專利名稱：：一種改變細胞膜通透性有效生產1,3-丙二醇的方法
技術領域：
：本發明是一種生物技術制備1,3-丙二醇的方法，特別涉及添加非離子表面活性劑改變細胞膜通透性，有效提高1,3-丙二醇濃度的方法，屬于1,3-丙二醇的生物催化合成
技術領域：
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背景技術：
：在有機合成反應中，1，3-丙二醇作為雙官能團有機分子，具有廣泛的應用。它可替代乙二醇、丁二醇，用作合成聚酯和聚氨酯的單體以及溶劑、抗凍劑或保護劑等,也用于合成醫藥和用做有機合成中間體。其最主要的用途是制造性能優異的新型聚酯纖維聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的重要單體原料。PTT是20世紀90年代中期工業開發成功的具有植物纖維特性的高檔服裝纖維材料。PTT具有優異的回彈性、染色性、抗污性，以及自然循環的可生物降解特性，在地毯、工程塑料、服裝面料等領域大有作為，被美國評為六大石化新產品之一，是目前國際上合成纖維開發的熱點。目前只有德國Degussa公司、美國Shell公司和DuPont公司實現了1,3-丙二醇生產的工業化，據Schell公司預測，到2010年世界PTT纖維需求量將超過100萬噸，屆時，對l,3-丙二醇的需求也將直線上升。1,3-丙二醇的工業生產方法主要有3種環氧乙烷氫甲酰化法、丙烯醛水解法和微生物發酵法。微生物發酵法生產1,3-丙二醇是利用細胞的代謝反應網絡，使可再生的生物質原料高效轉化為1,3-丙二醇，特別是其中的甘油轉化途徑，由于甘油是生物柴油制取所衍生的主要副產物，同時也是乙醇發酵的副產物，而備受矚目。已有很多研究著重于優化微生物轉化甘油生產1,3-丙二醇的過程，如采用微氧發酵工藝提高生物反應器的生產力；如為提高1,3-丙二醇的轉化率，減少副產物的生成，分別采取不同的發酵調控策略補料分批、兩階段培養、雙底物發酵、添加輔因子發酵等工藝，提高l,3-丙二醇的轉化率、產量、降低發酵成本(1-6)。1、ChenX，.ZhangDJ，'QiWT，'GaoSJ，XiuZL,XuP.Microbialfed-batchproductionof1,3-propanediolbyA7e6w'e//a/wewwom.aeundermicro-aerobicconditions.Appl.Microbiol.Biotechnol.2003.63:143—146.2、張延平，杜晨宇，饒治，曹竹安.維生素C和E對iC/eZmW/fl/wewwom'fle合成1，3-丙二醇的調控.過程工程學報.2005.5:197-200.3、程可可，孫燕，劉衛斌，劉德華.底物流加策略對發酵法生產1,3-丙二醇的影響.食品與發酵工業.2004.30:398-40,4、陳宏文，王亂方柏山，胡宗定.克雷伯桿菌生產1，3-丙二醇關鍵酶發酵條件研究.高校化學工程學報.2004.18:621-627.5、吳斌，何冰芳，孫志浩，歐陽平凱.丁酸梭桿菌發酵甘油制備1,3—丙二醇的研究.工業微生物.2004.31:21-25.6、楊東，李春，杜晨宇，張延平，曹竹安.兩段雙底物發酵生產1,3-丙二醇，過程工程學報.2003.3:269-273.但已有工藝都存在產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，導致發酵過程中菌體量偏低，生產周期長，生產強度低。表面活性劑能改善細胞膜通透性，在微生物發酵中經常被用來提高目標產物的產量。在微生物發酵過程中加入表面活性劑，可加快物質傳遞運輸，增加胞內胞外的物質平衡，從而提高了菌體對底物、產物的耐受度，解決發酵產物、副產物對微生物細胞生長和催化活性的抑制。因此，在微生物發酵過程中添加表面活性劑對增加終產物濃度，提高生產效率，縮短反應周期，降低生產成本，具有重要的現實意義(7-9)。7、朱艷，袁其朋，王航.添加氧載體及表面活性劑對番茄紅素發酵的影響.微生物學通報.2006.33(1):90-93.8、韋祎，張淑榮，劉春巧，張鵬.添加表面活性劑對a-熊果苷發酵的影響.化工學報.2007.58(9):2352-2356.9、NemecT，JemejcK.InfluenceofTween80onlipidmetabolismofanAspergillusnigerstrain.ApplBiochemBiotechnol.2002.101(3):229-238.