專利名稱：一種病毒或細菌的濃縮方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌和病毒的濃縮方法，屬于生物技術領域。
技術背景殼聚糖(Chitosan)又名脫乙酰甲殼素，分子式是[CeHuN04]n,是甲殼 素上的乙酰胺基脫去乙酰基而形成的，同時聚合度降低。殼聚糖來源豐富， 成本低廉，且有良好的吸附性能和生物相容性，安全無毒，在醫藥、化工 和農業等領域應用廣泛。殼聚糖用脫除乙酰基的鏈節數占總鏈節數的百分 數表示它的脫乙酰度， 一般大于70%，其脫乙酰度與其吸附特性相關。殼聚糖經交聯劑作用后易形成微球，常用的制備方法有乳化交聯法， 即將原料品溶解或分散于殼聚糖醋酸溶液中，混勻后加入到含有表面活性 劑的油相中，經攪拌或超聲處理，形成W/0型乳劑，用戊二酸等進行化學 交聯，通過離心，純化制得；溶劑蒸發法，即將溶有原料品的殼聚糖醋酸 溶液加入到甲苯中，經超聲處理，形成W/0型乳劑，加入含戊二醛的甲苯， 室溫下攪拌，離心后蒸發溶劑制得微球；復乳法，即將原料品溶于有機溶 液中，然后再分散于殼聚糖醋酸溶液中，形成0/W型乳劑，再滴加到油相 中制成W/0/W型復乳，通過常壓加熱(或減壓)或透析方法除去有機溶劑 制得微球；凝聚法，即將硫酸鈉或硫酸氨或三聚磷酸鈉溶液滴入攪拌著的 含吐溫-80的殼聚糖醋酸溶液中，經超聲或攪拌處理制得。前三種方法都要 應用有機溶劑，對多肽等生物活性物質的活性影響大，而第四種方法因不 使用有機溶劑，可克服其它方法的缺點，所用交聯劑亦為無毒無害物質，安全性好。應用凝聚法制備殼聚糖微球的方法己有數項專利申請，因所載原料品 物質不同和制備工藝不同而有多種不同用途。如名為"離子交聯制備藥 物緩釋用殼聚糖微球的方法"的99121128. 6號申請專利是將1 8 %含藥 物的殼聚糖溶液，再加入1 8%明膠或瓊脂糖或者瓊脂，攪拌均勻，然 后在3 0 6 0 。C恒溫2 5小時，通過針頭滴加入一 1 0 1 5 T冷的 植物油中，2 0 4 0分鐘后，加入0 . 1 5%冷的三聚磷酸鈉或硫酸 鈉或檸檬酸鈉交聯離子溶液，輕微攪拌2 0 4 O分鐘后過濾，水洗干燥 即可，此發明使制備的大粒徑殼聚糖微球的機械性能得到顯著的提高，并 能方便地制備形態好、粒徑小的殼聚糖微球。名為"一種殼聚糖微球/微囊 及其制備方法"的200510055380. X號申請專利是將油相和占其0. l 4v% 的表面活性劑一起攪拌；加入O. 5 5X(w/v)的殼聚糖溶液(水相)，殼聚糖 溶液與油相的體積比是1 : 2 20，繼續攪拌；再加入濃度為l 65%(w/v) 的硫酸銨溶液，硫酸銨溶液與殼聚糖溶液的體積比為l : 1 20，繼續攪拌； 離心分離，分出沉淀物經洗滌干燥，即得微球。名為"一種具有生物活性 藥物的殼聚糖微球及其制備方法"的200510055381. 4號申請專利是將生物 活性藥物溶解或分散于殼聚糖的溶液中，與加有表面活性劑的油相物質混 合，經攪拌形成穩定的乳液后加入一定濃度的硫酸銨水溶液，攪拌沉淀一 定時間后分離洗滌，真空干燥后即得到包埋了生物活性藥物的粒徑均一的 殼聚糖微球控釋載體。微球亦不關注其成球性狀。其安全性好，操作簡便，成本低廉。 液體培養的細菌產物濃縮技術通常采用離心沉淀和靜置沉淀的方法。離心沉淀法一般采取3500-5000rpm離心15-25分鐘，傾去上清取沉淀，可 將培養物濃縮10倍以上，但需消耗大量電能，且受機械限制，難于大規模 生產。靜置沉淀法是將培養物于室溫或低溫(4-10°C)下靜止放置，讓菌 體自然沉淀，吸出上清達到濃縮的目的， 一般需放置5天以上，最大濃縮 比例難于超過3倍。病毒的濃縮技術通常采用高速離心法和超濾法。高速離心法一般采取 12000-15000rpm離心20-30分鐘，傾去上清取沉淀，可將培養物濃縮10 倍以上，但需消耗大量電能，且受機械限制，難于大規模生產。超濾法是 應用專門設備，將病毒培養物中的水份除去，將病毒顆粒濾下達到濃縮目 的，可將培養物濃縮10倍以上，缺點是生產成本高，生產速度和效率易受 機械限制。 發明內容技術問題本發明的目的是用一種安全、廉價且高效的方法將懸浮于 培養液中的細菌或病毒濃縮5倍以上。