一種生物條形碼探針的制備方法

專利名稱：一種生物條形碼探針的制備方法
技術領域：
本發明屬生物檢測領域，特別是涉及一種用于生物檢測的探針的制備方法。
技術背景最初，納米金主要是用于蛋白質等高分子的標記。蛋白質與納米金的連接是蛋白質等 高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與 蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。納米金與核酸的連接是最近十年發展的一種技術，不同于蛋白質的標記方法，核酸的 標記主要依靠其與納米金之間形成的共價鍵。納米金標記核酸的方法主要有三種巰基修 飾的寡核苷酸與納米金的連接，預活化的納米顆粒與寡核苷酸的共價連接；物素修飾的寡 核苷酸與包被了抗生物素蛋白的納米金顆粒的連接。至今，巰基修飾的寡核苷酸與納米金 顆粒的連接方式是最普遍常用的標記方式。巰基標記的共同特點是利用巰基能與納米金表面發應生成共價連接的方式將寡核苷 酸固定在金顆粒表面。現在的修飾方式大致有三種分別為己基巰基修飾的寡核苷酸，類 固醇二巰基修飾的寡核苷酸以及三巰基修飾寡核苷酸。己基巰基修飾法是最早也是常用的 一種修飾方式，它用己基巰基修飾在寡核苷酸的5'端作為連接分子，再通過巰基與納米金表明的共價鍵連接到納米金顆粒的表面。但單巰基標記的寡核苷酸穩定性較差，如當Au 顆粒大于30nm時，單巰基標記的寡核苷酸則會在40 90'C的溫度下或高濃度的鹽溶液中 (0.3 1.0MNaCl)中緩慢降解。并且，不論所使用的納米金顆粒的大小，其所在的溶液中 含有二硫蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇時，如果放置時間過長，巰基形成的共價鍵將被還原， 納米顆粒探針會失活。尤其當溫度在40 95。C時，巰基乙醇和DTT能將寡核苷酸探針從納 米顆粒的表面置換下來。而且出現了 DTT的置換過程后，納米金顆粒會出現不可逆的聚集 現象。為了增加巰基修飾法連接的穩定性，2000年，Mirkin等開發了二巰基的修飾方式。連 接分子使用的是類固醇二巰基，但在0.01mM DTT存在的情況下，溶液在40'C和95'C的 兩個溫度的熱循環中仍然不能維持長久的穩定。隨后Mirkin選取了三巰基作為連接頭，進 行寡核苷酸的固定，進一步提高穩定性。實驗數據顯示，在40攝氏度時，10mM DTT， 0.3mol/LNaCl的溶液中，單己基巰基修飾的寡核苷酸在2min內就出現了完全的聚集現象， 而用具有二巰基尾的二噻垸表雄(甾)酮作為連接分子的寡核苷酸在2個小時內才出現聚 集現象，6小時后完全聚集。使用三己基巰基修飾的寡核苷酸，則在10小時后才出現聚集現象，20小時后才完全聚集。除了巰基固定的方法外，另一種常用的連接方式為生物素修飾寡核苷酸與鏈霉親和素 包被的納米金的標記方法。生物素修飾的寡核苷酸一般由相應的序列合成公司，在合成過 程中加入。納米金顆粒的包被則有現有的試劑盒購買，可以快速的完成鏈霉親和素的包被。 其主要固定原理是生物素和親合素的親合作用。親合素分子上有四個與生物素結合的位 點，利用二者之間高特異性的親合作用進行檢測。由于親合素(Avidin)是一種糖蛋白， 分子量67kD。它包括四個亞基，每個為128氨基酸殘基構成的多肽鏈，在該鏈中的IO， 20， 43和110位點上共有四個色氨酸。每一亞單位上的糖基為一個低聚糖，含有甘露糖和 氨基葡萄糖，最獨特之處是親合素(Avidin)分子表面有四個疏水口袋(每一亞單位有一 個)，該處即為與四個生物素殘基特異結合的位點。生物素與親合素之間的結合是非共價 鍵結合，但是非常穩定。只有在極低pH溶液或其他極端條件下，兩者的連接才會被破壞。Pathlak在2001年利用預活化的納米金顆粒實現了對核酸的共價標記。該方法是預先 在納米顆粒的表面通過DTT和l,l'-羰基二咪唑反應，形成氨基甲酸一咪唑簇。然后5'氨 化修飾的寡核苷酸可以通過氨基甲酸連接到納米顆粒的表面。納米金溶液并不穩定，其顆粒容易發生聚集，形成可見的沉淀。寡核苷酸修飾后有利 于膠體金的穩定。但是對納米金顆粒的吸收峰會產生微量的影響，并不影響檢測。在寡核 苷酸的標記過程中，需要考慮在納米金表面的覆蓋率、顆粒穩定性和雜交效率三者間達到 一個平衡。