文獻分別報道添加Span20、Tween80，Tritonx-100，Tween20，其中三孢布拉霉發酵產P-胡蘿卜素，在最佳條件下，e-胡蘿卜素產量的增長幅度可達15%以上；在黃單胞菌催化合成a-熊果苷反應中添加表面活性劑，研究表明在最佳反應條件下，產物濃度較空白高約27.6%，且提高菌體對對底物苯二酚的耐受度，發酵周期縮短了12h;在黑曲霉的果膠裂解酶培養基中添加Tween80,能將產酶量提高70%。表面活性劑種類繁多且性質各不相同，它們一方面具有改善細胞膜通透性，減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，加快物質傳遞運輸的能力；另一方面對微生物有毒性和殺菌作用。一般來說陽離子表面活性劑對細胞的毒性較大；非離子表面活性劑毒性小，對細胞的影響也較弱；陰離子表面活性劑的毒性和殺菌力介乎兩者之間。工業發酵生產l，3-丙二醇，主要是腸道細菌，細胞生長產生莢膜，并覆蓋在細胞表面，發酵液的黏度隨著發酵的進行逐漸增加，對溶氧和l，3-丙二醇的產出都產生很大的影響。對于l,3-丙二醇的發酵來說，如何保證氧和營養物質的傳遞吸收，維持細胞生長，對進一歩提高l，3-丙二醇的產量具有重要的意義。
發明內容技術問題本發明的目的在于提供一種改變細胞膜通透性有效生產1,3-丙二醇的方法，通過添加非離子表面活性劑增加細胞膜的通透性，一方面減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，維持細胞生長；另一方面促使微生物代謝產物易于分泌至胞外，利于消除產物、副產物抑制，特別是減少1，3-丙二醇對細胞生長和細胞催化活性的抑制，從而有利于1，3-丙二醇合成的方法。技術方案本發明的方法是添加非離子表面活性劑改變細胞膜通透性，減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，加快物質傳遞運輸的能力，促進細胞生長；解決產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，提高發酵產物l,3-丙二醇濃度，其工藝過程為二級種子制備取l,3-丙二醇生產菌種，接種于種子培養基中，34-37°C，120-220rpm搖床培養18-36h，再接種到種子培養基中，34-37'C培養12-16h,制成二級種子備用；發酵培養20-65g/L工業甘油做碳源，裝液量40%-70%，3%-15%的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34-37'C，150-400rpm間歇式培養或補料分批式培養20-40h;中間間隔取樣測細胞濃度和產物l,3-丙二醇濃度；在發酵培養開始至24小時，加入非離子表面活性劑；間隔取樣測細胞濃度和產物l,3-丙二醇濃度，發酵液1,3-丙二醇最終濃度提高10%~70%。1,3-丙二醇生產菌種包括克雷伯肺炎桿菌、弗氏檸檬菌、產氣克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌。發酵生產1，3-丙二醇過程中添加的非離子表面活性劑為Span、或Tween、或Triton、或OP、或AEO。表面活性劑加入的方式是一次性加入、或分批加入或流加，濃度范圍0.01~50g/L。本發明在1,3-丙二醇發酵過程中，釆用添加非離子表面活性劑增加細胞膜的通透性，一方面減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，維持細胞生長；另一方面促使產生的1,3-丙二醇易分泌至胞外，降低l,3-丙二醇在細胞內的積累，減少1,3-丙二醇對細胞催化活性的抑制，解決產物抑制，從而有利于1，3-丙二醇的合成。有益效果本發明提供了簡便有效經濟的發酵工藝，解決發酵終產物產量低以及發酵過程產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，有效提高發酵終產物濃度，提高生產效率，降低生產成本，易于實現工業化應用。具體實施方式所涉及到的1，3-丙二醇生產菌種可以是克雷伯肺炎桿菌、弗氏擰檬菌、產氣克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌。本發明采用添加非離子表面活性劑改變細胞膜通透性，一方面減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，維持細胞生長；另一方面促使產生的1,3-丙二醇易分泌至胞外，降低l，3-丙二醇在細胞內的積累，減少1，3-丙二醇對細胞催化活性的抑制，解決產物抑制，最終提高1,3-丙二醇產量。具體實施過程為二級種子制備取l，3-丙二醇生產菌種，接種于種子培養基中，34-37°C，120-220rpm搖床培養18-36h，再接種到種子培養基中，34-37。C培養12-16h，制成二級種子備用。發酵培養20-65g/L工業甘油做碳源，裝液量40%-70%，3%-15%的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34-37'C，150-400rpm間歇式培養或補料分批式培養20-40h;中間間隔取樣測細胞濃度和產物l,3-丙二醇濃度。在發酵培養開始至24小時，加入非離子表面活性劑。添加的非離子表面活性劑是Span、或Tween、或Triton、或OP、或AEO，濃度范圍0.0150g/L，表面活性劑加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。間隔取樣測細胞濃度和產物l,3-丙二醇濃度。發酵液1,3-丙二醇最終濃度提高10%~70%。1,3-丙二醇生產菌種包括克雷伯肺炎桿菌、弗氏檸檬菌、產氣克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌。添加的表面活性劑是非離子表面活性劑Span、或Tween、或Triton、或OP、或AEO，濃度范圍0.01~50g/L。表面活性劑加入的方式是一次性加入或流加。以下為具體實例菌種克雷伯肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)固體斜面培養基牛肉膏3g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl10g/L，瓊脂20g/L，甘油20g/L。種子培養基酵母膏2g/L，MgSO4*7H2O0.2g/L，檸檬酸0.42g/L,K2HP041.6g/L，K2HP043.4g/L，NH4C13.0g/L，甘油30g/L,CaCl20.5g/L。發酵培養基甘油20-65g/L，K2HP04'3H201.36g/L，NH4C13.0g/L，酵母膏2.0g/L，MgS04'7H200.2g/L，CaCl22.0g/L鐵溶液lmL/L，無機離子溶液2mL/L，Vb,2溶液lmL/L,鈷溶液lmL/L。無機離子含CuCl2，H3B03，MnCl2，Na2Mo04，NiCl2，ZnS04，微量元素含量約在0.01~50mg/L。二級種子制備取克雷伯肺炎桿菌新鮮固體斜面菌種，接種于種子培養基中，35。C搖床，150rpm培養24h，再接種到種子培養基中，35。C培養12-16h，制成二級種子備用。發酵培養20-65g/L工業甘油做碳源，裝液量40%-70%，3%-15%的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34-37'C，150-400rpm間歇式培養或補料分批式培養20-40h;中間間隔取樣測細胞濃度和產物1，3-丙二醇濃度。在發酵培養4-24小時，加入非離子表面活性劑，間隔取樣測細胞濃度和產物l,3-丙二醇濃度。添加的表面活性劑是非離子表面活性劑Span、或Tween、或Triton、或OP、或AEO，濃度范圍0.01~50g/L。表面活性劑加入的方式是一次性加入或流加。實施例一400ml含45g/L工業甘油的發酵培養基置于1L搖瓶中，接入體積40ml二級種子，溫度37'C，搖床180rpm培養。在發酵8h分別加入濃度為0%、0.05%、0.1%、0.5%、0.6%、0.8°/。、1%OP-10，每隔一段時間取樣一次，分光光度計比濁法測量細胞濃度，波長650nm，細胞濃度即菌體量表示為OD;氣相色譜分析1,3-丙二醇的濃度。24小時結束發酵。實施例一研究了在發酵甘油產l,3-丙二醇工藝中，添加非離子表面活性劑OP-IO，濃度從01.0%范圍內，不同0P濃度對克雷伯肺炎桿菌生長和l,3-丙二醇產量的影響。圖1表明OP-10在低濃度時主要表現為對菌體量的促進作用，濃度高時則主要表現為對細胞的毒害作用，菌體量下降。