專利名稱：：一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物及其用法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及雜交鵝掌楸的分子檢測引物及其用法，專用于鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸快速分子檢測和鑒定，屬于植物新品種鑒定領域。
背景技術：
：木蘭科鵝掌楸屬(hWo&"^wO植物現存2個種，一種是北美鵝掌楸(Z.Linn.);另一種為鵝掌楸U.c/z/"e"se(Hemsl.)Sarg.〕。鵝掌楸生長迅速，樹干圓滿通直，材質優良，病蟲害很少，葉形奇特，花冠色澤淡雅，具有較高的觀賞價值，因此，鵝掌楸是優良的園林綠化與工業用材樹種(王章榮，等.鵝掌楸屬樹種雜交育種與利用[M].北京:中國林業出版社，2005)。自1963年我國已故著名林木遺傳育種學家葉培忠教授成功獲得雜交鵝掌楸以來，南京林業大學先后培育出一批雜交鵝掌楸優良家系與無性系，經過40余年的試驗研究，證實了雜交鵝掌楸具有非常強的雜種優勢。與2個親本種鵝掌楸與北美鵝掌楸相比，雜交鵝掌楸表現出速生、花色艷麗、葉大、抗逆性強、適應性廣、幾乎無病蟲害等優勢，是優良的園林綠化及珍貴用材樹種。迄今為止，雜交鵝掌楸已在江蘇、福建、湖南、浙江、江西、山東、湖北、湖南、貴州、云南、北京等地區推廣，產生了巨大的經濟和社會效益。2007年，因其葉形似中國傳統服裝馬褂以及雜交鵝掌楸速生、觀賞性好、適應性廣等優點而被列為2008年北京奧運會的奧運樹。隨著人們對雜交鵝掌楸利用價值的不斷認識，其推廣應用規模迅速擴大，導致其苗木供不應求，苗木價格不斷攀升。為追逐利益的最大化，許多不法苗木經營商常將鵝掌楸或北美鵝掌楸苗木假冒雜交鵝掌楸苗木出售，造成雜交鵝掌楸苗木市場的混亂，無形中傷害了正規苗木生產者與經營商的積極性，必將阻礙雜交鵝掌楸的推廣和發展。因此，生產上急需一種方便、快速、可靠的雜交鵝掌楸鑒別方法。傳統的鵝掌楸種類鑒定基于形態特征(劉洪諤，沈湘林,曾玉亮.，中國鵝掌楸、美國鵝掌楸及其雜種在形態和生長形狀上的遺傳和變異，浙江林業科技，1991，11(5):1822)、解剖特征(葉金山,周守標,王章榮.雜種鵝掌楸葉解剖結構特征的識別.植物資源與環境，1997，6(4):5860)和同工酶譜帶(黃敏仁,陳道明，雜種馬褂木的同工酶分析，南京林產工業學院學報，1979，1(2):156158)等方面。但形態特征在苗期差異并不明顯且受環境因素影響較大、同工酶標記也受基因表達的限制而影響其使用。基于檢測DNA水平多態性的分子標記技術的發展為雜種識別和親本選配提供了有效的途徑。李周岐、王章榮采用RAPD分子標記技術，對雜種鵝掌楸識別方法進行了探討(李周岐，王章榮.用RAPD標記進行鵝掌楸雜種識別和親本選配.林業科學，2002，38(5):169~174)，利用RAPD指紋圖譜進行雜種馬褂木無性系鑒定(李周岐，王章榮.雜種馬褂木無性系隨機擴增多態DNA指紋圖譜的構建.東北林業大學學報，2001，29(4):5-8)。但基于RAPD技術的分子檢測與品種鑒定存在以下主要缺陷(l)RAPD的檢測受反應條件的影響較大，其重復性和穩定性差，從而嚴重影響檢測結果的可信度。(2)需要使用多對引物，操作煩瑣，耗時長，不能達到快速、準確鑒定的目標。
發明內容本發明的目的是克服以往雜交鵝掌楸鑒定方法存在的缺陷，提供結果高度準確可靠、易于操作、靈敏度高的雜交鵝掌楸的檢測和診斷方法。該方法可以直接應用于生產實踐，對于雜交鵝掌楸苗木的鑒定和交易無疑具有十分重要的意義。為達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物，包括鵝掌楸特異性SSR引物對LT008L/R，其引物序列為LT008LCCGAACGATGATAAAGTGAGLT008RGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG上述LT008L和LT008R引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp雙帶位的產物。上述雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物的用法，包括DNA提取采用改進的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應體系和反應程序用引物對LT008L和LT008R對鵝掌楸的樣本進行PCR擴增；PCR的反應體系lOpL，包括模板DNA1^L(約20~25ng)、10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2nL、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25^L、AmpliTaqGold0.05nL、ddH206.25nL;PCR反應程序為預變性94'C4min;梯度降溫擴增15循環的94'C30s，60°C30s(此后每個循環退火溫度均比前一個循環低OTC)，72'C30s;—般性擴增15循環的94。