專利名稱：一種共表達人源谷氨酸脫羧酶和細胞因子的重組病毒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種共表達谷氨酸脫羧酶和細胞因子的重組病毒、尤其是 重組腺相關病毒的構建及其制備方法，其所在的技術領域與生命^f學和生 物醫藥技術有關。
背景技術：
研究證明哺乳類腦紋狀體及紋狀體投射區域的大多數神經元的神經
遞質為Y-氨基丁酸(GABA,下同)，GABA為哺乳類腦組織的主要抑制性神 經遞質，而谷氨酸脫羧酶(GAD，下同)是合成GABA限速酶，GAD有GAD 65 和GAD 67兩種同功酶(Undefors M et a I : Prog. Neuropsycho, Pharmacol, Biol Psychiatrv. 1993; 17(6) :887-903)。有研究人員應用表達GAD65基 因的腺相關病毒(AAV，下同)對動物模型帕金森氏病進行治療性研究，結 果顯示帕金森氏癥狀有明顯改善，電生理研究也證明增加GAD65在下丘核 神經元的表達，可使下丘核神經元從興奮性輸出狀態改變為抑制性輸出狀 態(Lee B, et al: Gene Ther. 2005 Aug; 12(15): 1215-22: Emborg ME, et al:
J Cereb Blood Flow Metab. 2007 Mar:27(3) : 501-9.)，這些研究為GAD治療人帕金 森氏病打下了堅實的基礎。
新近報導,經批準,美國在12名晚期帕金森氏病患者應用表達GAD65 基因的MV對帕金森氏病進行了臨床I期研究，結果表明帕金森氏癥狀有 顯著改善，耐受良好、安全、有效(KaplittMG, etal: Lancet. 2007 Jun 23 ;369(9579) :2056-8)。國內研究人員應用對人體無致病性的泡疹病毒作為表込載體在星狀細胞進行表達GAD研究，但尚未在動物或人體對帕金森 氏病進行治療研究(Liu W, et al: Intervirology. 2005 S印-0ct;48(5):329-35; Liu W et al: Mol Ther. 2007)。
此外，已經研究證明GABA合成酶GAD與驚厥、癲癇和小腦性共濟失 調癥的發生有關。缺失GAD65的小鼠發生自發性癲癇，回交產生的GAD65 缺失的小鼠癲癇發作易感性顯著增加(I^1^E， etal: Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Dec 9; 94 (25): 14060-5));而在癲癇動物模型腦相關部位移 植表達GABA合成酶GAD的細胞可減少或阻斷癲癇的發生(Ger證t M, et al: Exp Neurol. 2002 Jul; 176(1): 183-92; Ldscher W， et al: J Ne訓sci Res. 1998 Jan 15;51 (2) :196-209; Vulliemoz S, et al: J Neurol Neurosurg Psychiatry)c
毫無疑問，上述臨床研究證實了 GAD作為哺乳類腦神經細胞的主要 抑制性神經遞質GABA的合成限速酶用于治療帕金森氏病是安全、有效的。 不過，顯然，這種治療是一種改善帕金森氏病癥狀性的冶療，并不能改變 帕金森氏的病理進程以及由此產生的其他臨床癥狀。
許多研究證明帕金森氏病的發生主要是各種原因，括遺傳因素、環境 因素、體內代謝產物自由基和腦血腦因素等引起紋狀體及其相關投射區域 神經核多巴胺神經元發生細胞凋亡所致，導致多巴胺合成，生產和分泌減 少而引發帕金森氏病。因此，減緩或防止多巴胺神經元細胞凋亡是冶療帕 金森氏病的極其重要環節。
目前己知，神經細胞營養因子GDNF對減緩或防止多巴胺神經元細胞 凋亡有較好作用。GDNF是大腦神經膠質細胞產生的，具有非常重要的、廣泛的生物功能神經細胞因子，對中樞和外周的多種神經細胞具有較為廣泛 的神經營養作用，是目前發現的對多巴胺神經兀和運動神經元作用最為顯 著的一類神經營養因子，有較廣泛的促進神經元生長和分化的作用，尤其
對多巴胺神經元作用最強(Lin LT et al. Science 1993. 260(5111): 1130—2; Henderson et al. Science 1994， 266(5183): 1062—4)。 GDNF 通過磷酸化作用活化在細胞存活中起關健作用的蛋白激酶Akt/PKB，促進 神經細胞的增殖與分化，抑制神經細胞的凋亡，保護多巴胺神經細胞，能 保護多巴胺神經細胞對抗有害因子，如過氧化物，自由基，缺血、缺氧造 成的損害；增強多巴胺神經細胞攝取多巴胺的能力，增加多巴胺的IT:存、 釋放；促進祌經系統再生有著重要的作用。
國內外對神經營養因子GDNF的功能進行了廣泛的研究，證明GDNF通 過PI3K/Akt通路介導，明顯緩和6-羥基多巴胺(6-0HDA)誘發的染色質濃 縮和DNA斷裂；啟動一系列抗凋亡信號途徑而保護神經元，GDNF被認為 是有希望的神經保護治療藥物(DoThi NA, SaillourP， Ferrero L， Dedieu JF， Mallet J， Paimio T . Gene Ther. 2004 Jan 15; Patel NK et al， Ann Neurol. 2005 Feb;57(2):298-302)。
