乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應用的制作方法

專利名稱：乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測周圍神經束性質的傳感器，具體地說是一種乙酰膽堿酯 酶壓電生物傳感器在檢測周圍神經束性質中的應用。
技術背景在現有的技術中，對神經束性質進行判斷的方式主要有以下幾種1、 解剖方式對神經干內的神經束的定位圖譜進行研究，很多學者已將周 圍神經(如正中神經、橈神經、尺橈神經干、坐骨神經干等)分別進行了分析， 觀察了神經干的位置、形態、束數，測量其大小，繪制了神經斷面的神經束局部 定位圖，但在臨床中，往往因神經損傷后兩斷端易發生扭曲，改變了原有的正常 解剖位置，故臨床應用收到限制。2、 電刺激法通過電刺激神經束所產生的反應來鑒別，若電刺激出現肌肉 收縮則為運動束，而感覺束則無反應。但此法需保持病人清醒，且限于新鮮損傷， 個體差異大，而且刺激引起肌肉收縮是神經傳導結果還是電流擴散所致，不能區 分。故臨床應用價值不大。3、 放射生物化學法用放射性同位素標記酶的底物，再根據酶反應所產生 的放射性產物來測定酶的含量，推測神經束的性質，但此法涉及同位素技術，設 備要求高，且放射物質對患者及術者都有損害，故實用性不大。4、 酶組織化學法根據運動束與感覺束中某些生物含量物質的含量差別， 作為鑒別運動束與感覺束的標準，如運動束神經纖維中乙酰膽堿酯酶含量遠高于 感覺束，因此以乙酰膽堿酯酶含量為鑒別運動束與感覺束的方法得到廣泛認可。 目前檢測乙酰膽堿酯酶主要為酶組織化學染色法，根據反應形成亞鐵氰化銅(一 種棕色沉淀)出現于酶含量部位，運動纖維呈強陽性，感覺纖維大部位呈陰性， 少部分呈弱陽性的原理，對神經束性質進行判定。但此法存在問題是(1)染色 時間長(約50分鐘)，過程復雜；(2)需切取兩斷端神經片段，不能進行原位染 色。故臨床應用也收到一定的限制。5、 免疫組化法利用特異性抗原抗體反應，觀察研究組織細胞特定抗原(或 抗體)的定位和定量技術，發現了感覺神經元的特異蛋白，并以該蛋白作為抗原 制備了單克隆抗體，通過免疫染色來鑒別感覺纖維，其特點是特異性高，對人體無毒，染色時間較以往方法縮短，需25至30分鐘。但這種方法現階段仍需要切取組織片段，且存在染色特異性與時間問題，時間過短染色不深，過長則其它組織亦染上色，臨床醫生難以控制，且操作比較復雜，實用性不夠。目前，生物傳感器在生物醫學中得到了廣泛應用，主要表現在以下方面1、 免疫生物傳感器壓電免疫傳感器在生物學領域應用十分的廣泛，檢測范圍不斷拓寬，可以用 來檢測環境中的硫磷農藥、有機磷神經毒氣、可卡因，白色念珠菌、大腸桿菌、 沙門氏菌、皰疹病毒、甲肝乙肝病毒、霍亂弧菌等病原微生物的檢測，人的補體、 酶等蛋白質分析，甲狀腺素、人絨毛膜性腺激素、皮質醇等激素檢測，血液中紅 細胞、T細胞及粒細胞含量測定，此外還可用于免疫反應的動力學分析，可對免 疫反應過程進行實時監測。2、 DNA生物傳感器最初被用于測定RNA/DNA分子雜交反應，現在可以用于對DNA與蛋白質的分 子交聯，DNase、 RNase、 DNA連接酶的水解、聚合、連接功能的實時、原位監控 檢測及分子雜交過程的動力學分析，食品的衛生檢測等。3、 仿生傳感可以用來模擬人或生物的嗅、味覺感官細胞，早期主要是采用與之功能相近 的類脂或既親水又親脂的高分子物質來修飾壓電晶體表面，從而對香味或氣味物 質、苦味或甜味食品實現物品種類、濃度及作用機理的判定；最近被用于實現多 組分同時測定，采用分子印記技術提高傳驊器選擇性和使用壽命，采用人工神經 網絡等化學計量學方法用于仿生傳感可對數據進行智能化處理。此外，將酶、細胞固定于晶體表面可制成酶、細胞傳感器，除了使用單一酶 外，采用多種酶構成復合酶傳感器亦有報道。到目前為止，未見有關于檢測乙酰 膽堿酯酶含量的壓電生物傳感器的報道。發明內容為了克服以往對神經束性質進行判斷方法的不足，本發明的目的是提供一種 乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應用及其使用方法。該生物 傳感器從周圍神經運動束與感覺束中的乙酰膽堿酯酶(AchE)含量的差別入手， 可快速檢測AchE的壓電生物傳感系統、快速鑒別出周圍神經運動束與感覺束， 實現運動束對運動束、感覺束對感覺束正確縫合。