1:100稀釋的FITC標記的羊抗小鼠的二抗(購自JacksonImmunoResearch)80pl，4。C避光孵育40min;用冷的0.1。/。BSA-PBS洗細胞兩次，加入300plPBS重懸細胞，用流式細胞儀(FACS)檢測細胞表面熒光強度。淘汰受體表達低的克隆。此后FACS定期檢測細胞的受體表達情況，選擇維持3個月受體表達陽性率沒有明顯下降且用["S]-GTP丫S結合實驗檢測受體功能穩定的克隆作為穩定表達受體的細胞系。上述制備獲得的細胞系記為CHO/CCR5，用于后續的實施例。實施例8報告基因載體在CHO/CCR5細胞系中穩定轉染與CHO/CCR5/luc細胞系的建立CHO/CCR5細胞用含G418和10。/。胎牛血清的a-MEM細胞培養液，放于含5%C02的37'C細胞培養箱中培養。CHO/CCR5以每孔75000個的密度鋪24孔板，24小時后細胞匯合度約90%。用Lipofectamine(購自Invitrogen)轉染，每孑L轉染500ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質粒。轉染后5小時換新鮮培養液，37°C，5%C02條件下培養過夜。轉染24小時后，將孔內的細胞以不同的密度鋪24孔板，24小時后在培養液中加入250嗎/mlZeocin(購自Invitrogen)，維持篩選壓力兩周，每隔三天換一次液。隨后，細胞在無血清培液中培養24小時，再加入10nM的RANTES培養12小時，用0.04。/。EDTA-PBS消化細胞，離心后去除上清，加入無血清培液重新懸浮，濃度為l(^個/ml。FACS分選并收集帶GFP熒光的細胞，培養24小時后，用0.04。/。EDTA-PBS消化細胞，并用培液稀釋至10個/ml，鋪96孔板。培養兩周后挑選有單克隆的孔，進行熒光素酶報告基因檢測。選擇陽性細胞克隆擴大，凍存，記為CHO/CCR5/luc。其中五個單克隆分別記為D2，AIO，Hll，E8和G4。實施例9PKC激動劑在CHO/CCR5/luc細胞系中可激活報告基因的表達CHO/CCR5/luc細胞用含Zeocin和10%胎牛血清的a-MEM細胞培養液，放于含5%032的37'C細胞培養箱中培養。CHO/CCR5/luc細胞每孔1200個的密度鋪96孔板，24小時后用無血清的a-MEM細胞培養液換液，繼續培養24小時后，加入終濃度為100nM的PMA、終18濃度10nM的RANTES、或者DMSO。培養12小時后裂解細胞，取20ul裂解液，加入10ul熒光素酶底物(購自Promega)，在微盤冷光檢測儀(Microlumatplus,購自perkinelmer)上讀數。結果表明，報告基因在CH0/CCR5/luc細胞中有本底表達，見圖4A，有可見的綠色熒光及可測的熒光素酶活性，證明報告基因確實已經穩定轉染。100nM的PMA處理后，細胞裂解液的熒光素酶活性顯著提高，見圖4B，證明報告基因系統在CH0/CCR5/luc細胞中工作正常。在加入10nMRANTES后，可明顯引起熒光素酶報告基因活性的增加，見圖4C。熒光素酶的活性比較見圖4D。實施例IOCCR5激動劑RANTES在CHO/CCR5/luc細胞系中可激活報告基因的表達CHO/CCR5/luc細胞每孔1200個的密度鋪96孔板，24小時后用無血清的a-MEM細胞培養液換液，繼續培養24小時后，加入不同終濃度的RANTES(購自R&D)，終濃度分別是0.1nM，0.3nM，lnM,3nM，10nM，100nM。培養12小時后裂解細胞，取20ul裂解液，加入10ul熒光素酶底物(購自Promega),在微盤冷光檢測儀(Microlumatplus，購自perkinelmer)上讀數。結果表明，所選的五個單克隆，D2，AIO，Hll，E8禾口G4，均穩定表達了熒光素酶報告基因，有明顯的本底表達。RANTES激動后引發CCR5受體介導的信號轉導，激活PKC，進而引起熒光素酶報告基因活性的增加，并與RANTES呈濃度依賴性，見圖5A-E。5個CHO/CCR5/luc克隆的RANTES刺激曲線EC50值如表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>五個單克隆的RANTES刺激ECso值均在l10nM之間，表明報告基因細胞系的劑量反應有較高的敏感性，可用于激動劑藥物的大規模篩選，同時還可以用于針對RANTES的拮抗劑篩選。實施例llCCR5拮抗劑在CHO/CCR5/luc細胞系中可抑制報告基因表達的激活CHO/CCR5/luc細胞G4克隆每孔1200個的密度鋪96孔板，24小時后用無血清的a-MEM細胞培養液換液，繼續培養24小時后，加入終濃度是IOOnM的藥物(分別是CCR5拮抗劑TD0501，TD0232，TD0082或TD0517，均由上海靶點藥物有限公司提供)，在37'C，5%(302條件下預培養3小時后，在培養體系中加入終濃度為10nM的RANTES。繼續培養10小時后，裂解細胞，其余操作步驟同實施例9。結果表明，RANTES可顯著刺激熒光素酶報告基因的表達，證明本發明構建的藥物篩選系統工作正常。在篩選的5個藥物中，TD0501不能拮抗RANTES對CCR5受體的激動作用，而TD0232，TD0082以及TD0517均表現出了CCR5拮抗劑的活性，見圖7。