專利名稱：全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-n-乙酰葡糖胺的方法
技術領域：
本發明涉及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的制備方法，尤其涉及全細胞生物催化合成 尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法。
技術背景在過去很長的一段時間內，碳水化合物及其衍生物并沒有得到很大發展，但近十年 來，隨著發現糖類物質在細胞識別，免疫方面的重要生理作用，糖類物質又日益受到了 重視并有了長足的進步。尤其是寡糖，它在生物體內起著調節細胞內外聯系的作用，并 參與激素的調節和抗體的免疫識別，能激活植物的自我防衛系統、誘導根瘤菌的固氮作 用、可以與入侵的微生物上的糖蛋白相結合而阻止這些微生物對人體正常細胞的侵襲等 等[Glycoconjugate Journal. 1999,16: 147。尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)是合成寡糖的重要糖基供體[USP 6，287，819，2001],故有必要對糖核苷酸尤其是作為含有許多生理活性糖鏈鏈芯部分的N-乙酰葡糖胺供體的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的合成進行深入的研究。生物體中尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺中涉及不同氨基糖之間的轉化，且作為生物合 成粘多糖、糖肽、脂蛋白和幾丁質等的氨基糖成分的重要前體物質[8101.016111.1971,35(2): 163-176]。尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生物催化合成，從能量利用方面看，是較高難度的合 成反應。首先添加在反應液中的葡糖胺通過與EMP途徑的化學能生成系統共軛，葡糖 胺被磷酸化為葡糖胺-6-磷酸，再進一步消耗乙酰-輔酶A,而被轉化為N-乙酰葡糖胺-l-磷酸；另一方面，作為構成核苷酸部分原料的尿苷酸，通過與EMP途徑的能量生成系 統共軛，被磷酸化為尿苷三磷酸，最后通過縮合反應，生成UDPAG[(Yeast2006，23:14]。目前合成UDPAG的方法有化學法[J. Ctem. 1992,57:146、酶化學法[J. Org. Chem. 1992,57:146]、發酵法[USP 5,674,715,1997。化學合成需要五步，最后一步合成收 率很低，總收率只有15%,化學法和發酵法都是用于實驗室生產少量的UDPAG,在實 際應用中酶化學法比較方便，收率較高，但后續的分離卻很復雜a有報道用尿苷酸及 N-乙酰葡糖胺為底物，并加入N-乙酰葡糖胺澉酶、N-乙酰葡糖胺磷酸變位酶及尿苷二 磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶為特征的UDPAG的制備方法[CN 1276837A]。此方法成 本高昂，操作繁瑣，穩定性差，真正實現工業化還有待探討。 發明內容本發明的目的在于提供一種低成本、便于后續分離操作的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖 胺的制備方法。本發明的關鍵在于1、 全細胞催化由于細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統，各種酶又保持著原有活細胞所處 的狀態和特定位置，因此用酵母細胞直接作為,源進行酶催化反應，能夠迅速有效地完 成多步酶催化反應。在本發明中利用停止生長的酵母，釆用全細胞催化技術，同時添加 促滲透劑對酵母進行細胞滲透性增強處理，從而既保持了細胞酶系的完整性，又有利于 底物的利用，并使得產物能夠從胞內釋放出來，從而可以降低后續分離的難度。本發明是建立在全細胞催化的基礎上的，其特點在于克服了其它方法底物轉化率不 高、難于實現能量和輔酶再生的種間耦合，不易改變細胞的通透性等缺陷。特別是與酶 催化相比，由于使用的是全細胞，胞內的酶受細胞壁/細胞膜的保護，酶穩定性更好，半 衰期更長，更易實現能量和輔酶的再生；胞內多種酶系的存在以實現酶的級聯反應可以 彌補酶法催化中級聯催化不易實現的不足，同時省去酶的純化過程，制備簡單，成本低藤《2、 利用酵母合成UDPAG的自身代謝途徑在酵母細胞中生物合成UDPAG從葡萄糖開始，在己糖激酶和磷酸葡萄糖異構酶的 作用下變為6-磷酸果糖，再以6-磷酸果糖和谷氨酰胺為底物在氨合成酶作用下轉化成為 6-磷酸葡萄糖胺，隨后6-磷酸葡萄糖胺被乙酰化、異構化乙酰葡糖胺-l-磷酸，最后被相 應的焦磷酸化酶轉化為UDPAG。