專利名稱：：一種近海環境微生物高純度大片段基因組的制備方法
技術領域：
：本發明涉及構建宏基因組文庫時大片段基因組的制備方法，特別涉及構建海洋微生物宏基因組文庫時大片段基因組的制備方法，確切地說是一種近海微生物高純度大片段基因組的制備方法。二
背景技術：
：BAC(細菌人工染色體)作為有效的克隆和表達載體，能攜帶很大的DNA片段(40~400kb)，有利于構建大容量的基因組文庫，從而確保了取樣環境的基因多樣性和豐富性；能容納整個基因簇和生物合成代謝途徑，有利于新藥物、新型生物催化劑和其他有價值的活性物質的開發和利用。使用BAC載體構建宏基因組文庫，要求有大片段、高純度、結構完整的基因組DNA.既要盡可能的提取環境樣品中的基因組副A,又要保持片斷的完整以獲得完整的目的基因或基因簇，還要足夠的純度以保證與載體的連接效率和轉化感受態細胞的效率。因此高質量的大片段基因組對于使用BAC載體構建高容量海洋微生物宏基因組文庫至關重要，對于不同環境的樣品所采取的抽提純化大片段基因組的方法也各不相同，因此發展了多種方法抽提純化基因組用于構建宏基因組文庫。CN1511948A公開了一種構建基因文庫的方法，通過該方法所構建的文庫平均插入片段為19kb。CN182H02A公開了一種大片段海綿宏基因組DNA快速提取方法，按照此方法所提取的基因組大小在50kb左右。CN101148676A公開了一種構建紅樹林土壤大片段宏基因組文庫的方法，按照這種方法制備的基因組多集中在2350kb。過小的片段不利于構建高容量的宏基因組文庫，不利于新藥物、新型生物催化劑和其他有價值的活性物質的篩選，大大限制了BAC載體作為大容量載體構建宏基因組文庫進行功能篩選的優勢。由于海洋環境的特殊性和生物多樣性，海洋微生物具有不同于陸生微生物的獨特代謝途徑和遺傳背景，必定蘊含著獨特的遺傳資源。然而在近海這個獨特的生態環境中，微生物群體含量低而腐殖質相對含量高，直接提取基因組方法中所用的CTAB和PVPP的處理并不能完全除去腐殖質類物質，仍然存在的污染物會抑制限制性內切酶的活性(Zhou，J.,Bruns,M.A.，andTiedje，J".M.(1996)DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition.ApplEnvironMicrobiol62:316~322)。另外，雖然通過這種方法所獲得的基因組DNA產量高，但是大片段基因組DNA在總基因組中的比率較低，片段大小低于100kb(Robe,P.，RNalin,R.，Capellano，C.,Vogel，T.，Simonet，T.(2003)ExtractionofDNAfromsoil39:183~190)。在后續的必需處理步驟中機械力的作用和部分酶切的作用使得大片段基因組DNA斷裂變得更小，同時也使得大片段基因組DNA所占的比率更低，不利于構建大片段、高容量和高覆蓋率的宏基因組文庫。采用瓊脂糖包埋微生物菌體原位裂解的方法，在包埋微生物細胞的同時，腐殖質與微生物細胞一起被包埋，在微生物細胞裂解后與基因組共結合，阻礙了后續部分酶切及與載體連接等必需分子生物學步驟。在接下來的基因組DNA部分酶切中，通常采用兩種方法，一采用瓊脂糖酶酶解低熔點瓊脂糖包埋塊后進行大片段基因組部分酶切，瓊脂糖的酶解在65°C或更高的溫度進行，大片段基因組DNA在高溫下不穩定易斷裂。低熔點瓊脂糖和瓊脂糖酶價格昂貴，目前國內并無企業生產，這種方案低熔點瓊脂糖和瓊脂糖酶用量大，增加了構建宏基因組文庫的成本。另外，停留在包埋塊中的腐殖質會抑制瓊脂糖酶的活性，使得酶解瓊脂糖發生困難。二采用限制性內切酶直接滲透進行酶切。