細莖雙蝴蝶的組織培養方法

專利名稱：細莖雙蝴蝶的組織培養方法
技術領域：
本發明是細莖雙蝴蝶的組織培養方法，涉及這種藥用植物的有效快速 繁殖，開發利用。 技術背景對雙蝴蝶屬植物的研究，文獻很少，國內主要是分類、發育方面的文章，國外和我國臺灣省對該屬植物的5個種進行了植物化學成分和藥物功 能活性成分方面的研究。細莖雙蝴蝶植物，種子細小，休眠期長，發芽率 極低，申請者經過三年實驗，發現該植物種子繁殖時，其實生苗有一個沒 有實效的幼年期，發芽后6個月完成不了二葉期，故不僅發芽率極低，發 芽后成苗率也極低，所以種子繁殖難度很大。 發明內容本發明需解決的技術問題是針對細莖雙蝴蝶植物發芽率低、發芽后 成苗率低、種子繁殖難度大的問題，而建立一種高效的細莖雙蝴蝶的組培 方法。本發明的目的是這樣實現的第一步，無菌苗獲得和培養取一年生植株的根莖(靠近地面10公分 的地上莖， 一般從酸性紅壤土的茶林或油茶與馬尾松、油桐、杉樹的混交 林下釆集細莖雙蝴蝶無病蟲害的莖作為外植體。因為靠近地面的根莖比根 莖上面的纏繞莖的生理年齡更年輕，生理年齡越年輕的外植體，其側芽在 芽誘導分化培養基上萌發出新芽的時間越早、出芽率越高，細莖雙蝴蝶基 本不形成愈傷組織，都是由休眠側芽萌發出芽。)去除葉片和葉柄，剪成6cm長的莖段，先用自來水洗凈后用飽和洗衣粉溶液漂洗l-5分鐘，再用自 來水流水沖洗1-2小時，然后用蒸餾水沖洗1-2次以后在無菌室內于超凈 工作臺上，用75。/。的酒精浸30s，并不斷地搖動，以便充分殺菌。倒掉酒精， 加入0. 1%的升汞溶液和一滴吐溫80浸泡8-10分鐘，以進一步消毒。倒掉 升汞溶液后，再用無菌水沖洗6次，置于無菌培養皿中干燥的無菌濾紙上， 吸干表面水分。用利刀切成長1.5cm左右，每段有一個節的帶芽莖段，以 下端插入培養基中，節和腋芽露在培養基外，接種于培養基上。暗培養5 天后轉入光照培養。6天后，萌發培養基上外植體陸續萌動，長出嫩芽。第二步增殖培養接種后30-35d，芽長l-2cm時，選健康無雜菌感染 的芽連同外植體一起移入增殖培養基上進行繁芽培養。接種40天后，苗高 5cm左右，具3-4個節，繁殖系數5. 1，以后每30_35d更換一次培養基。第三步生根培養當不定芽長到2-3cm，具3-4片葉時，將其切下， 轉接入生根培養基上，進行根的誘導，培養30天左右，開始長出不定根。第四步煉苗移栽當試管苗株高4cm左右，根長2-3cm時，選擇生 長健壯，根系發達的植株進行煉苗移栽。先將幼苗移出組培室，置于蔭蔽 度(與日光下相比)7(Fc)左右的溫室內閉瓶煉苗3d，進行光照適應性鍛煉， (經對該種植物原產地環境生態限制因子的研究，發現該植物喜分布于下 午背光一面的山坡的油茶林下。經照度計和干濕計測定，在蔭蔽度70%左右， 云障霧罩的灣糟環境中生長良好，莖長可達一米以上，單株莖葉重達0. 25kg 左右。)再將培養瓶蓋打開一半，半開瓶煉苗1天，再開瓶煉苗一天。然后將苗取出，洗凈根部培養基，移栽于裝有珍珠巖紅壤土河砂比例為1: 2: 1基質的塑料小花缽中，(其基質應為0. 1%高錳酸鉀溶液或0. 1%菌絕殺處理24小時)，經噴霧(每100kg水+少量MS培養液+1支鏈霉素)洗凈葉面和莖表面，待葉片表面無積水后，用透明塑料袋封好缽口，從第二天起， 每天在封口塑料袋上刺一個筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，進入正常生 長，移栽成活率95%以上。移栽至與原產地環境相似的油茶權木林下， 一年纏繞莖長達50cm以上，兩年內可開花結果，收獲其植物體入藥。 其中上述培養條件，培養基均由L9(34)正交試驗、方差分析選出。① 萌發培養基MS+ZT 1. Omg. L-1② 增殖培養基MS+6BA 1.8mg. L-1③ 生根培養基1/2MS+IBA 0.8m. L-1以上培養基均添加3%蔗糖，1.1%卡拉膠，ra5.8，培養溫度25士rc，自控日光燈光源，光強2000LX，光照時間14h. cT ，增殖時每30d更換一次培養基。 