一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法

專利名稱：一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法
技術領域：
本發明屬于DNA微陣列芯片的制備技術，特別涉及一種無需激發劑的丙烯酰 胺凝膠微陣列芯片的快速制備方法。二、 背景技術現有技術DNA芯片的制作方法主要有點樣法和原位合成法。與原位合成法 相比，點樣法具有機動性強、制備快速的特點，因此能夠用于大多數的科學研究 和臨床檢測中。無論哪種方法制備出的核酸芯片，核酸固定的穩定性和探針雜交 的高效率是影響目的信號檢測準確度和靈敏性的兩個主要因素。目前，已經有多 種化學固定核酸的方法，例如通過不同的化學方法處理芯片后，可以將核酸固定 在玻片，石英以及塑料等不同基片上。然而，這些方法對核酸的固定效率往往都 很低，需要用人工合成的大量寡核苷酸或通過對大量純化的PCR產物的固定，才 能達到信號的檢測要求。具有三維結構的凝膠芯片對核酸有很強的的固定能力， 如聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠已經被用于三維凝膠芯片的制備。這兩種方法都 是事先在基片表面制備出凝膠膜，爾后通過一定的化學反應將具有氨基或醛基修 飾的核酸與凝膠膜相交聯，然而這兩種方法在固定DNA過程中，仍需要用化學 反應的方法來激發凝膠，因此核酸固定的過程顯得不夠穩定和方便；而且制備出 的凝膠芯片有很強的背景信號。Rehman等發展了一種將5'端帶有丙烯酰胺基團 修飾的核酸直接參入到丙烯酰胺凝膠的聚合反應中，該方法進一步增大了對核酸 的固定能力，(可以達到200fmol/mm2),而且凝膠對核酸固定非常牢固。在該 制備方法中，由于丙烯酰胺預聚混合物中同時含有催化劑和激發劑(兩者同時存 在會加速凝聚)，所以很難制備出均一的凝膠芯片。2004年Rubina在準備預聚 物時不使用激發劑，先制備出均一的陣點，再采用紫外照射聚合的方法解制備出 了均 一 的凝膠芯片。然而這種采用紫外光照的方法對于需要固定的核酸破壞作用 極大，因此該法^艮少:故應用。2005年XPF改進了 Rehman制備方法，先制備出不 含有激發劑的預聚物均一微陣列，而后將其置于盛有激發劑的器皿中進行真空抽 慮。由于激發劑具有揮發作用，當起揮發到預聚物陣列表面時，通過對預聚物中催化劑的激發而是丙烯酰胺發生聚合反應，從而將核酸固定于凝膠中。該方法能 夠制備的凝膠芯片可以用來進行高通量核酸檢測。但是該聚合方法主要聚合過程 較緩慢，而且激發劑-四曱基乙二胺，容易造成凝膠芯片的高背景，并且是一種 具有刺激性氣味的毒性氣體。所以，目前科研和醫學診斷中急需一種省時省力、 快速、簡單方便和具有低背景的三維凝膠制備新技術。三、發明內容技術問題本發明針對上述技術缺陷，提供一種基于凝膠固定核酸的DNA 微陣列芯片的快速制備方法，尤其涉及一種無需激發劑(四甲基乙二胺)的三維 凝膠的微陣列芯片的快速制備方法，由本發明制得的DNA微陣列檢測芯片具有 高的檢測準確性和靈敏性、極好的重復性、均一性和低凝膠背景等優點，可以廣 泛應用于科研和臨床檢測診斷之中。該制備凝膠芯片的方法具有簡單、易操作、 芯片的制備時間短以及能防止芯片遭受外源污染等優點。技術方案本發明的技術解決方案為 一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片 的制備方法，制備步驟為首先將丙烯酰胺基團修飾的核酸、丙烯酰胺、凝膠聚 合催化劑、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，預聚合物中核酸的濃度在 0.0005 ~ 100uM,丙烯酰胺質量濃度在1~30%,凝膠聚合催化劑質量濃度在 0.001 ~2%，丙三醇的質量濃度為10~55%;將預聚合物點樣于固體基片上，點 樣完成后直接對基片進行加熱，加熱完成后即得三維凝膠微陣列芯片。