專利名稱：從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組dna的試劑盒及其方法
技術領域：
本發明涉及一種從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒及使用該試劑盒提取造礁石珊瑚共 生蟲黃藻基因組DNA的方法。
背景技術：
珊瑚礁具有極高的生物多樣性，全世界海洋生物中有25%生活在珊瑚礁，有"海洋綠洲"或"海洋熱帶 雨林"之稱，其社會經濟價值不可估量。珊瑚礁生態系統具有極豐富的生物資源，是漁業的繁殖基地，為 人類提供重要的食物和藥物資源；海底的珊瑚礁，風景秀麗，更是有名的海底花園，是人們極好的潛水旅 游圣地。因此珊瑚礁的保護和可持續利用日益引起人們的關注，例如我國目前已經成立海南三亞珊瑚礁國 家自然保護區和廣東徐聞珊瑚礁國家自然保護區，由科研人員或者海洋保護管理部門工作人員對珊瑚礁生 態系統進行定期的監測。由于全球變暖引起的珊瑚白化直接威脅珊瑚礁生態系統的生存和發展，其中與造 礁石珊瑚共生的蟲黃藻的種類和多樣性直接影響到宿主石珊瑚能否抵御外界環境的變化，因此珊瑚礁保護 區的常規監測不僅需要掌握造礁石珊瑚的群落種類變化，與其共生的蟲黃藻的種類和多樣性同樣也需要監 測，由于培養蟲黃藻的技術不成熟以及不同生命周期的蟲黃藻形態學特征不完全一致，以及蟲黃藻因長期 適應于共生關系的情形下常會失掉很多的外在特征，因此運用傳統的形態學方法識別與造礁石珊瑚共生的 蟲黃藻的種類和多樣性有其局限性。考慮到監測人員(包括科研人員和海洋保護管理部門工作人員)能夠 便捷及快速的進行監測，分子生物學技術的運用無疑是最恰當的手段。利用分子生物學技術對蟲黃藻進行種類鑒定首先要能提取到高質量的蟲黃藻基因組DNA。由于蟲黃 藻共生于造礁石珊瑚體內，而造礁石珊瑚本身具有碳酸鈣的骨骼，提取過程中碳酸鈣鹽會對基因組DNA 片段造成機械剪切，從而為提取高質量的蟲黃藻基因組DNA增加了困難。而常規的酚/氯仿提取方法，由 于方法繁瑣，并且具有有機溶劑的毒性，不適于常規檢測的運用。因此需要研制一種簡易的從造礁石珊瑚 中提取蟲黃藻基因組DNA的方法，以滿足珊瑚礁保護區常規監測任務的需要。發明內容本發明目的是提供一種能從造礁石珊瑚中快速、高效提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒及使用該試劑 盒提取造礁石珊瑚共生蟲黃藻基因組DNA的方法，用于解決珊瑚礁保護區常規監測中利用分子生物學技 術識別與造礁石珊瑚共生的蟲黃藻的種類和多樣性的監測任務，為珊瑚礁保護區的保護和管理提供技術支 持。本發明所提供的蟲黃藻DNA提取試劑盒，包含有以下試劑(a) 試劑A:由pH8.0， 100-300mM的Tris-Boric溶液、10-100mM的EDTA溶液、質量濃度1-5%的SDS 溶液、50-200mM的NaCl溶液和蒸餾水按25: 10: 10: 2: 53的體積比混合而成；(b) 試劑B:為蛋白酶E，其濃度為5-15mg/ml;(c) 試劑C:為RNAaseA,其濃度為5-30mg/ml;(d) 試劑D:為過飽和NaCl溶液，含有5-7M的NaCl;(e) 試劑E..為DNA洗滌液，為體積濃度為60-80%的乙醇溶液；(f)試劑F:為DNA洗脫液，采用pH8.0,5-20mM的TE緩沖液。 本發明優選的試劑盒的配方如下(a) 試劑A:由pH8.0, 250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、質量濃度2%的SDS溶液、 100mM的NaCl溶液和蒸餾水按25: 10: 10: 2: 53的體積比混合而成；(b) 試劑B:為蛋白酶E，其濃度為10mg/ml;(c) 試劑C:為RNAaseA，其濃度為20mg/ml;(d) 試劑D:為過飽和NaCl溶液，含有？M的NaCl;(e) 試劑E:為DNA洗滌液，為體積濃度為75%的乙醇溶液；(f) 試劑F:為DNA洗脫液，采用pH8.0， 10mM的TE緩沖液。在本試劑盒里，試劑A在高溫(55-65'C)下可裂解細胞，使蛋白變性、染色體離析。試劑B主要水解消 化蛋白質。試劑C則用于降解RNA，防止RNA對下游操作造成干擾。試劑D為過飽和NaCl溶液，在高 濃度NaCl低PH下，DNA可以與硅膠結合。