限制性內切酶滲透入低熔點瓊脂糖包埋塊中進行酶切，這種方法需要首先將瓊脂糖塊浸泡在無菌水中去除EDTA，接著放在酶切緩沖液中讓酶切緩沖液在包埋塊中平衡，然后轉移到酶切體系中讓限制性內切酶在緩沖液中和瓊脂糖包埋塊中達到平衡再進行酶切反應，最后加入EDTA并放置于冰上終止反應。該方法步驟多耗時長，所需限制性內切酶量大，對樣品的純度要求高，若包埋塊中存在著與基因組DNA緊密結合的腐殖質將抑制限制性內切酶的活性，導致部分酶切失敗。在包埋塊中進行酶切時需要每一步平衡都要充分，否則部分酶切條件難以重復。總之通過原位裂解的方法存在三個問題，一包埋塊中腐殖質污染的問題，腐殖質與基因組DNA共結合使得后續的瓊脂糖酶消化、限制性內切酶酶切以及與BAC載體的連接效率低下甚至不能進行，導致構建文庫失敗。二制備大片段基因組使用的低熔點瓊脂糖和酶解瓊脂糖包埋塊所用的瓊脂糖酶價格都非常昂貴，使得構建文庫成本高昂。三包埋塊中低濃度的基因組DNA將使得后續的分子生物學步驟無法進行。
發明內容本發明針對現有技術的不足和實際需求，旨在提供一種制備近海環境微生物高純度大片段基因組的方法，進而使用BAC載體構建近海海洋微生物的宏基因組文庫，用于新藥物、新型生物催化劑和其他有價值的活性物質的開發和利用。所要解決的技術問題是排除腐殖質的干擾和解決基因組DNA的低濃度。本發明的技術方案包括微生物菌體的分離、收集、包埋、裂解、消化、洗滌、純化和濃縮，與現有技術的區別是所述的包埋是重懸于bufferl的微生物菌體和等體積的1~2%瓊脂糖溶液混合形成包埋塊，所述的bufferl是每升水中含0.15~0.25MNaCl、40~60mMEDTA、48~12mMTris，pH7.5~8.5;所述的瓊脂糖為凝固溫度為3640。C的分子生物學級瓊脂糖；包埋塊經裂解、消化后釋放出基因組DNA，洗滌除去蛋白酶K后進行電洗脫去除腐殖質得到高純度的基因組DNA，最后濃縮，所述的電洗脫在普通電泳槽中進行，4°C，4~6V/cm,2~4h，倒轉電極12min，所述的濃縮是洗脫液置于0.025WI1的濾膜上，濾膜漂浮于濃度為8~12wt%PEG8000的液面上進行濃縮。具體操作過程如下1、收集微生物菌體使用8um的濾紙過濾海水除去沙粒及真核類生物，通過0.22nm的濾膜收集海水中的微生物細胞，使用刀片將微生物細胞從濾膜表面剝離，重懸于滅菌的海水中。離心收集微生物菌體。2、包埋微生物菌體微生物菌體重懸于buffer1(0.15~0.25MNaCl，40~60mMEDTA,8~12mMTris;pH7.5~8.5)，與保溫在4246。C的濃度為1~2%(重量百分比)的瓊脂糖溶液等體積充分混勻，注入包埋模具，冰上冷卻形成包埋塊。3、裂解微生物細胞將包埋塊置于40mlbufferl(bufferl中含終濃度0.2%脫氧膽酸鈉，1%十二烷基肌氨酸鈉，lmg/ml溶菌酶)在37。C裂解28h。4、消化微生物細胞將包埋塊轉移到的buffer2(lmg/mlof蛋白酶K，1%十二烷基肌氨酸鈉，50mM/LTris,0.5M/LEDTA;pH8.0)消化12~36h，然后更換新的buffer2再消化1236h，脈沖電泳檢測制備的基因組DNA，結果見圖l。5、洗包埋塊裂解消化完畢后，在室溫下用50ml含1mM苯甲基磺酰氟的TE50buffer(lOmMTris,50mMEDTA)洗滌包埋塊去除殘余的蛋白酶K活力。然后用50ml的TE50buffer洗滌三次。6、電洗脫為了去除抑制酶活性的腐殖質，將2~4個包埋塊一起進行電洗脫，將帶負電的基因組DNA洗脫，而腐殖質保留在包埋塊中，制備出高純度的基因組DNA。7、濃縮基因組DNA:在培養皿中加入812wt。/。的PEG8000,放置0.025nm的濾膜于液面，電洗脫液于濾膜上濃縮。8、經純化、濃縮得到的基因組可用于構建基因文庫。