因此谷氨酰胺的加入可以利用酵母自身的合成途徑， 促進UDPAG的合成。本發明直接加入葡糖胺，利用己糖激酶被催化成6"磷酸葡萄糖胺。而己糖激酶的優 先底物為葡萄糖，體系中一旦存在葡萄糖則葡糖胺的磷酸化反應很弱 [Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392^2000，因此用果糖代替葡萄糖作為能源，可以 消除葡糖胺磷酸化受到抑制的同時還可以利用酵母自身的合成途徑，作為合成的底物合 成UDPAG。3、 小分子效應物的加入代謝通量經調解因子鎂離子、鉀離子調節后，代謝途徑流量分配發生了重大改變， EMP主途徑得以加強，提高了能量的利用率，部分解決了 UTP合成和糖部分合成反應 過程中需要大量ATP的問題。反應過程中底物6-磷酸-葡糖胺和乙酰輔酶A在葡糖胺"6-磷酸乙酰轉移酶的催化下轉變為6-磷酸-N-乙酰葡糖胺，此步反應為整個催化合成過程中的限速反應 [Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392，2000，因此解決乙酰輔酶A的再生問題，是 本發明的關鍵。酵母內乙酰輔酶A的形成途徑有兩條 一是線粒體內的丙酮酸直接氧化 脫羧途徑，由丙酮酸脫氫酶將丙酮酸氧化為乙載輔,A: 二是細胞質內的丙酮酸脫羧支 路，在丙酮酸脫羧酶、乙醛脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶的聯合作用下將丙酮酸轉化為乙 酰輔酶A。醋酸鈉可以利用酵母細胞中丙酮酸脫羧酶、乙醛脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶 的聯合作用生成乙酰輔酶A,所以反應體系中加入醋酸根離子，可以促進乙酰輔酶A的 再生，對促進UDPAG的合成有很大作用。具體來說，本發明的目的通過以下技術措施達到一種全細胞生物催化合成尿苷二磷酸，N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于以尿苷酸 (UMP)、葡糖胺和磷酸根離子為底物，以果糖為能量供體，加入小分子化學效應物質， 利用有透性的酵母細胞全細胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。其中，底物中，尿苷酸的起始反應濃度為S 50mM，優選1(M5mM;葡糖胺的起 始反應濃度為10 70rnM，優選15"45mM;磷酸根離子起始反應濃度為60~300 mM,優 選80 180mM。其中，果糖的起始反應濃度為20~180mM,優選150mM。其中，所述的小分子化學效應物質為無機小分子和有機小分子；其中無機小分子為 鎂離子和鉀離子的組合物；有機小分子為醋酸根離子和谷氨酰胺的組合物；Mg^起始反 應濃度為2~30mM，優選2~22mM; K+起始反應濃度為5~80mM，優選15~65mM; CH3C0CT起始反應濃度為5~90mM,優選5~65mM:谷氨酰胺起始反應濃度為5~80mM， 優選15~60mM。其中，所述的酵母為酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母 屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬或釀酒酵母屬中能夠利用尿苷酸和葡糖胺 為前體合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的酵母，優選釀酒酵母、近平滑假絲酵母、面包 酵母、奧默列氏畢赤酵母、白色球擬酵母、類球形德巴利酵母、魯氏接合酵母、馬克斯 克魯維酵母、杰丁漢遜酵母或異酒香酵母酵母細胞的使用量為按濕菌體16(K400g/L, 優選25(M00g/L,即對于總體積為1L的反應液，需加入濕酵母160~400g,優選加入 25(M00g。其中，所述的有透性的酵母細胞是指通過化學、物理或生物方法處理過的細胞膜的 通透性改變過的酵母細胞，具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波 處理法、風干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。表面活性劑法中使用的表面活性劑包括非離子型表明活性劑聚環氧乙烷胺或曲拉通X-IOO,陽離子性表面活性劑十六烷基三甲胺《溴化物或陰離子表明活性劑月桂酸*肌 氨酸鹽，使用量為0.1一0g/L，優選l~20g/L,即表面活性劑法處理酵母細胞時，將表面 活性劑直接加入反應液，對于總體積為1L的反應液，加入0.1一0g,優選加入l 20g。