技術方案具體步驟是，將0.1 1% (W/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖脫 乙酰度為75 90%，分子量3000-300000)加入5 15倍量的細菌或病毒培 養液中，在100~300rpm攪拌下室溫作用5~30分鐘，再加入1~30%的三聚 磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨交聯吸附了細菌或病毒的殼聚糖，繼 續攪拌15 50分鐘使其充分作用形成微球，自然靜置2 10小時待其自然沉 淀至1/6以下時將上清吸去，收取沉淀即得濃縮的細菌或病毒。有益效果與現有申請專利不同的是本發明的目的是用于細菌和病毒 的濃縮，而不是制備微球作為載體或直接制備載藥微球。所用試劑僅為殼聚糖和三聚磷酸鈉或硫酸鈉或擰檬酸鈉或硫酸氨兩種。將懸浮的細菌或病 毒沉淀后，僅需吸出上清達到濃縮的效果，并不需分離微球亦不關注其成 球性狀。其安全性好，成本低廉。整個工藝流程簡便，成本低廉，效率高， 易于大規模生產。本發明的優點是1、 無毒無害，安全性好本發明的方法中所用殼聚糖和三聚磷酸鈉或硫 酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨對細菌和病毒的蛋白成份都沒有破壞作用，在濃 縮過程中能將病毒和細菌的抗原性保持完好。2、 成本低廉本發明的方法中所用原材料來源廣泛，成本低廉，所用設 菌簡單，能耗極低，所費成本是傳統方法的1/3以下。3、 操作簡便本發明的操作流程極其簡便，所用試劑僅兩種，僅需在一 般性容器中慢速攪拌，微球形成后能快速自然沉淀，將上清吸出后即達到 濃縮的效果。4、 吸附沉淀效率高本發明的方法能將培養液中的細菌或病毒吸附95% 以上，形成微球后能沉淀至原液體積的1/5~1/10，達到高效濃縮的效果。5、 易于大規模生產傳統的離心法或超濾法等常受限于設備和能耗， 大規模生產難度大，本發明的方法能克服這些缺點，非常便于大規模生產。
具體實施方式
實例1、新城疫病毒濃縮將0. 5。/。(W/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖脫乙酰度為90%，分子量約200000) 加入8倍量的新城疫病毒雞胚尿囊液中，在200rpm攪拌下室溫作用15分 鐘，再加入16%的三聚磷酸鈉溶液交聯吸附了新城疫病毒的殼聚糖，繼續攪拌20分鐘使其充分作用形成微球，自然靜置5小時待其自然沉淀至1/5以 下時將上清吸去，收取沉淀即得濃縮5倍的新城疫病毒，通過檢測上清中 殘余新城疫病毒的HA效價證明其吸附率達97%以上。實例2、大腸桿菌濃縮將0. 69fe(W/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖脫乙酰度為85%，分子量約250000) 加入10倍量的大腸桿菌培養液中，在200rpm攪拌下室溫作用15分鐘，再 加入25%的硫酸鈉交聯吸附了細菌的殼聚糖，繼續攪拌20分鐘使其充分作 用形成微球，自然靜置6小時待其自然沉淀至1/6以下時將上清吸去，收 取沉淀即得濃縮6倍的細菌，通過對上清中的大腸桿菌的計數檢測證明吸 附率達95%。
圖1為病毒或細菌的濃縮操作流程圖。
權利要求
1、一種細菌或病毒的濃縮方法，具體步驟是，將質量體積比為0.1～1％的殼聚糖溶液加入5～15倍量體積的細菌或病毒培養液中，室溫下100～300rpm攪拌5～30分鐘，再加入1～30％的三聚磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨，繼續攪拌15～50分鐘，自然靜置2～10小時待其自然沉淀至1/6以下時將上清吸去，收取沉淀即得濃縮的細菌或病毒。
全文摘要
本發明涉及一種細菌和病毒的濃縮方法，屬于生物技術領域。將0.1～1％的殼聚糖溶液加入5～15倍量體積的細菌或病毒培養液中，室溫下100～300rpm攪拌5～30分鐘，再加入1～30％的三聚磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨，繼續攪拌15～50分鐘，自然靜置2～10小時待其自然沉淀至1/6以下，收取沉淀即得濃縮的細菌或病毒。本發明所用試劑僅為殼聚糖和三聚磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨兩種。將懸浮的細菌或病毒沉淀后，僅需吸出上清達到濃縮的效果，并不需分離微球亦不關注其成球性狀。其安全性好，成本低廉。整個工藝流程簡便，成本低廉，效率高，易于大規模生產。
文檔編號C12N7/00GK101245326SQ20081002079
公開日2008年8月20日 申請日期2008年2月27日 優先權日2008年2月27日
發明者侯繼波, 王繼春 申請人:江蘇省農業科學院