在人體帕金森氏病的治療研究表明，直接將GDNF輸入到帕金森氏病患
者腦豆狀核，可顯著改善患者癥狀， 一年后且無嚴重臨床副作用；18個月 后正電子掃描顯示患者豆狀核多巴胺貯存、攝取增加28%，表明GDNF對多 巴胺神經元有直接作用(Heywood P. et al: Nat Med. 2003 May;9(5) :589-95. Epub 2003Mar 31: Slevin JT, et al: JNe,surg. 2005 Feb; 102(2) :401.; Slevin JT， et al: Neurosurg Focus. 2006 May 15;20(5):E1)。GDNF家族的另一成員Neurturin (NTN)和中腦星狀細胞源性神經營養 因子MANF被證明對多巴胺神經元有特異神經再生功能(Petrova P et al: I Mol Ne訓sc丄2003 Apr; 20 (2): 173-88: Liu WG et al: Mol Neurodegener. 2007 Oct 1:2(1):19)。而新近發現的保守多巴胺神經營養因子CDNG (conserved dopamine neurotrophic factor、 CDNF)具有和GDNF相似的恢 復和防止多巴胺神經元退化的作用(Lindholm P, et al: Nature. 2007 Jul 5:448(7149) :73-7)。
有意義的是，最近的研究表明在癲癇模型動物采用GDNF的基因冶療能 有效抑制或減少癲癇發生(Kanter-Schlifke I, et al: Mol Ther. 2007 Jun; 15(6) :1106-13)。
同樣，另一種人腦細胞源性神經營養因子(BDNF，下同)，是由腦細胞 產生、分泌的一種有著重要生物功能的神經細胞營養因子。BDNF對中 樞和外周的多種神經細胞具有較為廣泛的神經營養作用，能促進某些神 經群的生存和分化，調控神經突軸的軔力，并與海馬的學習、記憶以及脊 髓疼痛機制有關。
BDNF對多巴胺神經元的生存和生長亦有重要作用。它具有阻止凋亡細 胞的死亡，增加酪氨酸水解酶陽性神經元的生存和此神經元纖維的生長 (Oster,rd K, et al: Exp Neurol. 19% Dec; 142(2) :340-50; Tang FI， et al: Exp Brain Res. 1998 Apr; 119(3) :287—96; Singh S， et al: Indian .T E叩Biol. 2006 S印；44(9) :699-704;胡旭東等.神經解剖學雜志， 1998年02期)。因此，BDNF作為一種強效神經保護因子，被認為是治療 某些中樞神經系統疾病的一個好的候選因子(E^15, et al: Expert OpinTher Targets. 2004 Oct;8(5):391-9)。
相關的研究也證明轉錄因子Nurrl能使胚胎干細胞分化成能分泌多巴 胺的多巴胺神經元，并通過對BDNF表達的直接調控，影響中腦多巴胺神經
的發育和功能(Volpicelli F, 2007 Jul :102 (2) :441-53; Hara K, JNei,ciRes. 2007 May 1:85(6) : 1240-51; Park CH, FASEB .T. 2006 Dee:20(14):2553-5; Sakurada K. Development. 1999 S印;126(18) :4017-26)。而轉錄因子Pitx3因其能調節酪氨酸水解酶(TH， 下同)的表達，對中腦多巴胺神經元的發育和功能至關重要；Pitx3缺失 鼠的黑質有早期多巴胺神經元發育障礙、選擇性丟失多巴胺神經元(Simon 匪，et al: Ann N Y Acad Sci. 2003 Jun;991:36-47; Smidt MP, et al: Cell Tissue Res, 2004 Oct;318(1) :35-43; Hwang DY, et al: Brain Res Mol Brain Res. 2003 Jun 10; 114(2): 123-31; Smidt MP, et al: Development. 2004 Mar;131(5) :1145-55; Maxwell SL， et al: Dev Biol. 2005 Jun 15:282(2) :467—79; Messmer K, et al: Int J Dev Neurosci. 2007 Feb;25(1) :29-37)。新近的研究表明Pitx3有卜.調神經營養閔子BDNF和 GDNF表達的功能(Ch油ggeng Peng, et al: FEBS Letters, 2007， 581(7): 1357-1361),認為Pitx3可能是治療帕金森氏病的一個好的耙基因。