圖2表明OP-10在低濃度時對1，3-丙二醇產量的提高有促進作用，增長幅度可達16%以上。分析以上結果的原因，添加OP-10的發酵培養工藝，OP改善了營養物質和氧的傳遞，促進細胞生長，另一方面促使產生的1,3-丙二醇易分泌至胞外，降低1，3-丙二醇在細胞內的積累，減少1,3-丙二醇對細胞催化活性的抑制，解決產物抑制，最終菌體量和1,3-丙二醇產量得到提高。但是隨著OP濃度的提高，OP對微生物也表現出一定的毒害作用。OP-10作用的最佳濃度加量為0.05~0.5%，即0.55g/L。實施例二400ml含50g/L工業甘油的發酵培養基置于1L搖瓶中，接入體積40ml二級種子，溫度37。C，搖床180rpm培養。在發酵4h、8h、12h、16h分別加入濃度為0.1XOP-10，24小時結束發酵。氣相色譜分析1,3-丙二醇的濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1發酵4h.8h.12h.16h分別加入濃度為0.1%OP-10的搖瓶編號從圖3中可以看到，在發酵不同時期加入OP對l，3-丙二醇的產出有較大影響，在8-16小時加入效果最好，1，3-丙二醇的產量最大增加了12%。通過上述實驗可以證明，在甘油發酵生產1,3-丙二醇工藝中，通過添加非離子表面活性劑增加細胞膜的通透性，可有效促進細胞生長，提高發酵終產物1，3-丙二醇濃度的方法，工藝簡便經濟。權利要求1、一種改變細胞膜通透性有效生產1，3-丙二醇的方法，其特征在于添加非離子表面活性劑改變細胞膜通透性，減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，加快物質傳遞運輸的能力，促進細胞生長；解決產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，提高發酵產物1，3-丙二醇濃度，其工藝過程為二級種子制備取1，3-丙二醇生產菌種，接種于種子培養基中，34-37℃，120-220rpm搖床培養18-36h，再接種到種子培養基中，34-37℃培養12-16h，制成二級種子備用；發酵培養20-65g/L工業甘油做碳源，裝液量40％-70％，3％-15％的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34-37℃，150-400rpm間歇式培養或補料分批式培養20-40h；中間間隔取樣測細胞濃度和產物1，3-丙二醇濃度；在發酵培養開始至24小時，加入非離子表面活性劑；間隔取樣測細胞濃度和產物1，3-丙二醇濃度，發酵液1，3-丙二醇最終濃度提高10％～70％。2、根據權利要求1所述的改變細胞膜通透性有效生產1,3-丙二醇的方法，其特征在于1,3-丙二醇生產菌種包括克雷伯肺炎桿菌、弗氏檸檬菌、產氣克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌。3、根據權利要求1所述的改變細胞膜通透性有效生產1,3-丙二醇的方法，其特征在于發酵生產1，3-丙二醇過程中添加的非離子表面活性劑為Span、或Tween、或Triton、或OP、或AEO。4、根據權利要求3所述的改變細胞膜通透性有效生產1,3-丙二醇的方法，其特征在于表面活性劑加入的方式是一次性加入、或分批加入或流加，濃度范圍0.01~50g/L。全文摘要改變細胞膜通透性有效生產1，3-丙二醇的方法是一種提供添加非離子表面活性劑改變細胞膜通透性，有效促進細胞生長，提高發酵終產物1，3-丙二醇濃度的方法。其工藝過程為在發酵培養液中接入二級種子培養液，同時向發酵液中添加能改善細胞膜通透性的非離子表面活性劑，添加非離子表面活性劑減少了氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，促進細胞生長；并且促使代謝產物分泌至胞外，降低代謝產物在細胞內的積累，利于消除產物、副產物抑制，特別是減少1，3-丙二醇對細胞生長和細胞催化活性的抑制。發酵產物1，3-丙二醇濃度提高10％~70％。該工藝過程簡便，生產成本低，易于實現工業化應用。文檔編號C12P7/18GK101230362SQ20081002020公開日2008年7月30日申請日期2008年2月27日優先權日2008年2月27日發明者敏吳,馬全紅申請人:東南大學