專利名稱：二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因及其所編碼的蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明公開了一個來自小麥(7W"c"歷ase"K"/z L.)望水白的二磷酸尿核甘 葡萄糖基轉移酶基因(7^-W^)及其所編碼的蛋白質，屬于基因工程領域，該基因導 入易感赤霉病小麥品種，可能降低小麥籽粒中DON的含量。
二背景技術：
小麥赤霉病(冊B)是一種真菌性病害，現在已經變成了 一個世界范圍的破壞性 疾病。它能對小麥，大麥等小未谷類以及玉米等作物產生病害而直接造成作物減產。 另一方面，收獲的糧食由于被deoxynivalenol (DON)和其他一些trichothecene toxins的污染而影響了品質。這些毒素對人和動物都是非常有害的。在這類毒素中， DON是包括中國在內的許多國家的糧食中最普遍存在的一類毒素。為了保護消費者 的安全，目前很多國家都對小麥面粉中DON的含量做出了一定的限制。
人們最早將小麥對赤霉病的抗性分為抗侵染(Type I)和抗擴展(Type II) 兩種類型。后來的研究發現抗病品種存在能夠阻止毒素DON合成或促使其降解的因 素，于是又提出了第三類抗性(Type III)即抗毒素或降解毒素積累。自第三類抗 性(Type III)提出后，人們在這方面做了很多的工作，已經發現了一些和抗毒素 或降解毒素積累相關的基因，例如從抗病品種中分離出來的具有降解DON功能的鐮 刀菌乙酰基轉移酶基因；近來還從擬南芥中克隆出了二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶 基因家族中的A^77基因，對該基因的研究表明ZW77基因可將葡萄糖基添加到D0N 和15A-D0N的3-0H位置上，使有毒的DON變成低毒物質而降低其毒性，轉基因實驗結 果也顯示汰^77基因確實能降低D0N對植物的傷害(Brigitte Po卯enberger W Detoxification of the尸i/5ar/咖Mycotoxin Deoxynivalenol by a UDP-glucosyltransferase froro ylraWob/wis "a7/a"aT冊JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 48, Issue of November 28, pp. 47905 - 47914， 2003)。 但是在小麥中還沒有發現有這類基因的報道。小麥望水白是到目前為止普遍公認的 對赤霉病抗性強，抗性穩定，籽粒中D0N含量低的一個品種，所以我們從小麥望水 白品種中克隆出的降解DON的二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因可以導入到其他易 感赤霉病小麥品種中，從而有望增強小麥對D0N的抗性，降低小麥籽粒中DON的含量。
三
發明內容
技術問題-
豐發明的目的在于公開一個來自小麥(7WWc"歷a9e"w朋L.)望水白品種中 的二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因(ra-W 7)及其所編碼的蛋白質，可作為目的基 因導入別的小麥品種，從而降低小麥籽粒中的DON的含量，進行小麥品種改良。 技術方案-
本發明二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因(7^-w;7)及其所編碼的蛋白質，來自
小麥(rrit/c娜L.)望水白，命名為7a-M^基因，其核苷酸序列為SEQ IDNO.l。該二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因及其所編碼的蛋白質，命名為Ta-UGT 蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。 有益效果
1、 本發明公開了一個二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因(ra-〃6"及其所編碼的 蛋白質。二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因為小麥中首次報道，該基因來自小麥
(7>"/c"/z asetjV鵬Z. J望水白品種，試驗結果如圖4所示在20ppm濃度的 DON培養基中，轉基因陽性植株的T2代幼苗的生長勢明顯要比非轉基因對照要好， 由此可證明T^-[/Gr基因能提高擬南芥對DON的抗性。將該基因轉化到易感赤霉 病小麥品種中，有望提高小麥對赤霉病的抗性，降低小麥籽粒中的DON的含量， 進行小麥品種改良。