本發明的突出優點如下1、本方案不使用昂貴的低熔點瓊脂糖和瓊脂糖酶節省了構建文庫的成本，在包埋微生物菌體和脈沖場凝膠電泳分離基因組DNA片段時使用分子生物學級的瓊脂糖而不是低熔點瓊脂糖，對大片段基因組DNA的酶切采用電洗脫后直接酶切的方式，避免了使用昂貴的瓊脂糖酶，同時也節約了限制性內切酶的用量。2、由于海水中微生物群量低，相對之下腐殖質含量較高，為了收集足夠的微生物群量通過濾膜過濾濃縮大量海水使得腐殖質的比率得以快速提高，而通過bufferl和buffer2裂解消化微生物細胞并不能去除腐殖質，制備的包埋塊呈現腐殖質的典型黃褐色，腐殖質停留在包埋塊中與基因組DNA共結合限制了后續的分子生物學操作。本方案采用電洗脫純化基因組DNA的方案，將基因組從包埋塊中洗脫，解決了腐殖質類物質與基因組DNA共結合的難題。獲得高純度的基因組DNA，避免了腐殖質在后續步驟中對限制性內切酶活性和T4連接酶活性的抑制，同時避免了機械力的損傷，保證了結構的完整性獲得了大片段的基因組DNA，如圖2中l所示回收的基因組大片段高達700kb，并且大片段比率很高。另外如圖2中2所示，限制性內切酶2min即可將大片段基因組DNA部分酶切，說明了大片段基因組DNA純度高，不含腐殖質類污染物。3、本方案針對海洋中包埋塊中基因組的豐度低，采取電洗脫后濾膜濃縮基因組的方案，解決了海水中微生物群體少因而瓊脂糖包埋塊中基因組含量少而導致后續必需分子生物學步驟無法進行的問題，通過濾膜濃縮后能夠獲得高濃度、高純度的大片段基因組DNA，滿足了構建宏基因組文庫的需要。4、由于本方案制備出的大片段基因組DNA具有高濃度、高純度、結構完整的特征，因而與BAC載體連接效率高，轉化感受態細胞效率極高，達到8X109克隆/nigpBeloBACllvector。2y1的連接產物轉化即可獲得20000個克隆，平均插入片段70kb，陽性率達到99%，獲得了1.4Gbp的覆蓋率。通過一次的轉化即可獲得高容量高覆蓋率的宏基因組文庫，大大減少了構建高覆蓋率文庫所需的轉化次數因而節約了商品化感受態的用量，同時節約了構建文庫的時間、成本和工作量。四圖l:為本發明實施例的南海海洋微生物基因組制備結果。M:ADNAladder,l和2所示為制備的基因組DNA。圖2:為本發明實施例的南海海洋微生物基因組部分酶切結果。M:入DNAladder,1~5分別為基因組DNA酶切O、2、4、6、8min的結果。圖3:為本發明實施例的50ul電轉化液涂氯霉素抗性LB平板結果。注釋微距拍攝導致顏色部分失真顯示培養皿邊緣微紅色，圖中所標O為藍斑，其余皆為白斑。圖4:為本發明實施例的抽質粒酶切鑒定插入片段結果。M:ADNAladder,1~11分別為隨即挑選的克隆插入片段電泳結果。五具體實施例方式1、南海海表采樣收集微生物菌體距離廈門海岸10km的海表取水樣，使用8um的濾紙(Whatman)過濾海水除去沙粒及真核類生物，通過0.22ym的濾膜(Millipore)收集海水中的微生物細胞，使用手術刀片將微生物細胞從濾膜表面剝離，重懸于滅菌的海水中。12000g，15min,4'C離心收集微生物菌體。2、包埋微生物菌體微生物菌體重懸于buffer1(0.2MNaCl，50mMEDTA，10mMTris;pH8.0)，與溶化的保溫在45。C濃度為1.6y。的瓊脂糖溶液(Biowest)等體積充分混勻，注入包埋模具(Biorad)，冰上冷卻15min形成包埋塊。3、裂解微生物細胞將包埋塊置于40mlbufferl(bufferl中含終濃度0.2%脫氧膽酸鈉，1%十二烷基肌氨酸鈉，lmg/ml溶菌酶)在37'C裂解4h。4、消化微生物細胞將包埋塊轉移到40ml的buffer2(lmg/ml蛋白酶K，1%十二烷基肌氨酸鈉，50mM/LTris，0.5M/LEDTA;pH8.0)消化24h，然后更換新的buffer2再消化24h。脈沖電泳檢測制備的基因組DNA,結果見圖l。