丙烯酰胺 修飾的核酸是經過化學合成的有5，或3'末端修飾有丙烯酰胺的寡核苷酸，或是經 過帶有丙烯酰胺修飾的引物經聚合酶鏈式反應擴增或滾環擴增或其他任何形式的 基因擴增所得的核酸產物。丙烯酰胺為丙歸酰胺單體和曱叉丙烯酰胺單體的混合 物，丙烯酰胺單體和曱叉丙烯酰胺單體的混合質量比為5:1 ~ 50:1。固體基片為硬 質基片或軟質基片。凝膠聚合的催化劑為過硫酸銨或核黃素。對基片進行加熱的 加熱溫度為60~120°C,加熱時間為1-3分鐘。硬質基片玻片、硅片、陶瓷或 金屬，或軟質基片塑料、尼龍膜。有益效果本發明提供了一種新穎的凝膠芯片的制備方法。本發明方法制備 凝膠芯片具有以下優點a.檢測核酸的準確性與靈敏度高。由于芯片上的預聚物 點在短時間內吸收了大量的熱，預聚物中的水分會迅速蒸發，蒸發產生的推動力 會使凝膠迅速收斂凝聚，所以凝膠內的固定的核酸濃度會增大，最終檢測的信號 強度也會相應提高，這樣核酸檢測的準確性與靈敏度高就會得到改善。b.極好的 重復性與均一性(見圖1.) 。 c.較低的背景。由于凝膠的過程是采用加熱聚合 的方法，而加熱能夠有效避免凝膠對熒光性雜質的翁附，加上無需使用激發劑四曱基乙二胺(會污染凝膠使其背景升高)，所以凝膠背景信號能得到極大的降 低。d.該制備凝膠芯片的方法具有簡單、易操作、芯片的制備時間短。預聚物的 聚合僅需在1 ~ 3分鐘的加熱時間即可完成。四

圖1為利用該方法制備出的12 x 5陣列的凝膠芯片。五具體實施方式
實施例1一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，制備步驟為首先將丙烯 酰胺基團修飾的核酸、丙烯酰胺、凝膠聚合催化劑、丙三醇和水混合成預聚合 物，其中，預聚合物中核酸的濃度在0.0005uM,丙烯酰胺質量濃度在1%,凝 膠聚合催化劑質量濃度在0.001%，丙三醇的質量濃度為10%;將預聚合物點樣 于固體基片上，點樣完成后直接對基片進行加熱，加熱完成后即得三維凝膠微陣 列芯片。丙烯酰胺修飾的核酸是經過化學合成的有5'末端修飾有丙烯酰胺的寡核 芬酸，丙烯酰胺為丙烯酰胺單體和甲叉丙烯酰胺單體，質量比為50:1的混合物。 固體基片為硬質基片或軟質基片。凝膠聚合的催化劑為過舉酸銨或核黃素。對基 片進行加熱的加熱溫度為60°C,加熱時間為1分鐘。硬質基片可以為玻片、硅 片、陶乾片或金屬片，也可以是軟質基片塑料片、尼龍膜。實施例2一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，制備步驟為首先將丙烯 酰胺基團修飾的核酸、丙烯酰胺、凝膠聚合催化劑、丙三醇和水混合成預聚合 物，其中，預聚合物中核酸的濃度在100uM，丙烯酰胺質量濃度在30%,凝膠 聚合催化劑質量濃度在2%,丙三醇的質量濃度為55%;將預聚合物點樣于固體 基片上，點樣完成后直接對基片進行加熱，加熱完成后即得三維凝膠微陣列芯 片。丙烯酰胺修飾的核酸是經過化學合成的有3'末端修飾有丙烯酰胺的寡核苷 酸，丙烯酰胺為丙烯酰胺單體和曱叉丙烯酰胺單體，質量比為29:1的混合物。固 體基片為硬質基片或軟質基片。凝膠聚合的催化劑為過硫酸銨或核黃素。對基片 進行加熱的加熱溫度為120°C，加熱時間為3分鐘。硬質基片可以為玻片、硅 片、陶瓷片或金屬片，也可以是軟質基片塑料片、尼龍膜。