2、 利用本發明7a-w;r基因作為目的基因構建植物表達載體，其中可用任何一種啟
動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子。為 了簡化轉化細胞的鑒定可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變 化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類， 也可用無標記選擇。
四
圖1用M-2-F和M-2-R引物在DON誘導的小麥望水白穗部cDNA文庫中對7a-W r基 因的篩選結果有281bp條帶的為篩出的陽性單克隆； 圖2植物表達載體pCAMBIA1301-220. 6的構建模式圖
圖3擬南芥陽性轉化株和非轉基因對照株的Northern雜交結果A中CK為非轉基 因對照，1 6為不同的陽性轉基因擬南芥株；B為Northern雜交前的總RNA; 圖4轉基因擬南芥陽性植株幼苗與非轉基因對照幼苗在含有一定濃度DON的MS培 養基上生長15天后情況CK為非轉基因對照，5為轉基因擬南芥5號陽性株后代 幼苗。
五具體實施例方式
1、利用芯片信息在經DON誘導的望水白穗部cDNA文庫中進行候選基因的篩選小麥品種望水白(公知公用材料，裴自友賈高峰等普通小麥籽粒DON含量的 配合力分析作物學報ACTA AGRONOMICA SINICA 2007 ，33 (5) :731 - 737)抽穗 期采用單花滴注法接種deoxynivalenol (DON) (Sigma)水溶液(100ppm)，用水接 種作為對照。接種后12、 24h取穗樣，用TRIZOL (invitogen)按試劑說明書分別提 取總RM， D0N誘導的2份RNA等量混合作為實驗組，水接種的2份RNA等量混合作為對 照組。實驗組和對照組的RNA對Affymetrix wheat基因表達譜芯片(partnumber 900559) (Affymetrix)進行雜交，該實驗在"上海國家生物芯片工程中心"完成， 實驗步驟參照Affymetrix公司說明書"Expressed Analysis Technical Manual" (http://www-affymetyix.com/support/ technical/ manual/expression manual, affx)。以實驗組信號與對照組信號比值大于2為標準篩選上調表達基因， 在上調表達的基因中發現增加倍數為2"倍的探針CA695961 (見網址 http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi7db^nucest&id二25417747)， 該基因推導的功能與已報道的擬南芥中降解D0N的基因汰^77為同一家族的葡萄糖 基轉移酶基因家族。根據CA695961序列設計引物(引物序列分別為M-5， -GAGGCTACAGAGGAGTTG-3，和M-2-R : 5， -TGTATTCCCTTCATTTGG -3，)篩選DON 誘導的望水白小麥穗組織cDNA文庫(由本實驗室提供)，以該cDNA文庫2W菌液為摸 板進行PCR反應10MM的5，引物和3'引物各O. 5W; 2. 5l4 10Xbuffer; 2. 2.5mM 的d鮮;L5Hl 25mM的mg2+; 0.(5脅l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25W。反應條件為94。C預變性3min; 94°C 45 s， 48°C 45 s， 72°C lmin， 33個循 環；72t延伸10min。 PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選到的陽性單克隆提 取質粒測序，測序由上海英駿公司完成。對測序結果經BLAST比較分析發現這是一 個完整的cDNA序列SEQ IDNO.l，該基因全長1771bp，包含一個編碼496個氨基酸的 完整的ORF框，該基因推測為二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因(fa-M 7D。
2、植物表達載體的構建、農桿菌轉化擬南芥及陽性擬南芥轉化子的篩選和驗證