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應用，其特征在于它通過在石英晶體上固定的乙酰膽堿酯酶抗體與待測神經樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起反應，反應過程中發生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計算機監 測系統檢測并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測神經束為運動束， 含量低的待測神經束則為感覺束。本發明中，使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質時，包括以 下步驟1) 石英晶體芯片上結合戊二醛；2) 在石英晶體芯片上標記乙酰膽堿酯酶抗體；3) 剪取l 2mm神經片斷，放入200ul改良細胞裂解液中振蕩數次；4) 將振蕩后的改良細胞裂解液加入進樣孔，在監測器上觀察到乙酰膽堿酯酶的含量高低變化，含量髙的神經束為運動束，反之則為感覺束。在等待180秒之后在監測器上觀察乙酰膽堿酯酶的含量變化。本發明所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器，由壓電晶體、振蕩電路、差頻電路、頻率計數器及計算機等部分組成。使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的流程見圖1。本發明所述改良細胞裂解液為0.5%Triton X-100細胞裂解緩沖液，配方如下Triton X-100 0.5%調節pH至7.4， -7(TC保存 PMSF (100,1/L) Na3V04 (200mmol/L) Cocktail Calyculin ATris E腦 Sucrose5mmol/Lv 2mmol/L 0.3mol/L臨用前加 5 y 1/ml 5 u 1/ml10u 1/ml 1. 0 w g/ml
本發明通過膽堿酯酶抗體與結合在石英晶體芯片表面的戊二醛交聯，在晶體 表面包被膽堿酯酶抗體，待測神經樣品中若有與之相對應的乙酰膽堿酯酶抗原， 則與待測神經樣品中乙酰膽堿酯酶的特異性結合，增加了晶體的質量并改變振蕩 頻率。頻率的變化與待檢測神經內所含得乙酰膽堿酯酶抗原的濃度呈正比，這種 變化可以通過電信號從監測器中直觀的反應出來，既準確又方便。①Sauerbrey導出壓電石英晶體頻率變化A F與晶體表面均勻吸附外加質 量厶M的關系為厶F=-F2 A M/ (ANp)
式中，AF是石英晶體的頻率、F2是諧振頻率、AM是晶體表面的沉積質量、A是參與晶振的面積、N是頻率常數、p是晶體密度。 ②由經驗公式AF^:dd"2 + C2 11172—c3e —c4k +c。式中d代表液體的密度、il代表粘度、e代表介電常數、ic代表電導率，Cl、 c2、 c:,、 c4 、 c。分別是由晶體和電路決定的常數。可得石英晶體在液相中有穩 定的振蕩頻率。由此可以看出當外來物質沉積于石英晶體表面時，其質量的變化于諧振頻率 的變化成正比。本發明采用戊二醛交聯法首先在晶體金屬表面建立一層惰性疏水物質，主 要是聚乙烯亞胺和3-氨丙基-三乙氧基硅烷，然后再用戊二醛作為交聯試劑乙酰 膽堿酯酶抗體結合。戊二醛是一種常用的雙功能基試劑，很容易使蛋白質交聯， 這種交聯是通過蛋白質中賴氨酸殘基進行的。本發明采用目前使用較為廣泛的固定方法。固定化之前，首先在基質表面上 建立一層聚乙烯亞胺(PEI)或r-氨丙基三乙氧基硅垸(3-APTES)惰性疏水性 水性物質，然后用交聯試劑聯接乙酰膽堿酯酶抗體。戊二醛是一個常用的雙功能 團交聯試劑，極易與蛋白中賴氨酸殘基交聯。具體方法如下① PEI固定法室溫下用含4M(V/V)的PEI甲醇5ml涂在晶體的電極上， 干燥后用甲醇沖洗晶體，然后浸入濃度為0. 4mol/L戊二醛(P^7)溶液中30min, 然后用低濃度抗原溶液涂在晶體兩側，未發生反應的水合醛類用0. 5mol/L的甘 氨酸(在20mmol/LPBS中，pH7)封閉，隨后用PBS和蒸餾水沖洗，空氣中干澡。