覆蓋率要足夠高，可以提高納米金顆粒的穩性，但是如果過高，又會降低后續 的雜交效率。同時在制備的過程中有研究者提出使用吐溫20等非離子表面活性劑預先處 理納米金后，再進行巰基的連接反應，能進一步的提高納米金在反應過程中的穩定性。這 和吐溫20在納米金表面形成的保護層相關。納米金標記的寡核苷酸與熒光標記的寡核苷酸相比，又更好的雜交特性。首先，它的 熔解溫度窄， 一般為3 4t:，而熒光標記的一般為12'C左右。因此在合適的雜交溫度下， 它有很高的雜交特異性。對于單堿基的分辨率。發現，在相應的Tm值下，熒光標記的寡 核苷酸完全配對的和存在一個堿基錯配的序列雜交相比為62%/38%,而同樣條件下，納米 金標記的寡核苷酸的比例為82%/18%。納米金標記的雜交特異性比熒光標記的雜交特異性 要高3 4倍。在電化學檢測法中，特異性可以達到105: 1,遠高于現今其他的檢測手段。納米金標記的寡核苷酸的高靈敏度也是它的重要優點之一。文獻記載的最低能檢測的 靶序列為50fm，達到了 PCR的檢測靈敏度。常用的顯色手段為銀染，在銀染過程中，銀 顆粒會析出沉淀在納米金顆粒表面，使其體積增大l萬倍，成為肉眼可見的信號。納米金標記的寡核苷酸在雜交過程中，也存在一些不利因素。最主要的就是空間位阻 問題。如果用于酶反應，如聚合酶鏈式反應。但實驗數據表明，空間位阻雖然是影響雜交 的一個重要因素，降低納米金表面探針(或引物)的覆蓋率、使用較長的連接分子都能大 大提高雜交效率。使用C6HuN7作為連接分子的納米金標記的引物，在PCR反應中的利用 率將近100%。因此，納米金顆粒的空間位阻效應并不會成為雜交的障礙。 發明內容本發明的目的是提供一種生物條形碼探針的制備方法，該方法可以大大提高生物條形 碼探針的穩定性、相應的特異性和縮短雜交時間。本發明的一種生物條形碼探針的制備方法，包括以下步驟(1) 將納米金溶液與等體積的吐溫20緩沖液混合，離心，濃縮；(2) 將上述濃縮液加入到巰基化探針中，水浴過夜，所述濃縮液中納米金的濃度為 3.2mol/L，混合的巰基化探針的終濃度為100umol/L。；(3) 加入高濃度的NaCl溶液，水浴；(4) 離心，洗滌2-3次沉淀后，稀釋，得生物條形碼探針；(5) 將生物條形碼探針(終濃度10umol/L)、磁珠探針(0.1mg/ml)和靶序列DNA(lnmol/L) 混合、置于55'C水浴雜交20分鐘；(6) 磁分離器分離磁珠，去除未雜交的生物條形碼探針，并洗滌2-3次；(7) 加入洗脫液。混合后置于55'C水浴20分鐘。，用磁分離器去除磁珠，留上清液進行 熒光檢測。所述納米金顆粒大小為30nm，濃度為3.2fmol/L。所述步驟(1)中吐溫20緩沖液是由吐溫20和雙蒸水混合配置而成，吐溫20的終濃 度為1.5pl/mL， pH值為8.0。所述巰基化探針的巰基化DNA長度為25個堿基，巰基化DNA的5，端為巰基修飾，3， 端為FAM熒光修飾，同時DNA的3'端的部分序列和待檢的靶序列DNA互補。所述高濃度的NaCl溶液的鈉離子的終濃度為lmol/L。 所述步驟(3)、 (4)中的水浴是37'C 55。C的水浴。所述步驟(1)、 (4)中的離心速度均為12000rpm/min，離心時間分別為5分鐘和2分鐘。所述步驟(4)、 (6)洗滌用的洗滌液成分為0.01M磷酸氫鈉緩沖液，0.15MNaCl， 0.1% SDS， pH 7.4。
所述生物條形碼探針是由納米金和巰基化DNA構成。
所述磁珠探針由親和素磁珠與生物素修飾的寡核苷酸序列連接而成。磁珠直徑為 0.5-1跳
所述步驟(7)的洗脫液為濃度為1Omol/L的二硫蘇糖醇溶液。 本發明的有益效果
U)使用吐溫20 (1.5pl/mL)處理納米金溶液，能使所制備的述的生物條形碼探針穩定 性顯著提高，穩定存在于鈉離子濃度為1.0mol/L的溶液中，同時穩定存在于溫度為55'C的 條件下；
(2) 使用高鹽溶液(NaCI lmol/L)處理納米金-探針溶液，能使所制備的述的生物條形碼 探針特異性顯著提高，特異性為140: 1;
(3) 所制備的述的生物條形碼探針雜交速度快，檢測時間可以縮短75%。