近來，有研究證明應用轉基因神經千細胞的方法，將與多巴胺合成的 相關基因，如酪氨酸水解酶(TH)基因或GTP環水解酶基因導入帕金森氏病 動物模型鼠腦組織中，能顯著增加多巴胺的合成，并改善帕金森氏病的癥
狀(R， MY, Cell Transplant. 2005; 14(4) : 193—202)。
此外，研究發現氧化物應力是帕金森氏病多巴胺神經細胞死亡的一個 重要介體，銅/鋅過氧歧化酶(S0Dl，下同)作為一種關健酶，在抗氧化物應 力中起著十分重要的作用。研究證明，與正常人比較，帕金森氏病人腦黑質S0D1明顯減少；細胞和動物實驗表明腺病毒介導的S0D1有很強的神經 保護作用，可有效防止methyl-4-phenylpyridiniumion(MPP,下同)和 1-methyl-4-phenyl-1， 2, 3， 6-tetmhydropyridine (MPTP，下同)誘導的神 經退行性過程(Peng J et al: J Biol Ct跳2005 Aug 12 ;280 (32) :29194-8; Kunikowska G, et al: Brain brain Res. 2003 Apr U;968(2):206-18; Tatton WG, et al: Ann Neurol, 1998 S印44(3 S,l 1):S134-41)。 以.卜.研究表明卜.述細胞閑子，如GDNF及其家族成員、CDNG、轉錄閔
子Nurrl和Pitx3、 MANF、 BDNF和S0D1等具有抗細胞凋亡、神經細胞保 護和恢復功能以及與多巴胺合成相關的基因，如酪氨酸水解酶(TH)或GTP 環水解酶基因等，對中框神經系統多種疾病有冶療效果，并且與GAD因子 有較好相互協同作用。因此，基于以上的研究，構建一種共表達GAD和上 述細胞因子的重組病毒，既可顯著改善相關疾病患者的臨床癥狀，又可阻 止神經細胞進一步凋亡，促進神經細胞再生，以達到更有效冶療中樞神經 系統相關疾病之目標是可能的。
發明內容
本發明的目的是構建一種共表達人GAD和相關細胞因子的重組病毒以 及利用其表達產物來治療如本說明書中所描述的中樞神經系統相關疾病。
本發明的內容為構建共表達GAD和細胞因子的重組病毒，并優選共表 込GAD65和GDNF基因組合的重組腺相關病毒(AAV，下同)為例；此重組病 毒所表達的基因組合不僅僅包含有GAD和GDNF的共表達，也包括了 GAD基 因和其他具有神經保護、促神經細胞再生、抗氧化、防止細胞凋亡功能的 或與多巴胺合成相關的細胞因子基因組合的共表達；所應用的病毒載體系統也不僅僅限于AAV病毒系統，也包括了應用其他病毒載體系統所構建的 共表達GAD和上述細胞因子的重組病毒。
本發明以MV為表達載體，更具體的是以AAV helper-free系統為表 達載體，構建含共表達人GAD65和GDNF表達盒結構的重組AAV病毒，其主 要特征為
1) 、 共表達人源GAD和GDNF基因的表達系統為helper-free MV系
統
2) 、表達的GAD基因為人源GAD65基因；
3) 、表達的人源GDNF為成熟型基因，即其N-末端比野生型人源GDNF 缺失從第一位到第五十八位的58個氨基酸，且其N-末端融合有人白細胞介 素-2的先導序列，其C末端序列維持氨基酸不變；
4) 、共表達的人源GAD65和GDNF基因是通過內部核糖體結合位點 (IRES)片段相連接；
5) 、共表達人源GAD65和GDNF基因的表達盒結構由CMV啟動子、0 -珠蛋白外顯子、人源GAD65基因、內部核糖體結合位點(IRES)片段、人源 GDNF基因和人生長激素多聚腺嘌吟序列構成。
附圖1人源谷氨酸脫羧酶(GAD)GAD65基因的PCR產物 提取腦組織總核糖核酸并合成cDNA，應用人工合成的特異性引物，以腦 組織cDNA為模板進行PCR反應，其反應產物在1. 5%瓊脂糖電泳分離;純化后進 行克隆。第一泳道為DNA分于量標記物，第一.泳道為GAD65基因大片段PCR 產物，第三泳道為GAD65基因小片段PCR產物。箭頭為PCR反應產物。附圖2人源谷氨酸脫羧酶GAD65基因的克隆
經RT-PCR反應后,將純化的PCR片段克隆于T-Easy載體；經測序證實后， 將小片段PCR產物按正確方向拼接于大片段PCR產物上，構成含全長人源谷 氨酸脫羧酶GAD65基因的氨基酸編碼片段，用內切酶EcoRl消化，1.5%瓊脂 糖膠電泳分離。第一泳道為DNA分子量標記物、第二泳道為GAD65基因大片 段PCR產物T-Easy載體的酶切圖譜、第三泳道為GAD65基因小片段PCR產物 T-Easy載體的酶切圖譜、第四泳道為全長人源谷氨酸脫羧酶GAD65基因氨基 酸編碼片段的酶切圖譜(箭頭所指為GAD65全長基因片段)。
附圖3人源神經細胞營養因子GDNF基因cDNA片段(RT-PCR)產物 第一泳道為脫氧核苷酸(DNA， 下同)分子量標準；第二和第三泳道為該基因 的反向轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)產物。箭頭所指為該GDNF基因cDNA 片段在瓊脂糖電泳上的位置。
