專利名稱：一種產紅霉素c的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體是一種產紅霉素c的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法。
背景技術：
紅霉素(ery仇romycin， Er)是由革蘭氏陽性菌糖多孢紅霉菌 (AiccA<wv/w/"/wra e/y狄raefl)合成的次生代謝產物，為一類大環內酯類抗生 素，包括紅霉素A (ErA)、紅霉素B (ErB)、紅霉素C (ErC)、紅霉素D (ErD)等。這四種紅霉素均有抑菌活性，但在臨床上具有廣泛用途的是ErA, 它的抑菌活性最高。紅霉素的生物合成分為兩大部分紅霉素母核(6-dEB)的合成和6-dEB 的后修飾。前者由一分子丙酸和六分子甲基丙二酸在聚酮合成酶(PKS)復合 體的催化作用下完成；隨后6-dEB在C-6位羥基化酶及在C-3位和C-5位羥基 糖基化酶作用下形成了第一個有活性的中間產物ErD;接著，ErD可以先在C-12 位羥基化酶EiyK作用下形成ErC，再在3"-0-甲基轉移酶EryG作用下形成 ErA，這是一條主要途徑；然而在體內還有另一條次要途徑，即ErD先在EiyG 作用下形成ErB，再在EryK作用下形成ErA。紅霉素生物合成基因以單一拷貝、成簇存在于糖多孢紅霉菌染色體上，質 粒不參與紅霉素的生物合成。糖多孢紅霉菌紅霉素3"-0-甲基轉移酶是一種S-腺 苷甲硫氨酸(SAM)依賴的甲基化酶，在降低紅霉素的毒性和提高紅霉素的活 性方面起著重要的作用。糖多孢紅霉菌紅霉素3"-0-甲基轉移酶ei^G基因開放閱讀框(ORF)由921 對核苷酸組成，編碼產物EryG有306個氨基酸。通過比對EryG和其它幾種甲基 轉移酶的氨基酸序列發現在氨基末端都有一個富含甘氨酸(Gly)的S-腺苷甲硫 氨酸(SAM)結合位點基序，保守區序列為VLE/DXGXGXG。本研究構建的糖多孢紅霉菌A226G—突變體不再合成ErA，表明刪除突變后的eo;G基因表達產物不再有甲基轉移酶活性。巨大霉素和紅霉素A的生物合成有 著共同的中間體紅霉素C，所以本發明構建的缺失紅霉素^v( 基因的糖多孢紅霉 菌A226G—突變體，不但為進一步深入研究EryG相關的酶學性質奠定了基礎，而 且也為研究巨大霉素生物合成中紅霉素C之后的修飾酶提供了一個系統。
發明內容
本發明的目的是提供一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法，不 但為進一步深入研究EryG相關的酶學性質奠定了基礎，而且也為研究巨大霉素 生物合成中紅霉素C之后的修飾酶提供了 一個系統。本發明的技術方案如下一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法，其特征在于利用染色體 同源重組的性質，將糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3"-0-甲基轉移酶編碼基因 eiy(7刪除，或將含有EryG S-腺苷甲硫氨酸SAM結合位點對應的DNA序列在內的 一DNA片段刪除，或對^v(7基因插入失活，得到產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變 體。所述的一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法，其特征在于所 述的刪除或插入失活方法是指下列方法之一(1)先用重疊PCR方法從糖多孢 紅霉菌基因組中擴增出紅霉素3"-0-甲基轉移酶編碼基因ei^ 缺失或部分缺失 的重疊DNA片段，將其克隆到質粒pWHM3上構建成同源重組質粒，再將此質 粒轉化到糖多孢紅霉菌中，使其發生染色體同源重組，篩選出^vG基因失活的 糖多孢紅霉菌突變體，其發酵產物為紅霉素C; (2)用PCR方法擴增出紅霉 素^G基因部分DNA片段，將其克隆到質粒pWHM3上，構建成同源重組質 粒，將此質粒轉化到糖多孢紅霉菌中，使其經染色體同源重組插入到eo^基因 上，從而使其蛋白產物EiyG失活，得到產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體；(3) 用限制酶酶切的方法從糖多孢紅霉菌基因組文庫中將紅霉素基因的部分 DNA片段亞克隆到質粒pWHM3上，構建成同源重組質粒，將質粒轉化到糖多 孢紅霉菌中，使其經染色體同源重組插入到e/jG基因上，從而使其蛋白產物 EiyG失活，得到產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體；(4)先用PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴增出紅霉素基因全部或部分DNA片段，將其克隆 到質粒pWHM3上，接著將選擇標記基因(如抗性基因)克隆到質粒pWHM3 插入片段中間的合適位置上，構建成同源重組質粒，將質粒轉化到糖多孢紅霉 菌中，使其發生染色體同源重組，篩選出e/jG基因失活的糖多孢紅霉菌突變體， 其發酵產物為紅霉素C。