有機溶劑法中使用的有機溶劑為甲苯、丙酮或乙酸乙酯，使用濃度為0.1~70ml/L, 優選l~40ml/L,即有機溶劑法處理酵母細胞時，將有機溶劑直接加入反應液，對于總體 積為1L的反應液，加入0.1 70mL,優選加入140mL。其它處理細胞透性的方法，如凍融法、超聲波處理法、風干法等，采用先將酵母細 胞處理后，再將處理好的酵母加入反應液的方式。其中，上述尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生成反應在水溶液中進行，pH4.0~10.0, 15"~40"條件下反應4~30小時，優選pH6.(K10.0， 20'C 37'C的條件。上述反應的代謝途徑見圖1。本發明所采用的UDPAG的合成方法，利用UTP生成 體系和ATP再生體系共同發揮作用的體系，其中UTP生成體系是利用酵母自身酶系以 果糖、無機磷等為底物，使ATP再生，同時利用酵母中的尿苷酸激酶作用于UMP生成 UTP。有益效果本發明采用全細胞酵母生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺，克服 了發酵法代謝產物復雜、底物轉化率低等缺陷，簡化了后續的分離工藝；與酶法相比由 于使用的是全細胞，酶的穩定性更好，耐有機溶劑的適應性更強，更易實現能量和輔酶 的原位再生。本發明成本低廉，操作簡單，易于實現工業化，為全細胞催化合成糖核苷 酸提供了一種新的思路和方法。
圖1為本發明全細胞酵母生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酷葡糖胺的代謝途徑。其中，ATP為三磷酸腺苷，ADP為二磷酸腺苷，NADH為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+為指煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，PPi為焦磷酸.具體實施方式
實施例l:酵母培養基:葡萄糖40 g/L，尿素2.0 g/L,磷酸二氫鉀1.5 g/L，七水合硫酸鋅4.0xl(T3 g/L，七水合硫酸亞鐵3.0xl(^g/L，四水合氣化鍾0.3xl04g/L,無水氯化鈣1.0xlO'3g/L, 生物素0.05xl(T3g/L。酵母接種量10%,于30'C下120rpm搖床培養24小時，離心40(Kkpffl， 20分鐘。取酵母泥，-7"保藏備用。 實施例2:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷黢二鈉鹽16.3mM、果糖166.7mM、葡糖胺 25.5 mM、谷氨酰胺l(UmM、磷酸二氫鈉189mM、氯化鎂6.4mM、氯化鉀53.7mM、 醋酸鈉36.6 mM、甲苯150ml、利用實施例l所述的方法培養面包酵母酵母泥2000g克 和水組成的反應液10L，用氫氧化鉀調pH至8.0,與281C條件下低速攪拌反應8h,反 應結束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC對UDPAG進行定量分析，轉化液中含UDPAG 4.15g/L，產物對UMP的得率為39.1%。 實施例3:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽9.51mM、果糖194.4 mM、葡糖胺 37.1mM、利用實施例1所述的方法培養面包酵母酵母凍干粉3500g、谷氨酰胺20.5 mM、 磷酸二氫鈉224mM、氯化鎂9.85mM、氯化鉀60.4mM、醋酸鈉46.3 mM和水組成的 反應液10L,用氫氧化鉀調pH至8.0,與28X:條件下低速攪拌反應8h，反應結束后， 用三氯乙酸沉淀，用HPLC對UDPAG進行定量分析，轉化液中含UDPAG 3.25g/L，產 物對UMP的得率為52.5%。 實施例4:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽10.9mM、果糖222.2 mM、葡糖胺 19.9 mM、利用實施例1所述的方法培養白色球擬酵母3000g、風干處理、谷氨酰胺17.1 mM、磷酸二氫鈉135 mM、氯化鎂9.36 mM、氯化鉀44.3 mM、醋酸鈉48.8 mM和水 組成的反應液10L，用氫氧化鉀調pH至8.0,與28'C條件下低速攪拌反應8h，反應結 束后，用三氯乙酸沉淀,用HPLC對UDPAG進行定量分析,轉化液中含UDPAG 3.79g/L, 產物對UMP的得率為53.6%。 