附圖4人源GDNF基因與人白細胞介素-2(IL-2)先導序列的融合 采用PCR方法，以GDNF基因為模板，應用編碼人白細胞介素-2(IL-2)先導 序列多肽和GDNF的5'-未端氨基酸的核苷酸引物進行PCR反應，完成人 源神經營養因子GDNF與人白細胞介素-2(IL-2)先導序列多肽的融合。第 一道為DNA分子量標準、第二和第三道為PCR產物(箭頭所指)。
附圖5融合GDNF基因在大腸桿菌內的表達構建的融合GDNF基因原核 細胞表達質粒轉化大腸桿菌后，經誘導表達，用12%SDS-PAGE膠分析。第 一道蛋白質分子量標準物；第二道非誘導的大腸桿菌蛋白產物；第三道誘 導的大腸桿菌蛋白產物。箭頭所指為表達的融合GDNF蛋白產物。
附圖6表達GDNF蛋白產物的Western Blotting反應第一道蛋甴質分子量標準物；第二道非誘導的人腸桿菌蛋白產物；第三道誘導的人腸桿菌 蛋白產物。箭頭所指為GDNF蛋白質。
附圖7共表達人源GAD65和GDNF基因表達盒結構圖從左到右，分別 是pCMV啟動子、P-珠蛋白內含子、人GAD65、 IRES、人GDNF和人生長激 素多聚腺嘌呤組成。
附圖8含共表達人源GAD65和人源GDNF基因表達盒的重組腺相關病毒 基因組結構圖從左到右，分別為反轉末端重復子(ITR)、共表達人源GAD65 和GDNF基因的表達盒和反轉末端重復子(ITR)。
附圖9共表達人源GAD65和人源GDNF重組腺相關病毒的構建流程圖本 發明構建的共表達人GAD和GDNF的重組腺相關病毒是采用AAV helper-free 表達系統來構建的。第一步，首先是從人腦組織中克隆GAD65和GDNF基因， 并作必要的修飾；第二步將GAD65和GDNF基因插入pIRES-neo載體，使GAD65 經由IRES連接GDNF基因；第三步是用適當內切酶的GAD65/IRES/GDNF的DNA 片段克隆到含ITR的pAAV-MSC的載體上，構建成含共表達GAD65和GDNF表達 盒的pMV-MSC載體質粒；第四步則是用共表達GAD65和GDNF表達盒的重組 pMV載體、pMV-RC和pHelper質粒共轉染MV-293細胞以獲得共表達人GAD65 和GDNF的MV病毒顆粒。
具體實施
為了便于敘述構建共表達人源GAD和人源GDNF表達結構的重組病毒的 具體實施過程，本發明采用腺相關病毒(MV，下同)表達系統，更具體的是 采用helper-free MV表達系統，構建共表達GAD和GDNF表達結構的AAV重組病毒。
構建共表達GAD和GDNF表達結構的AAV重組病毒具體實施過程如下 一、人源谷氨酸脫羧酶GAD65基因的克隆
1) .考慮到GAD65基因較大，決定將此基因分為二個片段迸行克隆，然 后再利用適當內切酶位點，完成GAD65全長基因的拼接。
首先提取腦組織總核糖核酸(totalRNA),并利用Poly (T)引物在反轉錄酶 作用下合成腦組織cDNA;然后以人腦組織cDNA作為模板,應用人工合成的 特異性引物，以腦組織cDNA為模板進行PCR反應，分別產生兩個大小不同的PCR 片段。
引物設il如下
a:產生GAD65的N-末端至C-末端內切酶Stul位點片段的引物， 5， -ccggatccg^j;gcatctccgggctctggcttttgg-3， 5， -tgtaaggccttgtctccagtgtcatag-3，
b.產生GAD65的內切酶Stul位點至C-末端氨基酸合成終止子片段的引 物
5, - gacaaggccttacagtgcggacgc-3，
5' - ga^c從cc^ictctagattataaatcttgtccaaggcgttctatt -3' PCR擴增產物分別經tailing反應，加上腺嘌呤(T)后，連接至T-easy載 體，轉化細菌后，擴增、抽提、純化，經DNA測序確定
2) .經DNA測序正確后，應用內切酶Stul和Seal分別消化含上述PCR 片段的T-easy質粒；用電泳分離、純化含上述PCR的片段，應用連結酶反應，將此二個PCR的片段拼接；然后，轉化感受態細茵，進行擴增，完成 全長人源GAD65基因的克隆；
二、 人GDNF基因克隆及其N未端與人白細胞介素-2先導序列的融合
合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)的步驟同上；然后以人 腦組織cDNA作為模板，應用人工合成的2個正向引物，即l.含有部份編 碼人白細胞介素-2先導氨基酸的核苷酸引物、2.含有部份編碼人白細胞介 素-2先導氨基酸的核苷酸序列和人GDNF基因N-末端氨基酸的核苷酸序列 的引物、和1個反向引物，即人源GDNF基因C-末端核苷酸序列進行PCR 擴增，采用二步PCR法克隆人源GDNF基因，并完成其N未端與人白細胞介 素-2先導序列融合的改建。 正向引物設計如下
1 、 5， -tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3，