植物表達載體pCAMBIA1301-220.6由pCAMBIA1301 (公知公用材料，薛仁鎬基 因槍法轉化大豆萌動種子影響因素的研究大豆科學第27巻第2期2008年4月)和 pBI220.6 (公知公用材料，Ya-Ping Chen "Plastidial Glut athione Reductase from他y朋Ws ta77osa is an Enhancer of Powdery Mildew Resistance in Wheat (7]ri"c咖aes".ra頂)Plant and Cell Physiology 2007 48(12) :1702-1712)組 合而成。
轉基因載體pCAMBIA1301-220. 6-ra-M;7的構建過程如下根據Ta-W 7的全長序列SEQ ID NO. l設計能擴增出ORF的帶有BamH I和Kpn I酶切位點的PCR引物
(Ta-UGT-B: 5， -ACTGGATCCCCAGCCTGACAGACTCCACT-3，和Ta-UGT-K: 5' -ACTGGTACCTCACCTGTGAGCCTGGTACA-3)，以含7a-W7堪因的質粒DNA作為模版進 行PCR擴增(PCR體系:20 ng質粒DNA; 10幽的5'引物3'引物各0.5Ml; 2. 5h1 10Xbuffer; 2. 2.5mM的dNTP; 1.25mM的Mg2、 0.25W (5U/W) Taq polymerase,加水至25W。 PCR程序:94。C預變性3min; 94。C 45 s， 58°C 45 s, 72°C 1.5min， 33個循環；72。C延伸10min)， PCR產物用BamH I和Kpn I酶切電泳并回收， 目的片段的回收和純化按BiospinGel Extration kit試劑盒(BioFlux)說明書進行； pCAMBIA1301-220.6也用BamH I和Kpn I酶切電泳并回收；兩種回收產物用T4連接酶 (Promega)連接形成重組質粒pCAMBIA1301-220.6-7k-〃(J7;轉入農桿菌C58cl (公知 公用材料張彬等，農桿菌介導春小麥遺傳轉化體系的優化研究核農學報2007， 21 (2) : 124 127)。
轉基因程序將含有pCAMBIA1301-220. 6-W7順農桿菌株接種于YEB液體培 養基(含gOmg/L利福平，50mg/L卡那霉素)中擴大培養至菌液OD 600為0.6~0.8， 離心收集菌體沉淀，將菌體再重懸于同體積的轉化滲透液(1/2MS+20免蔗糖+0.2W Silvet77)中備用。野生型擬南芥哥倫比亞生態型(ColO)種子(公知公用材料， 戴富明等農桿菌介導木霉幾丁質酶基因轉化擬南芥及其T,代對油菜菌核病抗性提 高上海交通大學學報農業科學版第23巻第1期2005年3月)浮于O. W的瓊脂中4。C 條件下春化處理48h后，播種到基質(腐質營養土蛭石=1: 1)中，22°C 25flC， 16h光照/8h黑暗條件下生長。等生長至擬南芥初花期花瓣沒有完全展開時，用備用 的農桿菌的轉化液對擬南芥小花進行噴霧接種轉化。轉化后保濕48h后再進行第2次 接種，再保濕48h,以后在正常條件下生長，直到收獲種子。
將農桿菌轉化后收獲的L代種子經0. 1%的升汞消毒15min，無菌水清洗2遍后 置于含50mg/L潮霉素的1/2MS培養基上，4flC黑暗條件下春化處理48h后，轉到 22°C 25°C， 16h光照/8h黑暗條件下生長大概7 10天后選取在1/2MS培養基上能 正常生長的幼苗，移植到基質中在相同環境條件下繼續生長。 3、陽性擬南芥轉化植株Northern雜交
取經潮霉素篩選得到的陽性擬南芥轉化植株及非轉基因CK對照植株的葉片， 用TRIZOL (invitogen)按試劑說明書提取總RNA，以Ta-f/Gr為探針進行Northern 雜交。Northern雜交操作中的探針的標記、雜交、顯色等程序按照DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I試劑盒(Roche)說明書進行。Northern雜交 結果如圖3所示7ii-f/Gr在所有轉基因擬南芥陽性植株中都有表達，不同陽性植株的表達量有差異；在非轉基因對照植株未檢測到該基因的表達。 4、陽性轉基因擬南芥抗DON的功能驗證
取經Northern雜交分析后的轉基因擬南芥陽性植株的丁2代種子和非轉基因擬 南芥種子，經0.1%的升汞消毒15min，無菌水清洗2遍后置于含50mg/L潮霉素的 1/2MS培養基上，同時將非轉基因擬南芥種子置于不含潮霉素的1/2MS培養基上， 4Gc黑暗條件下春化處理48h后，轉到22^ 250C， 16h光照/8h黑暗條件下生長大 概1 2周，選取在兩種不同培養基上的轉基因陽性株和非轉基因對照株的株高、 大小、葉片數量、生長勢基本一致的幼苗同時移植到DON濃度為20ppm的MS培 養基上，繼續在相同環境下生長大概2 3周后，觀察分析轉基因陽性苗和非轉基 因CK對照苗在DON環境中的生長情況。結果如圖4所示在20ppm濃度的DON