實施例5:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽18mM、果糖250mM、葡糖胺70 mM、谷氨酰胺60 mM、磷酸二氫鈉180 mM、氯化鎂2 mM、氯化鉀65 mM、醋酸鈉 65 mM、陽離子性表面活性劑十六烷基三甲胺 溴化物400g、白色球擬酵母泥2500g 和水組成的反應液10L,用氫氧化鉀調pH至10.0,與401C條件下低速攪拌反應4h,反 應結束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC對UDPAG進行定量分析，轉化液中含UDPAG 4.36g/L,產物對UMP的得率為37.2%。 實施例6:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽4mM、果糖30mM、葡糖胺15mM、利用實施例1所述的方法培養白色球擬酵母3000g反復凍融4次、谷氨酰胺15 mM、磷 酸二氫鈉80 mM、氯化鎂30 mM、氯化鉀15 mM、醋酸鈉5mM和水組成的反應液10L, 用氫氧化鉀調pH至6.0,與20"條件下低速撹拌反應3他，反應結束后，用三氯乙酸沉 淀，用HPLC對UDPAG進行定量分析，轉化液中含UDPAG1.35g/L,產物對UMP的 得率為51.8%。 實施例7:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽40mM、果糖130mM、葡糖胺 15mM、谷氨酰胺80mM、磷酸二氫鈉60mM、氯化鎂22mM、氯化鉀80mM、醋酸鈉 90mM、陰離子表明活性劑月桂酸，肌氨酸鹽lg、類球形德巴利酵母泥4000g和水組成 的反應液IOL，用氫氧化鉀調pH至4.0,與37lC條件下低速攪拌反應20h，反應結束后， 用三氯乙酸沉淀，用HPLC對UDPAG進行定量分析，轉化液中含UDPAG2.47g/L，產 物對UMP的得率為9.49%。 實施例8:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽6mM、果糖20mM、葡糖胺45mM、 谷籬酰胺40mM、磷酸二氫鈉300mM、氯化鎂15mM、氯化鉀5 mM、醋酸鈉20mM、 丙酮700mL、類球形德巴利酵母泥1600g和水組成的反應液10L,用氫氧化鉀調pH至 7.0，與15'C條件下低速攪拌反應20h,反應結束后,用三氯乙酸沉淀,用HPLC對UDPAG 進行定量分析，轉化液中含UDPAG1.73g/L,產物對UMP的得率為44.3。/。。 實施例9:在容量為15L的反應槽中調制出由尿苷酸二鈉鹽35mM、果糖20mM、葡糖胺45mM、 谷氨酰胺40mM、磷酸二氫鈉300mM、氯化鎂15mM、氯化鉀5 mM、醋酸鈉20mM、 乙酸乙酯lmL、近平滑假絲酵母泥2500g和水組成的反應液10L，用氫氧化鉀調pH至 7.0,與15'C條件下低速攪拌反應25h,反應結束后,用三氯乙酸沉淀，用HPLC對UDPAG 進行定量分析，轉化液中含UDPAG2.51g/L,產物對UMP的得率為11%。
權利要求
1、一種全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于以尿苷酸、葡糖胺和磷酸根離子為底物，以果糖為能量供體，加入小分子化學效應物質，利用有透性的酵母細胞全細胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。
2、 根據權利要求1所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于底物中，尿苷酸的起始反應濃度為"0mM，葡糖胺的起始反應濃度為 1(K70mM，磷酸根離子起始反應濃度為6(K300mM。
3、 根據權利要求2所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于底物中，尿苷酸的起始反應濃度為^35mM,葡糖胺的起始反應濃度為 1545mM，磷酸根離子起始反應濃度為8(K180mM。
4、 根據權利要求1所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于果糖的起始反應濃度為20~250mM。
5、 根據權利要求4所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于果糖的起始反應濃度為30~130mM,