C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72。Clh和最終的保存4。C;然后對PCR產物用8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后采用了銀染的方法對PCR擴增產物進行檢測，根據擴增產物的有無和大小來判定結果。本發明的關鍵技術是鵝掌楸簡單序列重復(simplerepeatsequence,SSR)標記引物。所用的引物來自于本實驗室從北美鵝掌楸EST序列中開發出的EST-SSR引物(XuM,LiHQZhangB.FifteenpolymorphicsimplesequencerepeatmarkersfromexpressedsequencetagsofLiriodendrontulipifera.MolechlarEcologyNotes,2006，6:728~730)。北美鵝掌楸ESTs序列來自dbEST數據庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/in-dex.html)。將EST序列下載后利用Phrap軟件拼接聚類得到6520條EST序列。然后用SSR鑒定軟件SSRIT(SimpleSequenceRepeatIdentificationTool)對這6520條EST序列進行SSR檢索(http:〃www.gramene.org/gramene/searches/ssrt-ool)，對所檢索到的SSR-ESTs序列進行引物設計，所用弓I物設計軟件為Primer3.0(http:Wwww.genome.wi.mit.edu)。最后成功設計176對EST-SSR引物。隨機選擇鵝掌楸、北美鵝掌楸各4個DNA樣品，雜交鵝掌楸3個樣品對176對引物進行PCR擴增，篩選出有產物，主帶清晰的種特異性引物8對；然后再用不同種源的鵝掌楸11個DNA樣品、北美鵝掌楸5個DNA樣品，不同交配組合的雜交鵝掌楸4個DNA樣品，對初篩所得到的引物進行復篩，最后選取一對特異性強、通用性好且多態性高的特異性SSR引物，即LT008L/R。該引物的EST序列號為250734，共273個堿基。該引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產物，在雜種鵝掌楸中特異性擴增出190bp和180bp兩種產物。本發明方法適用于鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸的快速可靠的分子檢測和鑒定，對于雜交鵝掌楸苗木的鑒定具有重要的實用價值，與國內其他方法相比，本發明具有以下的技術優勢1、結果高度準確、可靠本發明已經對不同種源的鵝掌楸與北美鵝掌楸樣本，不同雜交組合的雜交鵝掌楸的DNA樣本進行了檢測，檢測結果100%準確，為檢測結果提供了高度的可靠性。2、操作簡便快速本實驗方法對樣本進行簡單處理、PCR擴增和常規的聚丙烯酰胺凝膠電泳后即可以判斷結果，無需對擴增的產物進行限制性內切酶酶切。一般整個檢測過程可在4個小時內完成。3、檢測結果靈敏度高對待檢測樣品僅需提供模板DNA20ng即可準確鑒定其所屬種。4、取材方便、經濟效益明顯本方法實驗采樣方便，葉片、冬芽、花等組織或器官均可為實驗材料，苗期、幼林期、成年大樹均可取樣，不受季節、地點限制。通過對鵝掌楸苗木進行分子鑒定可以避免苗木生產與銷售過程中出現魚龍混雜的現象，對于雜交鵝掌楸的苗木生產與銷售具有十分重要的經濟效益。圖1引物LT008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸的基因組DNA樣本的PCR擴增電泳圖。其中，M:DNA標記，1-7為不同組合的雜交鵝掌楸群體，8-14為北美鵝掌楸群體，15-21不同種源地的鵝掌楸群體。圖2引物LT008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸的基因組DNA樣本的PCR擴增電泳圖。其中M:DNA標記，1-6為不同組合的雜交鵝掌楸群體，7-12為北美鵝掌楸群體，13-18為不同種源地的鵝掌楸群體。具體實施例方式本發明的技術內容是微衛星SSR引物一對LT008L/R，其引物序列為CCGAACGATGATAAAGTGAGGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG該對引物可準確地鑒定鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸。在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和1卯bp兩種產物。各種鵝掌楸存在條件下的鑒定方法DNA提取采用改進的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應體系和反應程序用引物對LT008L/R對鵝掌楸的樣本進行PCR擴增。PCR的方應體系10nL，包括模板DNAl^iL(20~25ng)、10xBufferlpL、10mMdNTPs(上海捷瑞生物有限公司)0.2pL、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25pL、AmpliTaqGold(上海捷瑞生物有限公司)0.05pL、ddH206.25pL。PCR反應程序為預變性94。C4min;梯度降溫擴增15循環的94'C30s，60'C30s(此后每個循環退火溫度均比前一個循環低0.7'C);72'C30s，一般性擴增15循環的94'C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72。Clh和最終的保存4。C。所用的PCR儀為APPL正DBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。然后對PCR產物加7uL上樣緩沖液，進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(500mL8。/。丙烯酰胺含尿素210g，甲叉lg，丙烯酰胺39g，10XTBE50ML)。200v穩壓電泳lhours左右后固定染色；固定10min(固定液10%乙醇，0.5%乙酸)，ddH20漂洗2次每次2min;再用0.15%硝酸銀染色7min，雙蒸水漂洗2次每次2min，最后顯影(1.5%氫氧化鈉，0.00756%四硼酸鈉，1%甲醛)至條帶清晰，然后對擴增產物進行大小判斷。實施例l:引物LT008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸進行種類鑒定。利用引物對LT008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸各15個樣本進行種類鑒定。結果在鵝掌楸群體上都特異地擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸群體上都特異地擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸群體上特異地擴增出180bp和190bp兩種產物雜，PCR的方應體系10pL，包括模板DNAlpL10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2(上海捷瑞生物有限公司)、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25^L、AmpliTaqGold0.05(上海捷瑞生物有限公司)、ddH206.25^L。PCR反應程序為預變性94。C4min;梯度降溫擴增15循環的94。C30s，60'C30s(此后每個循環退火溫度均比前一個循環低0.7。C);72'C30s,—般性擴增15循環的94'C30s，49.5°C30s，72°C30s;延伸72°Clh和最終的保存4°C。所用的PCR儀為APPLIEDBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。所用的樣品具體情況見表1，檢測結果見圖1。表l、弓I物LT008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:引物LT008L/R對不同于實施例1的鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸進行種類鑒定。利用引物對LT008L/R對不同于實施例1中的鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸各15個樣本進行種類鑒定。結果在鵝掌楸群體上都特異地擴增出l卯bp的產物，在北美鵝掌楸群體上都特異地擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸群體上特異地擴增出180bp和190bp兩種產物。PCR的方應體系和PCR反應程序均同實例1的鵝掌楸的檢測分析步驟。