2、 5， ~cctggtggaccgaatggtctcagccgaaaaaaaaacgtaaagtgtcaccagataaacaaatgg-3，
反向引物設計如下
5' -tcaagcttcagatacatccacaccttt -3' PCR擴增產物經tailing反應，加上腺嘌呤(T)后，連接至T-easy載體，轉 化細菌后，擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。
三、 含共表達GAD65和GDNF表達盒的pAAV-MCS載體的構建
1)、應用AAV helper-free表達系統中pMV-MCS載體的多克隆位點，將GAD65基因以內切酶BamHl和Xball核苷酸片段、經純化、并與BamHl和Xball 酶切消化、純化的pAAV-MCS載體進行連接反應后，轉化感受態細菌，進行擴增， 并涂布在含適當抗生素的培養皿上，37t培養箱過夜生長；
2) 、篩選多個克隆菌落于含適當抗生素的培養液中，37°C震蕩培養過夜， 于第二天抽取、純化pMV-MCS質粒DNA，并用BamHl和Xball酶切消化，以確 定含有BamHl和Xball的GAD65基因片段的pMV-MCS載體的質粒DNA和克隆菌 株；
3) 、確定含有GAD65基因片段的pAAV-MCS之后，以內切酶Hindi 11和Bglll 完全消化含有GAD65基因的pMV-MCS質粒DNA， 1%瓊脂糖分離、純化備用；
4) 、為獲得IRES片段，用內切酶Hindlll和Small完全消化pIRESneo3載 體DNA (CloneTech.Lab. Inc), 1%瓊脂糖分離、純化IRES片段備用；
5) 、用內切酶Small和Bglll完全消化含有GDNF基因片段的T-easy載體 DNA， 1瓊脂糖分離、純化GDNF基因片段備用
6) 、將上述內切酶Hindlll和Small消化的IRES片段和內切酶Small和 Bglll消化的GDNF基因片段經連結酶反應,拼接到上述內切酶Hindlll和Bglll 完全消化的含GAD65基因的pMV-MCS載體質粒DNA上，轉化感受態細菌，37。C 培養擴增，并涂布在含適當抗生素的培養皿上，37°(:培養箱過夜生長；
7) 、篩選多個克隆菌落于含適當抗生素的培養液中，37QC震蕩培養過夜， 于第二天抽取、純化pMV-MCS質粒DNA，并用上述內切酶消化pMV-MCS質粒 DNA，確定含GAD65基因、IRES片段和GDNF基因的pMV-MCS質粒；四、共表達人源GAD65和GDNF基因的腺相關病毒的制備
腺相關病毒的制備按Stratagene公司提供的MV Helper Free系統說明手 冊描述的方法進行。具體操作過程如下
1) 、在轉染前48小時，在加入10ml DMEM生長培養液的100毫米培養皿中 接種約3百萬個AAV-293細胞，2天后細胞密度應為70~80%;
2) 、解凍含上述表達盒的pMV-MCS、 pAAV-RCH和pHelper質粒DNA,用pH 7. 5的TE緩沖液調整每種質粒DNA為1mg/nil;
3) 、在15毫升培養管中從上述3種質粒溶液中各取10微升DNA溶液，再 加入1亳升0. 4 M CaCl2，輕輕混勻；
4) 、在另一支15毫升培養管中加入1毫升2x HBS溶液，再將上達3)中的 1.03毫丌的DNA/CaCl2滴入l亳升2 x HBS溶液中，倒轉培養管多次混勻
5) 、立即將DNA/CaCL/HBS混懸液滴入MV-293細胞培養皿中，并使其均勻 分布在培養液中；
6) 、將AAV-293細胞培養皿放入37aC培養箱中6小時，隨后去除AAV-293 細胞培養皿中的培養液，加入10毫升新鮮DMEM生長培養液，在37t培養箱中 培養72小時；
7) 、 3天后觀察，如觀察到培養液顏色變化、或看到有細胞形態變園，脫離 板面或漂浮在培養液中，則表明有重組MV病毒顆粒產生；
8) 、此時收集細胞培養液、并收集細胞，通過4次凍/融法，裂解細胞，使 其胞內重組MV病毒釋放出來，最后在室溫下以10, 000 X g離心10分鐘，將 上清液轉移至另一新管中，貯存于-8(f冰箱保存。此即為表達人源GAD65和GDNF基因的重組腺相關病毒(AAV)母液，下一步可進行病毒擴增、病毒滴定度檢測 及GAD65和GDNF基因表達產物的檢測。序列表
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ttggagttggcagagtatttatacaacatcgag^ggfitaitgagatggtg1500
tttgatgggaagcctcagceicacaaatgtctgcttctggtacattcctccaagcttgcgt1560
actctggaagacaatgaagagagaatgagtcgcctctcgaaggtggctccagtgattaaa1620
gCC3g朋tg8t鵬gtfitggaaccac肌tggtcagctacc肌cccttgggagac幼ggtc1680