② 硅垸(APTES)固化法把晶體浸入35咖ol/L的APTES的丙酮溶液中lh， 在7(TC條件下真空干燥，用丙酮洗幾次，在0.6raol/L的戊二醛(pl^7)中孵育1 h，然后用蒸餾水洗，再用5ul的5mg/ml抗原液涂在晶體的兩側，干燥 3(T45min，晶體用PBS和蒸餾水沖洗之后，在空氣中干燥。本發明將壓電生物傳感器技術應用到周圍神經運動束與感覺束的鑒別，利用 生物傳感器靈敏、快速、準確、特異性強的特點，制成了可以檢測乙酰膽堿酯酶 含量的壓電生物傳感器。該傳感器可以檢測每根神經束上乙酰膽堿酯酶的含量， 原理是在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與神經樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起 反應，反應過程中有石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計算機監測系統檢測并 反映出乙酰膽堿酯酶的含量髙低，含量高的神經束為運動束，反之則為感覺束。 整個反應過程在3分鐘之內，較以往方法大大縮短了時間，使用方便，滿足了臨 床要求并減少了誤差及干擾。通過動物實驗取得了較好的效果。與現有技術相比，本發明的顯著優點是-① 該檢測裝置簡單而且靈敏度高達10—12mol/L，因此樣本不需特別處理，而 且只需切取極少組織就能檢測出很明顯地差異；② 檢測效率很高， 一個樣本只需3分鐘；③ 由于檢測樣本中的物質是通過抗原和抗體的形式結合的，因此特異性很高；④ 此裝置可以實時定量的檢測樣本中需檢測的物質，可以形象直觀的在計 算機上顯示出來；⑤ 檢測物質不需要事先做任何物理、化學修飾；⑥ 芯片可以反復多次應用等優點。因此改裝置可以做到快速、準確、直觀地 鑒定神經斷端兩側神經束地性質，方法簡單快捷，無需化學試劑，對人體無害， 實現機械化、集成化和智能化。這種鑒別周圍神經束性質的壓電生物傳感器，將為周圍神經損傷后地顯微外 科修復提供一種快捷有效的方法，大大提高周圍神經損傷修復后的功能恢復率。 有利于在以后的臨床應用中得到廣泛推廣。


圖1是使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的流程圖； 圖2是采用本發明得到的動物實驗結果曲線圖。
具體實施方式
一種本發明所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應 用，它通過在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與待測神經樣本中所含的乙酰膽堿 酯酶起反應，反應過程中發生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計算機監測系 統檢測并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測神經束為運動束，含量 低的待測神經束則為感覺束。乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器由壓電晶體、振蕩電 路、差頻電路、頻率計數器及計算機等部分組成。使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳 感器在檢測神經束性質中的流程見附圖1。首先在石英晶體芯片上結合戊二醛；然后在石英晶體芯片上標記膽堿酯酶抗 體；剪取1 2皿神經片斷，放入200ul改良細胞裂解液中振蕩數次；將振蕩后 的改良細胞裂解液加入進樣 L，在等待180秒之后，在監測器上觀察到乙酰膽堿 酯酶的含量高低變化，含量高的神經束為運動束，反之則為感覺束。本發明將壓電生物傳感器技術應用到周圍神經運動束與感覺束的鑒別，利用 生物傳感器靈敏、快速、準確、特異性強的特點，制成了可以檢測乙酰膽堿酯酶含量的壓電生物傳感器。該傳感器可以檢測每根神經束上乙酰膽堿酯酶的含量， 整個反應過程在3分鐘之內，較以往方法大大縮短了時間，使用方便，滿足了臨 床要求并減少了誤差及干擾。通過動物實驗取得了較好的效果。 動物實驗材料膽堿酯酶單克隆抗體(南京醫科大學抗體中心提供，犬坐骨神經、頸 叢神經、面神經，細胞裂解液，磷酸鹽緩沖液，1M Glycine, 10%谷胱甘肽溶液。 設備ADS plus Affinity Sensor壓電生物傳感器(臺灣ANT公司出品，亞新科 技股份有限公司提供)。實驗步驟1、 10%谷胱甘肽溶液孵育芯片10min。