試劑E用以淸洗掉DNA以外的成分，在一定濃度的乙醇存 在下，沖洗過程中，DNA不會溶失。試劑F提供低鹽穩定PH環境，用以洗脫DNA。本發明的主要原理為是研磨的組織細胞用試劑A裂解后，加入試劑B以除去蛋白和多糖類雜質，試 劑C則用于降解RNA。試劑D提供一種在高鹽低pH值環境，在這環境下DNA能與硅膠可逆結合，雙 鏈的DNA分子被硅膠吸附后，以天然狀態或部分變性狀態存在，不能用洗脫RNA或碳水化合物等生物大 分于的溶劑試劑E將其洗脫，而試劑E只將其它成分洗脫。最后，經過水溶性緩沖液試劑F重新水化后， DNA就能從層析柱上定量回收。使用本發明的試劑盒，從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的方法包括以下步驟(1) 樣品處理取約10-30mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末狀，小心倒入2ml離心管。(2) 細胞裂解加入100-300ul試劑A， 10-30ul試劑B,以移液槍頭攪勻，60'C水浴5-15小時，期 間振搖數次。然后加入2-6ul試劑C，輕柔搖勻，37'C水浴l-5小時。(3) 雜質沉淀加入100-300ul試劑D，輕柔搖勻，70。C水浴5-15分鐘，然后加入100-300 ul無水乙醇。(4) DNA吸附將DNA吸附柱放置在離心管中，仔細將上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到組織，6000-10000rpm，離心卜3分鐘。(5) 雜質洗除棄離心管中的濾液，重新將DNA吸附柱放置在離心管中，加入試劑300-600ul E， 6000-10000rpm,離心1-3分鐘，重復1-2次，然后將DNA吸附柱放置在離心管中，空管10000-13000rpm， 離心3-8分鐘。(6) DNA洗脫將DNA吸附柱放置在新的離心管中，37"C吹干5-20分鐘。在吸附柱中加入25-75ul 試劑F，放置1-5分鐘，10000-15000rpm，離心1-8分鐘，離心管中收集液體即為蟲黃藻基因組DNA溶液， -2(TC保存。本發明的優點和積極效果在本發明中，根據蟲黃藻和造礁石珊瑚特殊的共生關系以及組織構造，創 造了一種獨特的從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的方法。本發明有以下明顯優點和積極效果① 提取方法快捷。該方法以及試劑盒可以在IO小時內從造礁石珊瑚內提取到蟲黃藻基因組DNA，可以節省完成監測任務的時間。②提取過程不使用酚、氯仿，減少了對監測人員的身體傷害。③所獲DNA完整， 產量高，包含的遺傳信息全面。④操作簡單，不需要特殊儀器，成本低，可以滿足科研人員和保護區工作 人員監測任務的需要。
具體實施方式
下列實施例是進一步對本發明的說明，不應該當作對本發明的限制。 實施例一按以下配方制作蟲黃藻基因組DNA提取試劑盒-試劑A:由pH8.0， 250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、質量濃度2%的SDS溶液、100mM 的NaCl溶液和蒸餾水按25: 10: 10: 2: 53的體積比混合而成；試劑B:為蛋白酶E，其濃度為10mg/ml;試劑C:為RNAaseA，其濃度為20mg/ml;試劑D:為過飽和NaCl溶液，含有7M的NaCh試劑E:為DNA洗漆液，為體積濃度為75%的乙醇溶液；試劑F:為DNA洗脫液，采用pH8.0， 10mM的TE緩沖液。DNA吸附柱硅膠柱。按以下程序進行操作以提取美麗鹿角珊瑚共生的蟲黃藻基因組DNA:(1) 樣品處理取約30mg美麗鹿角珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末狀，小心倒入2ml離心管；(2) 細胞裂解加入200ul試劑A， 20ul試劑B，以移液槍頭攪勻，6(TC水浴5小時，期間振搖數 次。