6、 根據權利要求1所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于所述的小分子化學效應物質為無機小分子和有機小分子；其中無機小分子為 鎂離子和鉀離子的組合物；有機小分子為醋酸根離子和谷氨酰胺的組合物；鎂離子起始 反應濃度為2~30mM,鉀離子起始反應濃度為5~80mM;醋酸根離子起始反應濃度為 5 卯mM，谷氨酰胺起始反應濃度為5~80mM。
7、 根據權利要求6所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于鎂離子起始反應濃度為2 22rnM,鉀離子起始反應濃度為15~65mM;醋酸 根離子起始反應濃度為5~65mM，谷氨酰胺起始反應濃度為15~60mM。
8、 根據權利要求1所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于所述的酵母為酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母 屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬或釀酒酵母屬中能夠利用尿苷酸和葡糖胺 為前體合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的酵母，酵母細胞的使用量為按濕菌體 160~400g/L。
9、 根據權利要求8所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于所述的酵母為釀酒酵母、近平滑假絲酵母、面包酵母、奧默列氏畢赤酵母、 白色球擬酵母、類球形德巴利酵母、魯氏接合酵母、馬克斯克魯維酵母、杰丁漢遜酵母 或異酒香酵母，酵母的使用量為按濕菌體25(K400g/L。
10、 根據權利要求1所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于所述的有透性的酵母細胞是指通過化學、物理或生物方法處理過的細胞膜的 通透性改變過的酵母細胞，具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波 處理法、風干法、冷凍干燥法或溶菌酶法，
11、 根據權利要求lO所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法, 其特征在于表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表明活性劑聚環氧乙烷胺或 曲拉通X-100、陽離子性表面活性劑十六烷基三甲胺 溴化物或陰離子表明活性劑月桂 酰*肌氨酸鹽，使用量為0.1—0g/L。
12、 根據權利要求10所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于有機溶劑法中使用的有機溶劑為甲苯、丙酮或乙酸乙酯，使用量為 0.1~70ml/L。
13、 根據權利要求1~12中任意一項所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰 葡糖胺的方法，其特征在于尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生成反應在水溶液中進行， pH4.0~10.0, 15'C40'C條件下反應4~30小時。
14、 根據權利要求13所述的全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法， 其特征在于反應條件為pH6.(M0.0，溫度為201C 37'C。
全文摘要
本發明公開了一種全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，以尿苷酸、葡糖胺和磷酸根離子為底物，以果糖為能量供體，加入小分子化學效應物質，利用有透性的酵母細胞全細胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。本發明采用全細胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺，克服了發酵法代謝產物復雜、底物轉化率低等缺陷，簡化了后續的分離工藝；與酶法相比由于使用的是全細胞，酶的穩定性更好，耐有機溶劑的適應性更強，更易實現能量和輔酶的原位再生。
文檔編號C12R1/645GK101230372SQ20081002021
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月27日 優先權日2008年2月27日
發明者應漢杰, 磊 張, 曹海萍, 李振江, 柏建新, 歐陽平凱, 健 熊 申請人:南京工業大學