培養基中，轉基因陽性植株的T2代幼苗的生長勢明顯要比非轉基因對照要好，由此
可證明T^"Gr基因能提高擬南芥對DON的抗性。將該基因轉化到易感赤霉病小 麥品種中，有望提高小麥對赤霉病的抗性，降低小麥籽粒中的DON的含量。<110> <120〉 <130> 〈140> <141> <160> <170〉 <210〉 <211〉 〈212> <213> <220> <221> <222> <223〉 <400> 1 ggccattacg gcctgac3ga tggcc卿gc taccatcccc ceitcaccacg gggcctggtg tgggtgcgag atgtgccgcg tagctgcatc catcccgagg ttttcacaac gttccctaca tatggagcaa c犯tagcttc g犯ggtctgg 朋g3ggaaac gccaggctca tgttgaactg aggagctaag agacagaggt cgttggEigga tgtgcccatg gg3tgtgctg a肪ccaggag tgaaggggag gagggctttc gggaaacaag aacatgaagt acaggtgatt
序列表
南京農業大學
二"酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因及其所編碼的蛋白質 說明書
00
2008-07-03 4
Patentln version 3. 1
1
1771 DNA
小麥(Triticura asetiv咖
Ta-UGT基因cDNA全長序列 (l).. (1771)
gccggggga3cacactacggttgccattgcaccgcttccaagccctccca60
ctccactagcacttcagccg3tcagcc8tgaccttcgccggcagcggtga120
ggctctgcgagggcgcacttcgtgctggtacccatgatggctcaaggccg180
atgaccgacatggcgtgcctgctggcagagcatggcgcgcaggtcagctt240
ccggtcaacgccgctaggttgg肌ggcttcgccgctaaggtggaggcggc300
gttcagctcgtggagctccacttcccgagtgt卿gttcggcctaccaga360
aacctcgscatgatccaatcaaagaatttgttctttaacttcatgaaggc420
ctgcatgagccgctcatggcgtacctccgtgagcagcagcgctcccctcc■
atatctgacatggcgcactggtggaccggtgEtcatcgC3agggagctegg540
ctcacctttagtggcttUgtggcttctcgtcccttgtcaggtacatcgt600
犯tgt3ttggagaatgtcacagatgacaatgagetcatcacgatcccggg660
ccgctagagttgacgaaggctaagttgcctggaaccctttgtgUccggg720
atccgtg縛aagatgtttgaggaggagctg卿tgcgstggtgagatcac780
3犯g縛ctcg3gac3ttgtacattgaatcctatgagc縛3840
8cgatcgggccaatgtgcctctgccaccga幼cagc幼c3gaacggccgc900
肪ggcgtcaatgg3tg鄉Cacagtgcttgcaatggcttgattc3agg朋960
gtgatctttgtgagttttggaagcctcgcttgcactacacctcaacaact1020
ggactgggacttgaagcctccaagaaaccatttgtUgggtgattaaagc1080
cttccagaagtcgagg犯tggctcgcagatgggttcgaggagegegtcaa1140
ctgatwtaaggggttgggcaccacagctcatgatcctgcagcacc肪gc1200
ttcgtfacgc3CtgCgggtggaactcaacaait卿gggcatctgtgc鄉1260
atcacatggccacwtttggggagcagtttttgaatgagaagetgettgt1320
