專利名稱:實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置及方法
技術領域:
本發明涉及一種生物工程技術領域的裝置及方法,具體是一種實驗室貼壁細 胞薄膜培養裝置及方法。
技術背景實驗室常規貼壁細胞培養傳代方法,大致如下,以65mm平皿接種Vero細胞 系為例,將接種的少量細胞懸液加入約2ml的培養液,輕輕搖勻后置于37'C的C02 培養箱中培養,當細胞生長達到一定密度時進行細胞傳代。細胞傳代時首先吸棄 培養基,用l-2ml的PBS沖洗2遍,加入胰酶或膠原酶lml,置于培養箱中溫孵 5-10min后加入含血清的培養基終止消化,輕輕反復吹打,直至平板上的細胞完全 脫落,平板底部變得光滑透亮,用移液管吸取細胞懸液按比例分置在下一代平皿 中,加入一定量的培養基輕輕平搖混勻,重復以上操作。從以上步驟可以看出,對于嚴格要求染菌幾率低、下一代平行培養以及批量 傳代的實驗來說,仍然存在諸多弊端(1)對細胞消化過程中吹打操作有一定技 術要求,容易造成后期的實驗誤差不易預計。(2)對平皿不同位置的吹打效率不 一樣,造成的傳代結果與細胞當初接種時未均勻平鋪開造成的差異相關,并可能 因隨機吹打的重點不一,使得細胞不能均勻脫落。(3)由于貼壁不良的細胞最先 被吹打下來,而越先吹打下來的細胞被用來撞擊其他細胞的頻率越高,受到的損 傷和后期死亡率也越高,相應通過槍口更加容易,被保留傳代的幾率也越高,通 過時間積累效應,選擇下來的是非均一,損傷率高、貼壁不良的細胞。(4)當存 在較大濃度差時,細胞擴散更容易進行,而反復吹打一般是采用高濃度的細胞懸 液,對細胞的傷害較大,如果每吹打一次后就轉移懸液,然后吸取新鮮培養基, 則成本增加了許多倍,要耗費多倍的無菌移液管,并且染菌的機會和污染純凈培 養基的機會倍增。(5)操作雖然在無菌超凈臺中進行,但傳統吹打傳代的方式造 成細胞暴露的時間較長,尤其是貼壁良好的細胞,有時每平方厘米需要十次左右的吹打才能沖洗到平皿平滑潔凈、細胞完全脫落的效果,因此需要有效的方法減 少細胞的暴露,增加培養傳代過程的安全性。(6)后代細胞如要準確定量,需獲 得平行一代的最真實準確細胞密度。目前缺少環節最少且最直接的計量方法。(7) 如是玻璃平皿,清洗工作稍有難度。因此,利用薄膜代替平板作為細胞接觸面, 將可能克服目前細胞培養及傳代過程的上述弊端。經對現有技術文獻的檢索發現,張宇等人在《中國組織工程研究與臨床康復》 雜志2007- 05- 06發表的《殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜的制備及其與肌成纖 維細胞的相容性》有相關提及,但并沒有系統地將薄膜培養提出作為實驗室一種 新的適合常用的細胞培養裝置或方法,另外如《湖南醫科大學學報》中趙迪誠等 人的《S印aration of adhering cell colonies with a direct digestion method》 一文中,將細胞接種在血纖維蛋白膜上,這種思想及其益處(便于直接消化有效 獲得單細胞克隆)與本發明十分吻合,但材料不利于普及和生產,不能作為一種 常規的新型裝置被應用于實驗室。發明內容本發明針對現有技術的不足,提供一種實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置及方法, 使細胞傳代分取過程不但難度減少、操作安全方便、染菌機會降低,并使得平板 培養的可變性、適應性大大提高。本發明是通過以下技術方案實現的本發明所涉及的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,包括平皿、有機聚合物薄膜 層、粘附液層。有機聚合物薄膜層通過粘附液層貼在平皿內底面。所述有機聚合物薄膜層可根據需要選用聚酯類、聚氨基酸類(如聚天冬氨酸、 聚氨酯)、殼聚糖與纖維素聚合物、離子聚合物等材料。所述粘附液層,可根據薄膜材料選用甘油、丙二醇、含明膠的PBS緩沖液等。 本發明所涉及的實驗室貼壁細胞薄膜培養方法,本發明利用多種可適應性的 有機聚合物薄膜,在粘附液的作用下貼在平皿內底面,在培養時供細胞附著并在 需要的條件下整合適應生長環境變化的抑制因素;在消化傳代時直接投入到準確 定量的培養液中,在封閉條件下利用人手或者高速搖床的力量洗脫細胞,然后直 接從大瓶細胞懸液中取樣計數并直接分裝接種,所計數目即是所有下代平皿接種細胞密度,無需稀釋。