采用上述方法，具有下列優點1. 芽誘分化培養基采用ZTmg/L (玉米素)作為生長刺激素代替 6-BA1. 5mg/L誘導休眠芽萌發成新芽的誘導率從15%提高到47%.2. 明確肯定不用纏繞莖作外植體，而用近地面10公分的粗壯根莖作為 外植體，這樣外植體不僅生理年齡年輕，而且營養豐富，使萌芽的時間提 早1天以上，芽也粗壯，這也是繁殖系數提高的原因，根的條數增加0.4 條/株。3. 增殖培養基中，6-BA份數由1. 5mg/L增加到1. 8mg/L，是繁殖系數提 高的又一原因，每兩個月可增殖4.6個芽。4. 在煉苗移栽時①先在溫室內進行三天光照適應性鍛煉②培養瓶蓋 分兩天，兩步打開，后種入花缽后選用透明塑料薄膜袋封口保濕，防止自 身抗生素物質的揮發，逐漸刺穿封口袋膜，使之受到濕度適應性鍛煉，增 加抗菌能力。③用高錳酸鉀和菌絕殺徹底處理基質中的病菌，移栽后用鏈霉素稀溶液噴霧一次后封上透明薄膜，使組培苗煉苗時由于莖的皮層發達， 膠狀物質多，易于感染病菌導致死亡率高的突出矛盾得到較好解決，也使 該植物因產于高寒山區林下草叢中，空氣濕度大，莖運輸水分能力差，適 應干燥空氣能力差的矛盾得以解決。④將基質配方中的腐殖土改為原產地3.5-5.5的紅壤土，使土壤中腐敗微生物減少，生境更接近原產地條件，加 上在基質中加適量MS營養液，故使移栽成活率提高了 6%，達到95%以上。 5.用成年材料作外植體經組培——營養繁殖產生的植株，不存在沒有實 效的幼年期。克服了該種植物種子繁難度大，制約該種藥用植物廣泛開發 利用的巨大矛盾。
具體實施方式
下面結合實例對本發明作進一步說明 第一步獲取無菌苗取一年生植株的根莖，去除葉片和葉柄，剪成 6cm長的莖段，先用自來水洗凈后用飽和洗衣粉溶液漂洗5分鐘，再用自來 水流水沖洗兩小時，然后用蒸餾水沖洗2次以后在無菌室內于超凈工作臺上，用75。/。的酒精浸泡30s ，并不斷地搖動，以便充分殺菌。倒掉酒精，加 入O. 1%的升汞溶液和一滴吐溫一80浸泡10分鐘，以進一步消毒。倒掉升 汞溶液后，再用無菌水沖洗6次，置于無菌培養皿中干燥的無菌濾紙上， 吸干表面水分。用利刀切成長1.5cm左右，每段有一個節的帶芽莖段，以 下端插入培養基中，節和腋芽露在培養基外，接種于培養基上。暗培養5 天后轉入光照培養。6天后，萌發培養基上外植體陸續萌動，長出嫩芽。第二步增殖培養接種后30d，芽長2cm時，選健康無雜菌感染的芽 連同外植體一起移入增殖培養基上進行繁芽培養。接種40天后，苗高5cm 左右，具3-4個節，繁殖系數5. 1，以后每35d更換一次培養基。第三步生根培養當不定芽長到2cm，具3-4片葉時，將其切下，轉 接入生根培養基上，進行根的誘導，培養30天，開始長出不定根。第四步煉苗移栽當試管苗株高4cm左右，根長3cm時，選擇生長 健壯，根系發達的植株進行煉苗移栽。先將幼苗移出組培室，置于蔭蔽度 (與日光下相比)70%左右的溫室內閉瓶進行光照適應性鍛煉3(1，再將培養 瓶蓋打開一半，半開瓶煉苗l天，再開瓶煉苗一天。然后將苗取出，洗凈根部培養基，移栽于裝有珍珠巖紅壤土河砂比例為l: 2: 1基質的塑料小花缽中，(其基質應為0. 1%高錳酸鉀溶液或0. 1%菌絕殺處理24小時)， 經噴霧(每100kg水+少量MS培養液+l支鏈霉素)洗凈葉面和莖表面，待 葉片表面無積水后，用透明塑料袋封好缽口，從第二天起，每天在封口塑 料袋上刺一個筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，進入正常生長。然后，移 栽至與原產地環境相似的油茶權木林下。其中上述培養條件，培養基均由L9(34)正交試驗、方差分析選出。① 萌發培養基MS+ZT l.Omg.L-'② 增殖培養基MS+6BA 1.8mg. L-1③ 生根培養基1/2MS+IBA 0.8m. L-1以上培養基均添加3%蔗糖，1.1%卡拉膠，PH5.8，培養溫度25。C，自控 日光燈光源，光強2000LX，光照時間14h. d—"，增殖時每30d更換一次培養 基。