aatttcttccgcatggtcatctcaaacccagcggcaactcaccaagacattgacttcctg1740
attgaagaaatagaacgecttggacaagatttataatctagagcggccgctc1792
〈210> 2 <211> 585 <212> PRT
<213>人源GAD65氨基酸序列 <400> 2
MetAlaSerProGlySerGlyPheTrpSerPhe(JlySerGluAspGlySerGlyAspSer
5 10 15 20
uAsnProGlyThrA1aArgA1aTrpCysGlnValA1aGlnl,ysPheThrGlyGlyT1e
25 30 35 40
GlyAsnLysLeuCysAlaLeuLeuTyrGlyAspAlaGluLjrsProAlaGluSerGlyGly
45 50 55 60
SerGlnProProArgAlaAlaAlaArgLysAlaAlaCysAlaCysAspGlnLysProCys
65 70 75 80
SerCysSerLysValAspValAsnTyrAlaPheLeuHisAlaThrAspLeuLeuProAla
85 90 95 100
CysAspGlyGluArgProThrLcuAlaPhcLcuGlnAspValMctAsnllcLcuLcuGln
105 110 115 120
TyrValValLysSerPheAspArgSerThrLysVallleAspPheHisTyrProAsnGlu
125 130 135 140
LeuLeuGlnGluTyrAsnTrpGluLeuA1aAspGlnProGlnA snLeuGluGlu11eLeu
145 150 155 160
MetHisCysGlnThrThrLeuLysTyrAlalleLysThrGlyHisProArgTyrPheAsn
165 170 175 180
GlnLeuSerThrGl yLeuA鄰MetValGl yLeuAlaAlaAspTrpLeuThrSerThrAla
185 l恥 195 200
AsnThrAsnMetPheThrTyrGluIleAlaProValPheValLeuLeuGluTyrValThr205 210 215 220
LeuLysLysMetArgGluIleIleGlyTrpProGly€lySerGlyAspGlyIlePheSer
225 230 235 240
ProG丄yGiyAia丄ieSerAsnMetTyrAlaMetMetJleAlaArgPheLysMetPhePro
245 250 255 260
GluValLysGluLysGlyMetAlaAlaLeuProArgLeuIleAlaPheThrSerGluHis
265 270 275 280
SerHisPheSerLeuLysLysGlyA1aA1aA1aLeuGlyI1eGlyThrAspSerValIle
285 290 295 300
LeuIleLysCysAspGluArgGlylysMetlleProSerAspLeuGluArgArglleLeu
305 310 315 320
GluAlaLysGlnLysGlyPheValProPheLeuValSerAlaThrAlaGlyThrThrVal
325 330 335 340
TyrGlyAlaPheAspProLeuLeuAlaValAlaAspIleCysLysLysTyrLysIleTrp
345 350 355 360
MetHisValAspAlaAlaTrpGlyGlyGlyLeuLeuMetSerArgLysHislvysTrpLys
365 370 375 380
LeuSerGlyValGluArgAlaAsnSerValThrTrpAsnProHisLysMetMetGlyVal
385 390 395 400
ProLeuGlnCysSerAlaLeuLeuValArgGluGluGlyLeuMetGlnAsnCysAsnGln
405 410 415 420
MetHi sAlaSerTyrLeuPheGlnGlnAspLysHi sTyrAspLeuSerTyrAspThrGly
425 430 435 440
AspLysAlaLeuGlnCysGlyArgHisValAspValPheLysLeuTrpLeuMetTrpArg
445 450 455 460
AlaLysGlyThrThrGlyPheGluAlaHisValA鄰LysCysLeuGluLeuAlaGluTyr
465 470 475 480
UuTyrAsnllelleLysAsnArgGluGlyTyrGluMetValPheAspGlyLysProGln
485 490 495 500
HisThrAsnValCysPheTrpTyrlleProProSerLeuArgThrLeuGluAspAsnGlu
505 510 515 520