本發明包括以下步驟第一步,按照指定平皿規格,制備并剪取或購買已生產的有機聚合物薄膜, 用一滴粘附液滴在平皿底面,輕晃均勻,貼上有機聚合物薄膜,并可用無菌三角 玻棒輕輕涂勻,保證緊密貼合無氣泡。第二步,按照傳統方法接種培養。第三步,傳代時用胰酶或膠原酶消化,消化完畢后加少量血清中止并吸去(或 直接省略加入血清步驟),將有機聚合物薄膜用無菌鑷子撕起,快速投入到己準確 定容的培養液瓶中,蓋上瓶蓋,充分搖蕩或移至搖床高速搖蕩10分鐘左右,至細 胞基本完全脫落形成懸液,用移液管定量分取至下一代平皿,按照第一步循環進 行。本發明充分利用薄膜的一次性,改進了傳統平皿培養支持物結構不可變動的 缺點,使得培養更具動態性,同時降低了成本。本發明用于準確定容且獲得密度 均一的細胞懸液,便于平行比較同一代傳代產物的差異,而不是單純的不計量傳 代。本發明通過物理方法使得消化后細胞脫落時完全在無菌密封環境中,染菌機會大大降低,而貼壁表面受力均勻,所脫落下來的細胞相對完整,代表性強。
圖1為本發明裝置的結構示意中1為平皿、2為有機聚合物薄膜層、3為粘附液層。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施,給出了詳細的實施方式和具體的操作過程,但本發明的保護 范圍不限于下述的實施例。如圖1所示,本實施例所涉及的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,包括平皿l、有機聚合物薄膜層2、粘附液層3。有機聚合物薄膜層2在粘附液層3的作用下貼 在平皿1內底面。所述平皿1為普通規格培養皿,可以是玻璃或塑料的。所述有機聚合物薄膜層2可根據需要選用聚酯類、聚氨基酸類PGAc、 PU、殼聚糖與纖維素聚合物、離子聚合物等材料。所述粘附液層3,可根據薄膜材料選用甘油、丙二醇、PBS明膠等。 基于傳統貼壁細胞傳代時消化吹打困難、定容不便、染菌率高的缺點,本實 施例的裝置利用高分子聚合材料薄膜,加以粘附液潤濕后貼在培養皿底面作為貼 壁細胞附著面,便于傳代時快速分離細胞,并快速投入定容培養液中用搖蕩的方 法脫落細胞,直接以此計數和傳代,準確分量保證了下一代平行的初始接種條件, 較原始傳代方法操作更加簡易,染菌機會更少。配合不同需要貼附不同高分子薄 膜,能起到更高效的消化效率或貼壁培養的存活率。本實施例所涉及的實驗室貼壁細胞薄膜培養方法以培養Vero細胞為例(1) 將符合平皿規格的相應透明薄膜置于無菌環境中備用,如果是自行剪取, 則在無菌操作臺上浸泡75%乙醇1分鐘,取出于熱源附近等待酒精自然揮發干燥, 注意有機材料不可升溫,避免產生毒性。(2) 滴加粘附液1-2滴。粘附液的作用一方面是保持薄膜與底面的緊密貼合, 排除氣泡;另一方面是消化末期方便分離,可快速輕易的撕脫。粘附液要求相對 培養基為惰性,或者是培養集中固有的非限制性成分;最好是油性。(3) 用無菌鑷子夾置透明薄膜帖附在平皿內底面,由一側慢慢放下,注意趕 走氣泡,也可用無菌三角玻棒輕輕推平趕走氣泡。(4) 加樣接種,按照傳統方法吸取接種懸液滴加在透明薄膜上,加入適量的 培養液,輕輕晃勻,蓋上平皿上蓋,置于37'C的C02培養箱中培養。(5) 傳代時,將已備好的準確體積的培養基(如500ml)置于無菌廣口瓶中。 吸棄細胞培養平皿中的上清液,加入含EDTA的0. 25%胰酶或膠原酶,置于培養箱 中消化5-10分鐘。(6) 鏡下觀察,細胞變圓、少量脫離薄膜底面,可停止消化,(可加入少量 含血清培養基,也可不加),直接用無菌鑷子將薄膜夾起,投入到培養基廣口瓶中, 蓋上瓶蓋,快速振搖,或放置在高速搖床上,可選擇旋轉往復式300-500rpm或直 線往復式500-600rpm,或者復合使用,大約10min-15min,細胞可脫離薄膜。由 于本方法培養基體積較多,而直接撕起的薄膜附著的細胞培養液體積《0.5ml,因 此培養基體積和濃度沒有發生變化。此外,由于培養基中已含有大量的血清,可以足夠終止薄膜表面附著的少量胰酶并認為新的細胞懸液中己不含胰酶。(7) 按常規方法,從廣口瓶中取5u 1細胞懸液并滴加1臺盼藍染液利用 血球計數器計數。(8) 第(7)步所計數即為初始細胞接種濃度,用移液管準確吸取3-5ml細 胞懸液,分置于下一代各個平皿中進行培養.下一代平皿的薄膜帖附具體方法同(1) (2) (3)步。本實施例的方法克服了傳統方法的諸多不利,使操作更加簡便,易產生誤差 的環節減少,系統誤差降低,后代初始條件相對平行,量取準確,最關鍵是貼壁 細胞的脫離均勻,損傷減少,并由于暴露時間縮短,降低為原來的十分之一左右, 故而染菌機會大大減少。另外,在該系統方法上,密不可分的一部分是針對不同 的實驗要求,充分利用有機薄膜的一次性和可變性,設計或使用不同的薄膜墊片。