圖1是不同NaCl濃度下的生物條形碼探針的熒光值； 圖2是不同NaCl濃度下的生物條形碼探針的信噪比； 圖3是不同溫度下的生物條形碼探針的熒光值； 圖4是不同溫度下的生物條形碼探針的信噪比；
圖5是不同雜交時間的生物條形碼探針的信噪比。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限
定的范圍。
實施例中的每個步驟過程參數請具體(參見EM^中所要求的具體數值、種類等)
實施例1生物條形碼探針的制備
(1) 取納米金溶液600ial，加入等體積吐溫20溶液，吐溫20的終濃度為1.5nl/ml，室溫 放置30分鐘；
(2) 離心(12000rpm/min) 5分鐘去除上清，使納米金溶液濃縮；(3) 將上述濃縮液加入到巰基化探針(IOD，終濃度100umol/L)中，并溶解，37'C反應 4小時；
(4) 加入NaCl，終濃度為0.1mol/L， 37。C水浴8小時；
(5) 繼續加入NaCl,終濃度為lmol/L, 37'C水浴8小時；
(6) 離心(12000rpm/min) 2分鐘，洗滌(0.01M磷酸氫鈉緩沖液，0.15MNaCl， 0.1% SDS， pH7.4) 2-3次沉淀；
(7) 用緩沖液(0.01M磷酸氫鈉緩沖液，0.15MNaCl， 0.1%SDS，pH7.4)懸浮沉淀，制 得生物條形碼探針，待用。
實施例2新型生物條形碼探針在高鹽溶液中的穩定性
(1) 將制備好生物條形碼探針10pl，磁珠探針(由親和素磁珠和生物素DNA連接而成) 10pl和待測DNA (lnM) lpl混合，在37。C下雜交，溶液的鈉離子濃度分別為0.01mol/L， 0.15mol/L， 0.5mol/L， 1.Omol/L， 1.5mol/L， 2.0mol/L， 2.5mol/L， 3.0mol/L;
(2) 將完成雜交的反應體系，用磁分離器迅速處理，并用洗滌液(0.01M磷酸氫鈉緩沖 液，0.15MNaCl,0.1°/。SDS,pH7.4)洗滌4 5次；
(3) 加入洗脫液(0.1mol/L二硫蘇糖醇)5^1，在6(TC下反應5 10分鐘；
(4) 用磁分離器處理，去除磁珠，上清液用于檢測；
(5) 檢測結果顯示，在整個反應過程中，當鈉離子濃度大于1.0mol/L時，生物條形碼探 針才會出現大量降解現象(圖l)，信噪比下降(圖2)。
實施例3新型生物條形碼探針在高溫下的穩定性
(1) 將制備好生物條形碼探針10^1，磁珠探針(由親和素磁珠和生物素DNA連接而成) 和待測DNA (lnM) 1^1混合，分別在30°C， 35°C， 40°C， 45°C， 50°C， 54°C， 55
°C， 56°C， 60°C， 65'C和70。C下雜交，溶液的鈉離子濃度分別為l.Omol/L;
(2) 將完成雜交的反應體系，用磁分離器迅速處理，并用洗滌液(0.01M磷酸氫鈉緩沖 液，0.15M NaCl, 0.1 % SDS, pH 7.4)洗滌4~5次；
(3) 加入洗脫液(0.1mol/L二硫蘇糖醇)5pl，在6(TC下反應5 10分鐘；
(4) 用磁分離器處理，去除磁珠，上清液用于檢測；
(5) 檢測結果顯示，在整個反應過程中，當鈉離子濃度大于溫度大于55'C時，生物條形 碼探針才會出現大量降解現象(圖3)。實施例4新型生物條形碼探針的特異性
(1) 將制備好生物條形碼探針l(Hil，磁珠探針(由親和素磁珠和生物素DNA連接而成) 10nl和待測DNA (lnM) 1^1混合，在55。C下雜交，溶液的鈉離子濃度為1.0mol/L;
(2) 將完成雜交的反應體系，用磁分離器迅速處理，并用洗滌液(0.01M磷酸氫鈉緩沖 液，0.15MNaCl， 0.1% SDS, pH 7.4)洗滌4~5次；
(3) 加入洗脫液(0.1mol/L二硫蘇糖醇)5pl，在6(TC下反應5 10分鐘；
(4) 用磁分離器處理，去除磁珠，上清液用于檢測；
(5) 檢測結果顯示，其檢測特異性達到140: 1 (圖4)。
實施例5新型生物條形碼探針的檢測時間
(1) 將制備好生物條形碼探針lOpl，磁珠探針(由親和素磁珠和生物素DNA連接而成) 10pl和待測DNA (lnM) l(al混合，混合液的鈉離子濃度分別為0.5 M、 1.0M、 1.5 M;