在本方法上得到的結論與通過其他篩選方法得出的結論一致，證明了本方法的可靠性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院<120〉用于篩選藥物的報告基因細胞模型及其構建方法<130〉080832<160〉8〈170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉33〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物〈400〉1gcagatcttcatgagtcagacaggcgtgtacgg33<210〉2〈211>20〈212〉隠<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉2aggaagcttcggtcccggtg20<210〉3<211>23<212〉隱<213>人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>引物<400>3ggaagatctgtaggcgtgtaegg<210〉4<211〉22<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>4cccaagcttgggtctccctata<210〉5<211>83<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉5catgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgag60tcagatgagtcagatgagtcagc83〈210〉6〈211〉91<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>niisc_feature〈223〉引物<400>6tcgagctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatc60tgactcatctgactcatctgactcatggtac91<210〉7<211〉2022<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223〉引物<■>7tctaagcttggcacgagtcg20<210>8〈211>22<212>DNA〈213〉人T序列權利要求1.一種構建物，其特征在于，所述構建物從5’端到3’端依次含有式I所示的結構A—B—C(式I)其中，A具有SEQIDNO5中第2-82位所示的序列；B為巨細胞病毒啟動子序列；C為報告基因序列。2.如權利要求l所述的構建物，其特征在于，所述的構建物從5'端到3'端依次含有式II所示的結構A—B—C—D(式n)其中，D為Zeocin抗性基因序列。3.如權利要求l所述的構建物，其特征在于，所述的報告基因選自綠色熒光蛋白基因，禾口/或熒光素酶基因。4.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求1-3任一所述的構建物。5.—種細胞，其特征在于，所述細胞具有蛋白激酶C信號通路；并且，所述細胞含有權利要求4所述的載體；或其基因組中整合有權利要求l-3任一所述的構建物。6.如權利要求5所述的細胞，其特征在于，所述的細胞選自CH0細胞，HEK-293細胞或Hela細胞。7.如權利要求5所述的細胞，其特征在于，所述的細胞含有Gi/o偶聯的G蛋白偶聯受體或酪氨酸激酶受體。8.權利要求5所述的細胞的用途，其特征在于，所述的細胞用于篩選調節蛋白激酶C信號通路的物質。9.一種篩選調節蛋白激酶C信號通路的潛在物質的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將候選物質給予權利要求5或6所述的細胞；和(2)檢測所述細胞中報告基因的表達情況；其中，若所述候選物質可提高報告基因的表達，則表明該候選物質是激活蛋白激酶C信號通路的潛在物質；若所述候選物質可降低報告基因的表達，則表明該候選物質是抑制蛋白激酶C信號通路的潛在物質。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(l)包括在測試組中，將候選物質加入到權利要求5或6所述的細胞中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中報告基因的表達，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的權利要求5或6所述的細胞；如果測試組中報告基因的表達在統計學上高于對照組，就表明該候選物是激活蛋白激酶C信號通路的潛在物質；如果測試組報告基因的表達在統計學上低于對照組，就表明該候選物是抑制激活蛋白激酶c信號通路的潛在物質。全文摘要本發明屬于生物
技術領域：
，公開了一種獨特的基因構建物，所述構建物兼容了TPA反應元件、巨細胞病毒啟動子、報告基因和抗性基因的元件，這些元件可良好的配合，在轉染入哺乳動物細胞后，可在細胞內高靈敏度地報告蛋白激酶C信號通路的情況。本發明還公開了含有所述構建物的載體，含有所述載體的細胞，所述細胞可作為模型用于蛋白激酶C信號通路調節藥物的篩選。本發明提供的報告基因細胞模型可用于篩選與蛋白激酶C信號通路相關的藥物，具有機制明確、操作簡便、可高通量化的特點，對蛋白激酶C信號通路相關的藥物篩選有積極的意義。文檔編號C12N15/11GK101544975SQ200810035070公開日2009年9月30日申請日期2008年3月25日優先權日2008年3月25日發明者瑜吳,應鎖環,瑾張,翟培彬,楊蘇,鋼裴,力陳,陳仁海申請人:中國科學院上海生命科學研究院