權利要求
1.一種實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,其特征在于,包括平皿、有機聚合物薄膜層、粘附液層,有機聚合物薄膜層通過粘附液層貼在平皿內底面,所述有機聚合物薄膜層,其材料選用聚酯類、聚氨基酸類、殼聚糖與纖維素聚合物、離子聚合物中的一種。
2. 根據權利要求1所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,其特征是,所述粘 附液層,其材料選用選用甘油、丙二醇、含明膠的PBS緩沖液中的一種。
3. 根據權利要求1所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,其特征是,所述聚 氨基酸類為聚天冬氨酸,或聚氨酯。
4. 一種實驗室貼壁細胞薄膜培養方法,其特征在于,利用有機聚合物薄膜, 在粘附液的作用下貼在平皿內底面,在培養時供細胞附著并在整合適應生長環境 變化的抑制因素,在消化傳代時直接投入到培養液中,在封閉條件下洗脫細胞, 然后直接從大瓶細胞懸液中取樣計數并直接分裝接種,所計數目即是所有下代平 皿接種細胞密度。
5. 根據權利要求4所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養方法,其特征是,包括以 下步驟第一步,按照指定平皿規格,制備并剪取或購買已生產的有機聚合物薄膜, 用一滴粘附液滴在平皿底面,輕晃均勻,貼上有機聚合物薄膜; 第二步,接種培養;第三步,傳代時用胰酶或膠原酶消化,消化完畢后,將有機聚合物薄膜用無 菌鑷子撕起,快速投入到已準確定容的培養液瓶中,蓋上瓶蓋,充分搖蕩或移至 搖床高速搖蕩IO分鐘,至細胞基本完全脫落形成懸液,用移液管定量分取至下一 代平皿,按照第一步循環進行。
6. 根據權利要求5所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養方法,其特征是,第一步 中,貼上有機聚合物薄膜之后,用無菌三角玻棒輕輕涂勻,保證緊密貼合無氣泡。
7. 根據權利要求4或5或6所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,其特征是, 所述有機聚合物薄膜,其材料選用聚酯類、聚氨基酸類、殼聚糖與纖維素聚合物、離子聚合物中的一種。
8. 根據權利要求4或5所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,其特征是,所 述粘附液,選用甘油、丙二醇、含明膠的PBS緩沖液中的一種。
9. 根據權利要求5所述的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置,其特征是,第三步 后,消化完畢后加少量血清中止并吸去,然后將有機聚合物薄膜用無菌鑷子撕起。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程技術領域的實驗室貼壁細胞薄膜培養裝置及方法,所述裝置包括平皿、有機聚合物薄膜層、粘附液層。有機聚合物薄膜層通過粘附液層貼在平皿內底面。利用高分子聚合材料薄膜,加以粘附液潤濕后貼在培養皿底面作為貼壁細胞附著面,便于傳代時快速分離細胞,并快速投入定容培養液中用搖蕩的方法脫落細胞,直接以此計數和傳代,準確分量保證了下一代平行的初始接種條件,較原始傳代方法操作更加簡易,染菌機會更少。配合不同需要貼附不同高分子薄膜,能起到更高效的消化效率或貼壁培養的存活率。
文檔編號C12N5/00GK101245315SQ20081003453
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月13日 優先權日2008年3月13日
發明者孫海英, 柳 楊, 胡詩宇, 齊念民 申請人:上海交通大學