實施例3一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，制備步驟為首先將丙烯 酰胺基團修飾的核酸、丙烯酰胺、凝膠聚合催化劑、丙三醇和水混合成預聚合 物，其中，預聚合物中核酸的濃度在50uM,丙烯酰胺質量濃度在20%,凝膠 聚合催化劑質量濃度在1%,丙三醇的質量濃度為25%;將預聚合物點樣于固體 基片上，點樣完成后直接對基片進行加熱，加熱完成后即得三維凝膠微陣列芯 片。丙烯酰胺修飾的核酸是經過帶有丙烯酰胺修飾的引物經聚合酶鏈式反應擴增 或滾環擴增或其他任何形式的基因擴增所得的核酸產物。丙烯酰胺為丙烯酰胺單 體和曱叉丙烯酰胺單體，質量比為5:1的混合物。固體基片為硬質基片或軟質基 片。凝膠聚合的催化劑為過硫酸銨或核黃素。對基片進行加熱的加熱溫度為 90。C，加熱時間為2分鐘。硬質基片可以為玻片、硅片、陶瓷片或金屬片，也可 以是軟質基片塑料片、尼龍膜。實施例4.利用該方法制備出的凝膠芯片同時對500個人的同一 SNP位點進行分型。5' - GCTTTCTTGTTTGTTTTCCCTCCTTTACCAY ( C/T) CCAGAAATCCATTTGAGTCTGCTCCTTGT - 3' 序列中的Y ( C/T ),是一個與高血稠脂肪蛋白基因突變(Homo sapiens dystrobrevin binding protein 1, DTNBP1 )有關的一個基因位點。通過一對引物 (反向引物具有丙烯酰胺修飾)用PCR分別擴增出500.個人的含有該位點一段基 因序列，直接將5-10pl PCR產物或純化過的產物與丙烯酰胺、過好,酸銨、丙三醇 和水混合成預聚合物，并將其轉移到384孔板中，通過芯片點樣儀將500個樣點 在同一張玻片上點成微陣列。然后將該芯片置于80。C加熱2分鐘后取出，用 NaOH將固定在凝膠上的雙鏈DNA變性，從而制備出具有單鏈DNA的凝膠微陣 列芯片。最后將該微陣列與一對焚光檢測探針(5'-Cy5-TTTAC CACCCAGAA-3' 和5'-Cy3-TTTACCArCCAGAA-3，)雜交，由于正配的探針與序列可以雜交而錯 配的不可以或雜交極少，最后通過對Cy5和Cy3熒光的雙色掃描，并根據每個樣 本雙色熒光強度的比值大小就可以對500人的SNP分型情況進行準確判斷。實施例5.利用該方法制備出的凝膠芯片用于高通量基因測序將一個通用的PCR反向引物用丙烯酰胺修飾，而另 一個正向的引物不修飾。 將上述反向引物與與丙烯酰胺、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預聚合物，點于芯 片上。用與例l.中同樣加熱方法快速制備出含有擴增引物的凝膠微陣列芯片。將 一個較大的基因組DNA用超聲波打斷，然后在每個片段的兩端分別連接上同一通用連接子(與固定在凝膠中的反向引物互補)。用PCR擴增溶液(含有Taq 酶，緩沖液、正向引物和dNTP)覆蓋在凝膠微陣列上，使每一個凝膠微陣列陣 點中平均分配一個DNA片段或沒有，而后將凝膠陣點外多余溶液去除。再用石 蠟油將微陣列陣點密封，進行在片PCR擴增35循環。接著用NaOH將擴增的雙 鏈DNA進行變性處理。這樣每個凝膠微陣列的陣點就只包含有單克隆的DNA片 段。最后將凝膠DNA微陣列用于SOLEX基因測序。實施例6.利用該方法制備出的凝膠芯片對800個人P16內含子I區的CpG島進行曱基化檢測直接把800個人的血樣適當稀釋后作為擴增模板，用一個正向引物和一個具 有丙烯酰胺基團修飾的反向引物進行PCR擴增。擴增后將PCR產物用四倍的無 水乙醇沉淀1小時，離心后去上清，將沉淀配成5%的丙烯酰胺預聚物，其中不 含有TEMED,將這些樣品預聚物移入384孔板，用芯片點樣儀點樣。對芯片直 接進行80。C加熱2分鐘，然后用緩沖液沖洗一遍。再用NaOH進行變性處理，并 用去離子水清洗一遍。再用亞硫酸鈉處理芯片上固定的單鏈DNA，并用緩沖液沖 洗一遍。最后同檢測探針雜交后進行圖像掃描，通過掃描圖像就可以對800個樣 品的CpG島的曱基化情況進行準確判斷。