caaatcgggatggaggttggagtgaaaggagtt3cacagtggggaagtga1380
gttatggttaccagagatgcgcagtgaacaccctgatggg1440
gCt3C卿ggagttgagaatgagagcagaagactgcgccattaaggcaag1500
gacgaggaaggttcttcttacaacaacgtaaggctgttaattcaagaaat1560
acgaatgcatgtggttgatagagattacctaagctcgctttttcagtgta1620
gaaacatcctagagtacatatatcatcatatagaattttgtaccaggctc1680
atttagagattatagatgatccaaatgaagggaatatc幼ttatcctctc1740
31771
2
496 PRT
小麥
(Triticum asetiv咖)
<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <幼0>
Met Thr Phe Ala Gly Ser Gly Asp Gly Gin Ser 1 5 10
His Phe Val Leu Val Pro Met Met Ala Gin Gly 20 25
ORF框氨基酸序列 (l).. (496)
2
Gly Ser Ala Arg Ala 15
Arg Thr lie Pro Met 30Thr
lie
Val
65
Ser
Gin
His
Ser
Arg 145
Ser
Val
ILeu
Met
Gly 225 Ser
Cys
Ala
Pro
Pro 305 Pro
Glu
lie
Val
lie 385 Phe
Val
Met
Glu
lie 465 Val
Asp
Thr
50
Glu
Val
Ser
Glu
Cys 130 Glu
Ser
Thr
Glu
Glu 210 Glu
Tyr
Leu
Ser
Gly 290 Gin
Phe
Trp
lie
Gly 370 Cys
Leu
Gly
Val
Gly 450 Lys
Arg
Met
35 Thr
Ala
Glu
Lys
Pro 115 lie
Leu
Leu
Asp
!>eu 195 Gin
lie
Glu
Cys
Met 275 Ser
Gin
Val
Leu
Arg 355 Gly
Ala
Asn
Val
Thr 435 Glu
Ala
Leu
Ala
Pro
Ala
Phe
Asn 100 Leu
lie
Gly
Val
Asp 180 Thr
lie
Thr
Gin
His 260 Asp
Val
Leu
Trp
Ala 340 Gly
Phe
Gly
Glu
Lys 420 Arg
Ala
Arg
Leu
Cys
Val
Gly
Gly
85
Leu
Met
Ser
lie
Arg 165 Asn
Lys
Arg
Asn
lie 245 Arg
Glu
lie
Val
Val 325 Asp
Trp
Val
Val
Lys 405 Gly
Asp
Thr
Arg
lie 485
Leu
Asn
Leu
70
Leu
Phe
Ala
Asp
Pro 150 Tyr
Glu
Ala
Glu
Ser 230 Thr
Asn
Ala
Phe
Glu 310 lie
Gly
Ala
Thr
Pro 390 Leu
Val
Ala
Glu
Ala 470 Gin
Leu
Ala
55
Val
Pro
Phe
Tyr
Met 135 Arg
lie
Leu
Lys
Lys 215 Phe
Arg
Ser
Gin
Val 295 Leu
Lys
Phe
Pro
His 375 Met
Leu
Thr
Val
Glu 455 Phe
Glu
Ala
40
Ala
Val
Asp
Asn
Leu 120 Ala
Leu
Val
lie
Leu 200 Met
Lys
Lys
Asn
Cys 280 Ser
Gly
Ala
Glu
Gin 360 Cys
lie
Val
Gin
Glu 440 Leu
Asp
Met
Glu
Arg
Gin
Gly
Phe 105 Arg
His
Thr
Phe
Thr 185 Pro
Phe
Glu
Lys
Arg 265 Leu
Phe
Leu
Gly
Glu 345 Leu
Gly
Thr
Asp
Trp 425 Thr
Arg
Glu
Gly
His
Leu
Leu
Cys
90
Met
Glu
Trp
Phe
His 170 lie
Gly
Glu
Leu
Val 250 Thr
Gin
Gly
Gly
Ala 330 Arg
Met
Trp
Trp
Val 410 Gly