然后加入4ul試劑C,輕柔搖勻，37'C水浴2小時；(3) 雜質沉淀加入200ul試劑D，輕柔搖勻，7(TC水浴10分鐘，然后加入200 ul無水乙醇；(4) DNA吸附將DNA吸附柱放置在離心管中，小心將上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到組織，8000rpm，離心1分鐘；(5) 雜質洗除棄離心管中的濾液，重新將DNA吸附柱放置在離心管中，加入試劑500ulE， 8000rpm， 離心l分鐘，重復l-2次，然后將DNA吸附柱放置在離心管中，空管13000rpm，離心5分鐘；(6) DNA洗脫將DNA吸附柱放置在新的離心管中，37'C吹干15分鐘。在吸附柱中加入50ul試劑 F，放置3分鐘，13000rpm，離心3分鐘，離心管中收集液體即為美麗鹿角珊瑚共生的蟲黃藻基因組DNA 溶液，-20匸保存；實施例二按以下配方制作蟲黃藻基因組DNA提取試劑盒試劑A:由pH8.0, 100mM的Tris-Boric溶液、10mM的EDTA溶液、質量濃度1%的SDS溶液、50mM 的NaCl溶液和蒸餾水按25: 10: 10: 2: 53的體積比混合而成；試劑B:為蛋白酶E，其濃度為5mg/ml; 試劑C:為RNAaseA，其濃度為5mg/ml; 試劑D:為過飽和NaCl溶液，含有5M的NaCl; 試劑E:為DNA洗滌液，為體積濃度為60%的乙醇溶液； 試劑F:為DNA洗脫液，采用pH8.0， 5mM的TE緩沖液。 DNA吸附柱硅膠柱。按以下程序進行操作以提取粗糙菊花珊瑚共生的蟲黃藻基因組DNA:(1) 樣品處理取約10mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末狀，小心倒入2ml離心管；(2) 細胞裂解加入100ul試劑A， 10ul試劑B，以移液槍頭攪勻，6(TC水浴5小時，期間振搖數 次。然后加入2ul試劑C，輕柔搖勻，37'C水浴1小時；(3) 雜質沉淀:加入100ul試劑D，輕柔搖勻，7(TC水浴5分鐘，然后加入100 ul無水乙醇；(4) DNA吸附將DNA吸附柱放置在離心管中，仔細將上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到組織，6000rpm，離心1分鐘；(5) 雜質洗除棄濾液，重新將DNA吸附柱放置在離心管中，加入試劑300ulE， 6000rpm,離心1 分鐘，重復l-2次，然后將DNA吸附柱放置在離心管中，空管10000rpm，離心3分鐘；(6) DNA洗脫將DNA吸附柱放置在新的離心管中，37"C吹干5分鐘。在吸附柱中加入25ul試劑 F,放置l分鐘，10000卬m，離心1分鐘，離心管中收集液體即為蟲黃藻基因組DNA溶液，-20'C保存。實施例三按以下配方制作蟲黃藻基因組DNA提取試劑盒(a) 試劑A:由pH8.0， 300mM的Tris-Boric溶液、100mM的EDTA溶液、質量濃度5%的SDS溶液、 200mM的NaCl溶液和蒸餾水按25: 10: 10: 2: 53的體積比混合而成；(b) 試劑B:為蛋白酶E，其濃度為15mg/mh(c) 試劑C:為RNAase A，其濃度為30mg/ml;(d) 試劑D:為過飽和NaCl溶液，含有7M的NaCh(e) 試劑E:為DNA洗滌液，為體積濃度為80%的乙醇溶液；(f) 試劑F:為DNA洗脫液，采用pH8.0， 20mM的TE緩沖液。 DNA吸附柱硅膠柱。按以下程序進行操作以提取粗糙菊花珊瑚共生的蟲黃藻基因組DNA:(1) 樣品處理取約30mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末狀，小心倒入2ml離心管；(2) 細胞裂解加入300ul試劑A, 30ul試劑B，以移液槍頭攪勻，60'C水浴15小時，期間振搖 數次。然后加入6ul試劑C，輕柔搖勻，37'C水浴5小時；(3) 雜質沉淀加入300ul試劑D,輕柔搖勻，7(TC水浴15分鐘，然后加入300 ul無水乙醇；(4) DNA吸附將DNA吸附柱放置在離心管中，仔細將上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到組織，10000rpm，離心3分鐘；(5) 雜質洗除棄濾液，重新將DNA吸附柱放置在離心管中，加入試劑600ulE， 10000rpm，離心 3分鐘，重復l-2次，然后將DNA吸附柱放置在離心管中，空管13000rpm，離心8分鐘；(6) DNA洗脫將DNA吸附柱放置在新的離心管中，37'C吹干20分鐘。在吸附柱中加入75ul試劑 F，放置5分鐘，15000rpm，離心8分鐘，離心管中收集液體即為蟲黃藻基因組DNA溶液，-20'C保存。