2、 抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋后(1: 1000)孵育芯片10min。3、 1 M Glycine孵育芯片lmin。4、 分別取犬坐骨神經、臂神經從、面神經斷端lmm，放入細胞裂解液中， 震蕩5-10s，放入ADS plus Affinity Sensor壓電生物傳感器中，讀取數據。 結果如圖2。(1) 運動神經1(2) 運動神經2(3) 運動神經3(4) 感覺運動混合神經1(5) 感覺運動混合神經2(6) 運動神經4(7) 運動神經4(8) 運動神經5(9) 感覺神經1(10) 感覺神經1(11) 感覺神經l(12) 感覺神經1備注GA:谷胱甘肽感覺和運動神經編號代表不同的標本來源。 結論；感覺、運動和混合神經，其膽堿酯酶的含量不同，通過本方法在傳感 器的顯示屏上呈現不同的曲線。差異明顯，并且重復性好。本法具有良好的可行
權利要求
1、一種乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應用，其特征在于它通過在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與待測神經樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起反應，反應過程中發生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計算機監測系統檢測并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測神經束為運動束，含量低的待測神經束則為感覺束。
2、 根據權利要求1所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質 中的應用，其特征在于它包括以下步驟1) 在石英晶體芯片上結合戊二醛；2) 在石英晶體芯片上標記乙餓膽堿酯酶抗體；3) 剪取神經片斷，放入改良細胞裂解液中振蕩數次；4) 將振蕩后的改良細胞裂解液加入進樣孔，在監測器上觀察到乙酰膽堿酯酶的含量高低變化，含量高的神經束為運動束，反之則為感覺束。
3、 根據權利要求2所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質 中的應用，其特征在于所述改良細胞裂解液為0.5%Triton X-100細胞裂解緩沖液，配方如下Triton X-100 0. 5%Tris EDTA Sucrose調節pH至7.4， -70。C保存 PMSF (100隱ol/L) Na3V04 (200mmol/L) Cocktail Calyculin A5咖ol/L 2mraol/L 0.3mol/L 臨用前加 5 P 1/ml 5 U 1/ml(10u 1/ml 1.0y g/ml
全文摘要
本發明公開了一種乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測神經束性質中的應用，它通過在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與待測神經樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起反應，反應過程中發生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計算機監測系統檢測并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測神經束為運動束，含量低的待測神經束則為感覺束。本發明從周圍神經運動束與感覺束中的乙酰膽堿酯酶含量的差別入手，可快速檢測乙酰膽堿酯酶的壓電生物傳感系統、快速鑒別出周圍神經運動束與感覺束，實現運動束對運動束、感覺束對感覺束正確縫合。在以后的臨床應用中可得到廣泛推廣。
文檔編號C12Q1/44GK101231286SQ20081002068
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月21日 優先權日2008年2月21日
發明者波 劉, 史苑鄉, 寧 張, 戈應濱, 曹曉建, 金正帥 申請人:江蘇省人民醫院