GluArgMetSerArgLeuSerLysValAlaProVallleLysAlaArgMetMetGluTyr
525 530 535 540
GlyThrThrMetValSerTyrGlnProLeuGlyAspLysValAsnPhePheArgMetVal
545 550 555 560
IleSerAsnProAlaAlaThrHisGlnAspIleAspPheLeuIleGluGluIleGluArg
565 570 575 580
LeuGlyGlnAspLeu
585
<210> 3 <211> 494<212> DMA
<213〉 GDNF人工序列 〈400〉 3
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
ggatcaccag ataaacaaat ggcagtgctt cctagaagag agcggaatcg gcaggctgca 120
gctgccaacc cagagaattc cagaggaaaa ggtcggagaa gccagagggg caaaaaccgg 180
ggttgtgtct taactgcaat acatttaaat gtcactgact tgggtctggg ctatgaaacc 240
aaggaggaac tgatttttag gtactgcagc ggctctt.gc.g atgcagct.ga gacaacgtac 300
gacaaaatat tgaaaaactt atccagaaat agaaggctgg tgagcgacaa agtagggcag 360
gcatgttgca gacccatcgc ctttgatg3t gacctgtcgt ttttagatga taacctggtt 420
taccatat-tc taagaaagca ttccgc.taaa a.ggt.gtggat gt.atctgaaa gcttgcatca 480
ctagtgaatt cgcg 494
<210> 4 <211〉 206 <212> PRT
<213> GDNF人工序列 <400> 4
MetTyrArgMetGl nl>euf,euSerCysTl eAl areuSeW,euAl al,euVal ThrAsnSer
5 10 15 20
GlySerProAspLysGlnMetA1aValLeuProArgArgGluArgAsnArgGlnA1aA1a
25 30 35 40
AlaAlaAsnProGluAsnSerArgGlylorsGlyArgArgSerGlnArgGlyLysAsnArg
45 50 55 60
GlyCysValLeuThrAlal1eHi sLeuAsnAlaThrAspLeuGlyLeuGlyTyrGluThr
65 70 75 80
LysGluGluLcuIlcPhcArgTyrCysScrGlyScrCysAspAlaAlaGluThrThrTyr
85 90 95 100
AspLysIleLeuLysAsnLeuSerArgAsnArgArgLeuValSerAspLysValGlyGln
105 110 115 120
AlaCysCysArgProIleAlaPheAspAspAspLeuSerPheLeuAspAspAsnLeuVal
J25 130 135 140
TyrHi sIleLeuArgLysHi sSerAlaLysArgCysGlyCysi1e
145 150 155
2權利要求
1、一種共表達人源谷氨酸脫梭酶(GAD，下同)和人細胞因子的重組病毒，尤其是共表達人源GAD65和膠質細胞源性神經營養因子(GDNF，下同)的重組腺相關病毒(AAV)，其主要特征在于，重組病毒含有共表達人GAD65和人細胞因子的表達盒結構，所述表達盒結構由pCMV啟動子、β-珠蛋白內含子、人源GAD、內部核糖體結合位點(IRES，下同)、人源細胞因子和人生長激素多聚腺嘌呤信號組成。
2、 根據權利要求l，所述的重組病毒，優選共表達人源GAD65和膠質細胞 源性祌經營養因子(GDNF，下同)的重組腺相關病毒(AAV)，其特征在于， 構建的表達盒結構如下a、 pCMV啟動子位于e-珠蛋白內含子的上游、珠蛋白內含子在其C-末端以內切酶BamHi拼接于人GAD65基因的N-末端；b、 人GAD65基因的C-末端以內切酶Xball拼接于IRES片段的N-末端；c、 IRES片段的C-末端以內切酶Small拼接于人GDNF基因的N-末端；d、 人GDNF基因的C-末端以內切酶Bglll拼接于人生長激素多聚腺嘌 呤信號片段的上游。
3、 根據權利要求1,所述的重組病毒，尤其是重組腺相關病毒所共表達的 人源GAD65和GDNF基因的核苷酸及其編碼氨基酸序列a、 人源GAD65為親本源于人的基因、為編碼GAD65基因全長氨基酸的核 苷酸序列；b、 人源GDNF為親本源于人的基因、為編碼成熟型GDNF氨基酸的核苷酸 序列，且其N-未端融合了由人白細胞介素-2的20個氨基酸構成的分泌先導序列，替代了 GDNF前蛋白的第一個氨基酸到第五十八個氨基 酸序列，其C末端氨基酸序列不變。