所用的樣品具體情況見表2，檢測結果見圖2表2、引物LT008L/R引物對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸_各15個樣本的特異性擴增結果_樣本數量LT008L/R檢測結果雜交組合(個)190bpl抑bpl卯，180bp鵝掌楸浙江松陽2+—_浙江富陽1+——四川敘永2+—江西廬山3+—云南西疇1+——云南馬關1+—_浙江遂昌1+—_貴州松桃1+—_貴州黎平1+——浙江安吉1+——安徽績溪1+—一北美鵝掌楸密蘇里3_+_路易斯6_+_佐治亞6—+—雜交鵝掌楸南卡X桑植11—_+北美X廬山21一—+密蘇里x黃山1_—+北美X廬山31__+路易斯X廬山11——+松陽x北卡1—_+北卡x松陽1——+路易斯x富陽1_+路易斯X廬山21_+路易斯x酉陽1——+南卡x松陽1_一+南卡X桑植21—_+廬山x路易斯1——+路易斯x松陽1_—+密蘇里x廬山1_—+實施例3:利用本發明的特異性引物LT008L/R對鵝掌楸多父本混合控制授粉子代鑒定利用引物對LT008L/R對母本為南卡、路易斯和廬山，父本范圍已知(廬山、富陽、密蘇里、南卡、路易斯)的控制授粉子代進行的86個樣本進行種類鑒定。PCR的方應體系和PCR反應程序均同實施例1的鵝掌楸的檢測分析步驟。實驗的具體結果見表3。表3、引物LT008L/R對鵝掌楸多父本混合控制授粉子代鑒定結果母本子代數量190bpLT008L/R檢測結果180bp190,180bp鑒定結果南卡7—+一北美鵝掌楸(北美鵝掌楸)31—+雜交鵝掌楸路易斯1—+_北美鵝掌楸(北美鵝掌楸)19———+雜交鵝掌楸廬山24+——鵝掌楸(鵝掌楸)4——+雜交鵝掌楸SEQUENCELISTING<110>南京林業大學〈120〉一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物及其用法<130〉njfu080917<140〉2008100224416<141〉2008-07-21<160>2〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉LT008L<400>1ccgaacgatgataaagtgag<210>2<211>20<212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉<223>LT008R〈400〉2gtaggtttgaagggaagagg權利要求1、一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物，包括鵝掌楸特異性SSR引物對LT008L/R，其引物序列為LT008LCCGAACGATGATAAAGTGAGLT008RGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG上述LT008L和LT008R引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp兩種產物。2、權利要求1所述雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物的用法，包括DNA提取采用改進的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應體系和反應程序用引物對LT008L和LT008R對鵝掌楸的樣本進行PCR擴增；PCR的反應體系10pL，包括模板DNAluL、10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2pL、25mMMgCl2ljxL、F-primer0.25^L、R-primer0.25nL、AmpliTaqGold0.05nL、ddH206.25nL;PCR反應程序為預變性94'C4min;梯度降溫擴增15循環的94'C30s，60'C30s(此后每個循環退火溫度均比前一個循環低0.7'C)，72'C30s;—般性擴增15循環的94。C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72°Clh和最終的保存4'C。；然后對PCR產物用8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后采用銀染方法對PCR擴增產物進行檢測，根據擴增產物的有無和擴增產物大小來判定結果。全文摘要本發明公開了一種雜交鵝掌楸分子檢測引物及其用法，專用于鵝掌楸、北美鵝掌楸、雜交鵝掌楸的快速分子檢測和鑒定，屬于植物新品種分子鑒定領域。設計了一對SSR引物對即LT008L/R，該引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp兩種產物。本發明采用一對特異性SSR引物，進行一次PCR擴增反應，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，可直接根據產物的片斷進行判斷。本發明可直接應用于雜交鵝掌楸及鵝掌楸、北美鵝掌楸種水平的鑒定。文檔編號C12N15/11GK101348830SQ20081002244公開日2009年1月21日申請日期2008年7月21日優先權日2008年7月21日發明者馮源恒,張紅蓮,李火根,猛胥申請人:南京林業大學