Ala
Met
Glu
Asn 490
Gly
Glu
Val
75
Glu
Lys
Gin
Trp
Ser 155 Asn
Pro
Thr
Glu
Glu 235 Trp
Ala
Trp
Ser
Leu 315 Lys
Val
lie
Asn
Pro 395 Leu
Ser
Val
Arg
Gly 475 Lys
Ala
Gly
60
Glu
Asn
Ala
Gin
Thr 140 Gly
Asn
Gly
Leu
Glu 220 Thr
Thr
Ala
Leu
Leu 300 Glu
Leu
Lys
Leu
Ser 380 His
Gin
Glu
Asn
Ala 460 Ser
Thr
Gin
45
Phe
Leu
Leu
Cys
Arg 125 Gly
Phe
Val
Phe
Cys 205 Leu
Leu
lie
Arg
Asp 285 Ala
Ala
Pro
Asp
Gin 365 Thr
Phe
lie
Asn
Thr 445 Glu
Ser
Asn
Val
Ala
His
Asp
Ala 110
Ser
Asp
Cys
Leu
Pro 190 Val
Arg
Tyr
Gly
Gly 270 Ser
Cys
Ser
Glu
Arg 350 His
lie
Gly
Gly
Gin 430 Leu
Asp
Tyr
Ala
Ser
Ala
Phe
Met
95
Ala
Pro
lie
Gly
Glu 175 Thr
Pro
Cys
lie
Pro 255 Asn
Arg
Thr
Lys
Val 335 Gly
Gin
Glu
Glu
Met 415 Glu
Met
Cys
Asn
Cys 495
Phe
Lys
Pro
80
lie
Leu
Pro
Ala
Phe 160 Asn
Pro
Gly
Asp
Glu 240 Met
Lys
Lys
Thr
Lys 320 Glu
Leu
Ala
Gly
Gin 400 Glu
Val
Gly
Ala
Asn 480 Gly
<210〉 3 <211> 28<212> ■ <213>人工合成 <220>
<221> 引物Ta-UGT-B <222> (l)..咖 <223> <柳> 3
ctggatcccc agcctgacag actccact
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213>人工合成
<220>
<221> .引物Ta-UGT-K <222〉 (l)..咖 <223> <400〉 4
Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys 1 5 Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly 20
Cys Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly
10 15 Gly Thr Ala Cys Ala 2權利要求
1、二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因Ta-UGT，來自小麥(Triticum asetivumL.)望水白品種，命名為Ta-UGT基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2、 權利要求1所述二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因rfl-f/Gr編碼的蛋白質，命名 為Ta-UGT蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
全文摘要
本發明公開了一個二磷酸尿核甘葡萄糖基轉移酶基因(Ta-UGT)及其所編碼的蛋白質，屬于基因工程領域。二磷酸尿核甘葡萄糖基因(Ta-UGT)的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，該基因來自小麥(Triticum asetivum L.)望水白，為小麥中首次報道，受deoxynivalenol(DON)誘導增強表達。試驗證明，該基因的過量表達可以提高植物對DON的抗性。Ta-UGT導入易感赤霉病小麥品種，有望降低小麥籽粒中DON的含量。
文檔編號C12N15/54GK101314776SQ20081002241
公開日2008年12月3日 申請日期2008年7月11日 優先權日2008年7月11日
發明者亓增軍, 劉大鈞, 曹愛忠, 王秀娥, 邢莉萍, 陳佩度, 馬璐琳 申請人:南京農業大學