5、洗包埋塊裂解消化完畢后，在室溫下用50ml含1mM苯甲基磺酰氟的TE50buffer洗滌包埋塊去除殘余的蛋白酶K活力。然后用50ml的TE50buffer洗滌三次。6、電洗脫為了去除抑制酶活性的腐殖質，將3個包埋塊一起進行電洗脫，將帶負電的基因組DNA洗脫，而腐殖質保存在包埋塊中，電洗脫在普通電泳槽中進行，條件為4'C，5V/cm，3h，然后反轉電極電洗脫lmin，高純度的基因組DNA就釋放到透析袋的洗脫液中。7、濃縮基因組DNA:在90腿的培養皿中加入10。/。的PEG800020ml，放置0.025um的濾膜(Millipore)于液面，電洗脫液于濾膜上濃縮至lOOtx1。8、部分酶切使用HindIII(NEB)摸索部分酶切大片段基因組的最優條件(見表l)，37'C反應2min、4min、6min、8min，結果見圖2。采用最優條件酶切大片段基因組。表1部分酶切體系(y1)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>9、電洗脫回收脈沖場凝膠電泳分離部分酶切產物，將大于50kb的區域切割，電洗脫回收，將電洗脫液通過0.025um的濾膜濃縮(方法同上)。10、連接將基因組DNA與BAC載體連接(見表2)，15°C，16h。將連接產物在0.025ym的濾膜上濃縮脫鹽(方法同上)。表2連接體系(yl)_部分酶切的基因組DNA30pBeloBACllvector110XT4ligasebuffer10T4ligase3ddH205610011、取2y1連接產物轉化50lil￡coiiEPI300細胞，電轉化條件2.5kV，25uF，200Q，涂氯霉素抗性的LB培養板，每次轉化能夠獲得約20000個克隆，結果見圖3。12、挑單克隆于LB中培養，抽質粒、NotI酶切、脈沖場凝膠電泳檢測，結果見圖4，陽性率高于99%，片段大小均一，平均插入片段70kb.為一高質量的BAC文庫，一次轉化即可獲得1.4Gbp的覆蓋率。權利要求1、一種近海微生物高純度大片段基因組的制備方法，包括微生物菌體的分離、收集、包埋、裂解、消化、洗滌、純化和濃縮，其特征在于所述的包埋是重懸于bufferl的微生物菌體和等體積的1～2％瓊脂糖溶液混合形成包埋塊；所述的bufferl是每升水中含0.15～0.25MNaCl、40～60mMEDTA、8～12mMTris，pH7.5～8.5；所述的瓊脂糖是凝固點為36～40℃的分子生物學級瓊脂糖；所述的純化是包埋塊經裂解、消化和洗滌后進行電洗脫純化，電洗脫在普通電泳槽中進行，條件為4℃，4～6V/cm，2～4h，然后反轉電極洗脫1～2min；所述的濃縮是洗脫液置于0.025μm的濾膜上，濾膜漂浮于8～12wt％PEG8000的液面上進行濃縮。全文摘要一種近海微生物高純度大片段基因組的制備方法，將分離、收集的近海微生物菌體重懸于buffer1中并和等體積的1～2％瓊脂糖溶液混合形成包埋塊，buffer1是每升水中含0.15～0.25MNaCl、40～60mMEDTA、8～12mMTris，pH7.5～8.5；瓊脂糖是凝固點為36～40℃的分子生物學級瓊脂糖；包埋塊經裂解、消化和洗滌后進行電洗脫純化和膜濃縮。得到高濃度、高純度的大片段基因組DNA，滿足了構建宏基因組文庫的需要。本發明采用電洗脫純化基因組的方案，解決腐殖質類物質與DNA共結合的難題，從而獲得結構完整的大片段基因組DNA，也避免了腐殖質類物質在后續構建基因文庫時的干擾。文檔編號C12N15/10GK101314773SQ20081002434公開日2008年12月3日申請日期2008年5月21日優先權日2008年5月21日公開號200810024342.發明者儲新民,孫寶林,峰朱申請人:中國科學技術大學被以下專利引用(1),