4、 根據權利要求1，所述的重組病毒，尤其是重組腺相關病毒(MV)含有 共表達人源GAD65和人GDNF細胞因子基因組合的表達盒結構，這種表達盒 結構所表達的基因組合可以是GAD和其他神經保護、促神經細胞再生、防 止細胞凋亡功能的細胞因子，如轉錄因子Nurrl和pitx3、中腦星狀細胞 源性神經營養因子(MANF)、 CDNG、 Neurturin (NTN)和BDNF等基因中的一 種所形成的基因組合；也包括了GAD和抗氧化、抗自由基的基因組合，如 S0Dh還可以是GAD與多巴胺合成相關的細胞因子酪氨酸水解酶(TH)基因 或GTP環水解酶基因中的一種所形成的基因組合的共表達。
5、 根據權利要求1和權利要求4，重組病毒，優選重組腺相關病毒(AAV)所共表達的基因組合，這種基因組合既可是本發明所敘述的表達盒結構， 即由一個啟動子驅動經內部核糖體結合位點IRES連接所述的共表達人源谷 氨酸脫梭酶GAD和上述細胞因子共表達的表達盒結構、也可以是在同一重 組病毒結構中由二個相同或不相同啟動子分別驅動上述基因組合的基因表 達，這些啟動子既可以是源于病毒的啟動子，也可以是源自于人的基因啟 動子。
6、 根據權利要求1,所述的重組病毒不僅僅限于MV病毒，也包括了應用 其他病毒，如腺病毒、慢病毒、泡疹病毒和逆轉錄病毒作為載體所構建的 共表込GAD和上述細胞因子的重組病毒。
7、 根據權利要求1和權利要求2,克隆人GA65基因所應用的方法和引物 設計，即采用的兩歩PCR法克隆人GA65基因以及引物設計。具體操作如下以人腦組織cDNA作為模板，應用人工合成的特異性引 物，進行PCR反應，產生兩個大小不同的PCR片段，PCR擴增產物經tailing 反應后，進'療克隆和測試，正確后進行拼接。設計的引物如下a:產生GAD65的N-末端至C-末端內切酶Stul位點片段的引物 5， -ccggatccg^ggcatctccgggctctggcttttgg-3， 5 ， -tgtaaggccttgtctcceigtgtcatag-3 ， b.產生GAD65的內切酶Stul位點至C-末端氨基酸合成終止子的引物 5， - gacaaggccttacagtgcggacgc-3， (stul) 5， - ga私、鵬、c^tctagattataaatcttgtccaaggcgttctatt -3，。
8、根據權利要求1和權利要求2，克隆和改建人GDNF基因N-末端所應用 的方法和引物設計，即采用兩歩PCR法克隆和改建人GDNF基因N-末端的 方法。具體操作如下應用合成的2個正向引物，即(1)、含部份編碼人白 細胞介素-2先導氨基酸的核苷酸引物；(2)、含部份人白細胞介素-2先導 氨基酸的核苷酸序列和人GDNF的N-末端氨基酸的核苷酸序列的引物；以 及1個反向引物，即人源GDNF基因C-末端核苷酸序列，以人腦cDNA為模 板進行PCR擴增，采用二步PCR法克隆人源GDNF基因，并完成其N未端與 人白細胞介素-2先導序列融合的改建。 兩個正向引物設計如下a、 5， -tcgagctcagg鄉aaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaaectggtggaccg-3，b、 5"cctggtggaccgaatggtctcagccgaaaaaaaaacgtaaagtgtcaccagataaacaaatgg~3,反向引物設計如下 c、 5， -tcaagcttcagatacatccacaccttt -3，第二次PCR擴增產物經tailing反應，加上腺嘌呤(T)后，連接至T-easy 載體，轉化細菌后，擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。
9、 據權利要求l,所述的共表達人源谷氨酸脫梭酶GAD和細胞因子的重組 病毒，優選共表達人源谷氨酸脫梭酶GAD65和GDNF的重組腺相關病毒在用 于治療中樞神經系統相關疾病，尤其是治療帕金森氏病的基因治療藥物 中的應用。
10、 根據權利要求9所述的共表達人源谷氨酸脫梭酶GAD和細胞因子的重 組病毒，優選重組腺相關病毒在治療中樞神經系統相關疾病的基因治療 藥物中的應用，其特征是其治療中樞神經系統相關疾病的有效活性 成分為人源谷氨酸脫梭酶GAD和細胞因子基因的表達蛋白質。
全文摘要
本發明描述了一種構建含表達人源GAD基因和細胞因子基因表達盒結構的重組病毒、尤其是構建一種共表達人源GAD65基因和GDNF基因的重組腺相關病毒的方法、用途和意義。此重組病毒所表達產生的人源GAD65和GDNF基因的蛋白產物對帕金森氏病和中樞神經系統的相關疾病治療有較好協同作用，具有對相關疾病的治療有重要價值。
文檔編號C12N15/10GK101586096SQ20081002819
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月21日 優先權日2008年5月21日
發明者徐評議, 朱雅南, 王尚武 申請人:王尚武;朱雅南;徐評議