權利要求
1.細莖雙蝴蝶的組織培養方法，其特征在于采用下述步驟第一步，無菌苗獲得和培養取一年生植株的根莖，去除葉片和葉柄，剪成6cm長的莖段，先用自來水洗凈后用飽和洗衣粉溶液漂洗1-5分鐘，再用自來水流水沖洗1-2小時，然后用蒸餾水沖洗1-2次以后在無菌室內于超凈工作臺上，用75％的酒精浸20-30s，并不斷地搖動，以便充分殺菌；倒掉酒精，加入0.1％的升汞溶液和一滴吐溫80浸泡8-10分鐘，以進一步消毒，倒掉升汞溶液后，再用無菌水沖洗3-6次，置于無菌培養皿中干燥的無菌濾紙上，吸干表面水分，用利刀切成長1.5cm左右，每段有一個節的帶芽莖段，以下端插入萌發培養基中，節和腋芽露在萌發培養基外，接種于萌發培養基上，暗培養5天后轉入光照培養，6天后萌發培養基上外植體陸續萌動，長出嫩芽；第二步增殖培養接種后30-35d，芽長1-2cm時，選健康無雜菌感染的芽連同外植體一起移入增殖培養基上進行繁芽培養；接種40天后，苗高5cm左右，具3-4個節，繁殖系數5.1，以后每30-35d更換一次培養基；第三步生根培養當不定芽長到2-3cm，具3-4片葉時，將其切下，轉接入生根培養基上，進行根的誘導，培養30天；第四步煉苗移栽當試管苗株高4cm左右，根長2-3cm時，選擇生長健壯，根系發達的植株進行煉苗移栽，先將幼苗移出組培室，置于與日光下相比蔭蔽度為70％的溫室內閉瓶煉苗3d，進行光照適應性鍛煉，再將培養瓶蓋打開一半，半開瓶煉苗1天，再開瓶煉苗一天，然后將苗取出，洗凈根部培養基，移栽于裝有珍珠巖紅壤土河砂比例為1∶2∶1的基質的塑料小花缽中，其基質應為0.1％高錳酸鉀溶液或0.1％菌絕殺處理24小時，經每100kg水+少量MS培養液+1支鏈霉素噴霧洗凈葉面和莖表面，待葉片表面無積水后，用透明塑料袋封好缽口，從第二天起，每天在封口塑料袋上刺一個筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，進入正常生長，移栽至與原產地環境相似的油茶權木林下。
2.根據權利要求1所述的細莖雙蝴蝶的組織培養方法，其特征是上述培 養基均由L9(34)正交試驗、方差分析選出，其中① 萌發培養基:MS+ZT l.Omg丄-1② 增殖培養基MS+6BA 1.8mg. L-1③ 生根培養基1/2MS+IBA 0.8m. L」以上培養基均添加3%蔗糖，1. 1%卡拉膠，PH5.8，培養溫度25士rC，自控日 光燈光源，光強2000LX，光照時間14h. d—^ ，增殖時每30d更換一次培養基。
全文摘要
本發明是細莖雙蝴蝶的組織培養方法，是一種用于雙蝴蝶屬植物組織培養方法，涉及一種植物培養方法。該方法包括無菌苗獲得和培養，增殖培養，生根培養，煉苗移栽等四個步驟。其中，上述培養條件，培養基均由L9(3⁴)正交試驗、方差分析選出。①萌發培養基MS+ZT 1.0mg.L-¹；②增殖培養基MS+6BA 1.8mg.L-¹；③生根培養基1/2MS+IBA 0.8m.L-¹以上培養基均添加3％蔗糖，1.1％卡拉膠，pH5.8，培養溫度25±1℃，自控日光燈光源，光強2000LX，光照時間14h.d^-1，增殖時每30d更換一次培養基。該方法可以提高新芽的誘導率，繁殖系數和移栽成活率，克服了該種藥用植物種子繁難度大的問題。
文檔編號C12N5/04GK101248758SQ200810030759
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月7日 優先權日2008年3月7日
發明者李國民, 田宏現 申請人:吉首大學