權利要求
1.一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其特征在于制備步驟為首先將丙烯酰胺基團修飾的核酸、丙烯酰胺、凝膠聚合催化劑、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，預聚合物中核酸的濃度在0.0005～100uM，丙烯酰胺質量濃度在1～30％，凝膠聚合催化劑質量濃度在0.001～2％，丙三醇的質量濃度為10～55％；將預聚合物點樣于固體基片上，點樣完成后直接對基片進行加熱，加熱完成后即得三維凝膠微陣列芯片。
2. 根據權利要求1所述的無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其 特征在于所述丙烯酰胺修飾的核酸是經過化學合成的有5，或3，末端修飾 有丙烯酰胺的寡核苦酸，或是經過帶有丙烯酰胺修飾的引物經聚合酶鏈 式反應擴增或滾環擴增或其他任何形式的基因擴增所得的核酸產物。
3. 根據權利要求1所述的無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其 特征在于所述丙烯酰胺為丙烯酰胺單體和曱叉丙烯酰胺單體的混合物，丙 烯酰胺單體和甲叉丙烯酰胺單體的混合質量比為5:1 ~ 50:1。
4. 根據權利要求1所述的無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其 特征在于所述固體基片為硬質基片或軟質基片。
5. 根據權利要求1所述的無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其 特征在于所述凝膠聚合的催化劑為過硫酸銨或核黃素。
6. 根據權利要求1所述的無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其 特征在于所述對基片進行加熱的加熱溫度為60-12CTC,加熱時間為1~ 3分鐘。
7. 根據權利要求4所述的無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其 特征在于所述硬質基片玻片、硅片、陶瓷或金屬，或軟質基片塑料、 尼龍膜。
全文摘要
一種無需激發劑三維凝膠微陣列芯片的制備方法，其特征在于制備步驟為首先將丙烯酰胺基團修飾的核酸、丙烯酰胺、凝膠聚合催化劑、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，預聚合物中核酸的濃度在0.0005～100uM，丙烯酰胺質量濃度在1～30％，凝膠聚合催化劑質量濃度在0.001～2％，丙三醇的質量濃度為10～55％；將預聚合物點樣于固體基片上，點樣完成后直接對基片進行加熱，加熱完成后即得三維凝膠微陣列芯片。由本發明制得的DNA微陣列檢測芯片具有高的檢測準確性和靈敏性、極好的重復性、均一性和低凝膠背景等優點，可以廣泛應用于科研和臨床檢測診斷之中。
文檔編號C12Q1/68GK101230398SQ20081002079
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月27日 優先權日2008年2月27日
發明者李燕強, 潘志強, 肖鵬峰, 陸祖宏 申請人:東南大學