(2) 上述混合液均分別雜交5分鐘，IO分鐘，20分鐘，25分鐘，30分鐘，35分鐘和40 分鐘，雜交溫度為55'C;
(3) 將完成雜交的反應體系，用磁分離器迅速處理，并用洗滌液(0.01M磷酸氫鈉緩沖 液，0.15M NaCl， 0.1% SDS, pH 7.4)洗滌4~5次；
(4) 加入洗脫液(0.1mol/L二硫蘇糖醇)5pl，在60。C下反應5 10分鐘；
(5) 用磁分離器處理，去除磁珠，上清液用于檢測；
(6) 檢測結果顯示，20分鐘，新型的生物條形碼探針能完成雜交反應(圖5)。
權利要求
1.一種生物條形碼探針的制備方法，包括以下步驟(1)將納米金溶液與等體積的吐溫20緩沖液混合，離心，濃縮；(2)將上述濃縮液加入到巰基化探針中，水浴過夜；(3)加入高濃度的NaCl溶液，水浴；(4)離心，洗滌2-3次沉淀后，稀釋，得生物條形碼探針；(5)將終濃度10umol/L生物條形碼探針、終濃度0.1mg/ml磁珠探針和靶序列終濃度1nmol/L DNA混合、置于55℃水浴雜交20分鐘；(6)磁分離器分離磁珠，去除未雜交的生物條形碼探針，并洗滌2-3次；(7)加入洗脫液。混合后置于55℃水浴20分鐘。處理完成后，用磁分離器去除磁珠，留上清液進行熒光檢測。
2. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述納米金顆粒大 小為30nm，濃度為3.2fmol/L。
3. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中吐 溫20緩沖液是由吐溫20和雙蒸水混合配置而成，吐溫20的終濃度為1.5nl/mL， pH值為 8.0。
4. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述巰基化探針的巰基化DNA長度為25個堿基，巰基化DNA的5'端為巰基修飾，3'端為FAM熒光修飾， 同時DNA的3'端的部分序列和待檢的靶序列DNA互補。
5. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述濃縮液中納米 金的濃度為3.2mol/L，混合的巰基化探針的終濃度為100umol/L。
6. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述高濃度的NaCl 溶液的鈉離子的終濃度為lmol/L。
7. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述步驟(3)、 (4) 中的水浴是37°C~55°C的水浴。
8. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述步驟(1)、 (4) 中的離心速度均為12000rpm/min，離心時間分別為5分鐘和2分鐘。所述步驟(4)、 (6) 洗滌用的洗滌液成分為0.01M磷酸氫鈉緩沖液，0.15MNaCl,0.1%SDS，pH7.4。
9. 根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述磁珠探針由親和素磁珠與生物素修飾的寡核苷酸序列連接而成。
10.根據權利要求1所述的生物條形碼探針的制備方法，其特征在于所述步驟(7)的 洗脫液為濃度為10mol/L的二硫蘇糖醇溶液。
全文摘要
本發明涉及一種生物條形碼探針的制備方法，包括將納米金溶液與等體積的吐溫20緩沖液混合，離心，濃縮后加入到巰基化探針中，水浴過夜，加高濃度的NaCl溶液，水浴，離心，洗滌，稀釋，得生物條形碼探針，再將生物條形碼探針、磁珠探針和靶序列DNA混合、雜交，磁分離器分離磁珠，去除未雜交的生物條形碼探針，洗滌，加洗脫液，處理完成后，用磁分離器去除磁珠，留上清液進行熒光檢測。該制備方法制備簡單，所制備的生物條形碼探針更加穩定，檢測時間短，檢測特異性大大提高。
文檔編號C12Q1/68GK101241126SQ20081003467
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月14日 優先權日2008年3月14日
發明者周宇荀, 朱旺升, 肖君華, 范忠鵬, 賀明星 申請人:東華大學