權利要求
1.從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒，包含有以下試劑(a)試劑A由pH8.0，100-300mM的Tris-Boric溶液、10-100mM的EDTA溶液、質量濃度1-5％的SDS溶液、50-200mM的NaCl溶液和蒸餾水按25∶10∶10∶2∶53的體積比混合而成；(b)試劑B為蛋白酶E，其濃度為5-15mg/ml；(c)試劑C為RNAase A，其濃度為5-30mg/ml；(d)試劑D為過飽和NaCl溶液，含有5-7M的NaCl；(e)試劑E為DNA洗滌液，為體積濃度為60-80％的乙醇溶液；(f)試劑F為DNA洗脫液，采用pH8.0，5-20mM的TE緩沖液。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于包含以下試劑(a) 試劑A:由pH8.0， 250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、質量濃度2%的SDS溶液、 100mM的NaCl溶液和蒸餾水按25: 10: 10: 2: 53的體積比混合而成；(b) 試劑B:為蛋白酶E，其濃度為10mg/ml;(c) 試劑C:為RNAase A,其濃度為20mg/ml;(d) 試劑D:為過飽和NaCl溶液，含有7M的NaCl;(e) 試劑E:為DNA洗滌液，為體積濃度為75%的乙醇溶液；(f) 試劑F:為DNA洗脫液，采用pH8.0,10mM的TE緩沖液。
3. —種使用要得要求1所述的試劑盒從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的方法，包括以下步驟(1) 樣品處理取約10-30mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末狀，小心倒入2ml離心管；(2) 細胞裂解加入100-300ul試劑A, 10-30ul試劑B,以移液槍頭攪勻，60'C水浴5-15小時，期 間振搖數次，然后加入2-6ul試劑C,輕柔搖勻，37'C水浴l-5小時；(3) 雜質沉淀加入100-300ul試劑D，輕柔搖勻，7(TC水浴5-15分鐘，然后加入100-300 ul無水乙醇；(4) DNA吸附將DNA吸附柱放置在離心管中，將上清液全部吸入DNA吸附柱中，6000-10000rpm， 離心1-3分鐘；(5) 雜質洗除棄離心管中的濾液，重新將DNA吸附柱放置在離心管中，加入試劑300-600ul E, 6000-10000rpm，離心1-3分鐘，重復1-2次，然后將DNA吸附柱放置在離心管中，空管10000-13000rpm， 離心3-8分鐘；(6) DNA洗脫將DNA吸附柱放置在新的離心管中，37'C吹干5-20分鐘，在吸附柱中加入25-75ul 試劑F，放置1-5分鐘，10000-15000rpm，離心1-8分鐘，離心管中收集液體即為蟲黃藻基因組DNA溶液， -20'C保存。
全文摘要
本發明提供一種從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒及其方法。試劑盒包括試劑A(裂解液)、試劑B(蛋白酶E)、試劑C(RNAase A)、試劑D(過飽和NaCl溶液)、試劑E(DNA洗滌液)、試劑F(DNA洗脫液)。在本發明的方法中，首先用含SDS的裂解液裂解組織細胞，然后提供一個高鹽低PH的環境，使溶液中蛋白質進一步變性，而DNA可以結合在硅膠柱上。最后在水溶性緩沖液中，DNA就能從層析柱上定量回收。采用本試劑盒及其提取方法，可以快速便捷從不同種類的造礁石珊瑚中提取蟲黃藻的基因組DNA，所獲得的DNA可以用于分子生態學、系統進化等研究，進而滿足珊瑚礁自然保護區定期監測任務的需要。
文檔編號C12N15/10GK101250521SQ20081002730
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月9日 優先權日2008年4月9日
發明者李元超, 董志軍, 暉 黃, 黃良民 申請人:中國科學院南海海洋研究所