所述的一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法，其特征在于具體 做法是用重疊PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴增出缺失e/j(7基因起始密 碼子下游343-632nt的同源DNA片段Zi( ，將其克隆到同源重組質粒pWHM3上， 構建了pWHMAG。將pWHMAG質粒轉化到糖多孢紅霉菌中，使其與染色體 發生同源重組，篩選出e/y(7基因失活的糖多孢紅霉菌突變體。以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模版，用重疊PCR方法擴增出去除EryG S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結合位點DNA序列在內290bp的約1600bpDNA片段， 克隆于同源重組質粒pWHM3，構建了同源重組質粒pWHMAG。 PEG介導原生 質體轉化法將pWHMAG轉入糖多孢紅霉菌A226，通過同源重組整合到紅霉素合 成基因位點上。整合體在無抗R3M斜面培養基上連續生長三代后，制備原生質 體涂R3M平板。利用薄層層析(TLC)， PCR和質譜(MS)方法篩選出一株ei^G 基因失活的糖多孢紅霉菌A226G—突變體r此A226G—突變體只能積累中間產物紅 霉素C而不再合成紅霉素A。通過引入正常eiyG基因表達質粒可恢復A226G—突變 體紅霉素A的合成能力，但產量比出發菌株A226要低。
圖1 pWHMAG質粒的酶切驗證 1: DNAMarkerl5 000;2: pWHMAG質粒五co R I和fi/"d III酶切產物 圖2整合體I和II的PCR驗證1: DNA Marker 2 000;2:整合體I的ter基因PCR產物；3:整合體II的ter基因PCR產物 圖3整合體I和II中質粒整合位點的確定1:紅霉素A (ErA)標準品；2:糖多孢紅霉菌A226發酵液；3:整合體I發酵液；4:整合體II發酵液 圖4糖多孢紅霉菌A226G—突變體的TLC鑒定1:紅霉素A (ErA)標準品；2:糖多孢紅霉菌A226發酵液；3: A226G—突變體發酵液；4:整合體I發酵液 圖5 A226G-突變體的PCR驗證1: DNA Marker 2 000;2: A226G-突變體的e/yG的PCR產物；3: A226野生菌的e/yG的PCR產物 圖6 A226G—突變體發酵產物的MS鑒定1: 720.17為[ErC]H+;2: 702.17為￡|><:-1120111+ 圖7 pZMWG質粒的酶切驗證1: DNAMarkerl5 000;2: pZMWG質粒7Vrfe I和RV酶切產物 圖8互補測驗1:紅霉素A (ErA)標準品；2:糖多孢紅霉菌A226發酵液；3:工程菌A226G—G+發酵液；4:整合體I發酵液
具體實施例方式
1材料與方法 1.1材料l丄l菌種和質粒糖多孢紅霉菌A226、大腸桿菌ET12567、同源重組質粒pWHM3、糖多孢紅 霉菌染色體整合型表達載體pZMW、大腸桿菌DH5ou克隆質粒pUC18為本室保存；質粒pUCAG、 pWHMAG、糖多孢紅霉菌突變體A226G-、質粒pZMWG、糖多孢紅霉菌工程菌A226G—G+為本研究構建。1.1.2培養基、緩沖液和試劑LB培養基、TSB培養基、R3M培養基、PEG3350-T緩沖液和改進P緩沖液。 硫鏈絲菌肽(Thiostrepton，Tsr)、氯樸霉素(Apramycin， Am) 、 PEG3350為Sigma公司產品，溶菌酶為Fluka公司產品，蛋白酶K為AMRESCO公司產品，TSB為DIFCO公司產品，限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker (DL2 000和DL15 000)為大連寶生物公司產品，RNaseA、 dNTP、 pfu和TaqDNA聚合酶為上海生工公司產品，質粒提取試劑盒和PCR產物回收試劑盒為道普生物科技(北京)有限公司產品，其它試劑為分析純。1.2方法1.2.1大腸桿菌的培養、感受態細胞的制備、質粒的酶切、連接、轉化；質粒提 取、PCR產物純化按道普生物科技(北京)有限公司產品說明書進行 1.2.2糖多孢紅霉菌A226的培養和基因組DNA的提取 1.2.3 AG DNA片段重疊PCR弓|物的設計為刪除糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3"-0-甲基轉移酶編碼基因(《j(7)中 間部分290bp DNA序列(對應于Genbank Accession No. AM420293序列中的 823972-824261nt)，在刪除位點兩側各擴增一段同源片段。為了兩同源片段間進 行重疊PCR擴增，上游片段Fral的反向引物和下游片段Fra2的正向引物完全互 補，這樣經重疊PCR擴增的DNA片段不含SAM結合位點DNA在內的2卯bp DNA 片段(相對于e/jG基因起始密碼子下游的343-632nt)。上游片段Fral:Pll: 5'-accGAATTCtgtacaacctggcggtccggcacg (大寫字母表示Eco R I識別 位點)，P12: 5'-ctccaccgggatgccgccggacagcggtcaggtcgacgccgacgatcctggcc 下游片段Fra2:P21s 5，-ggccaggatcgtcggcgtcgacctgaccgctgtccggcggcatcecggtggag，P22: 5'-gaAAGCTTgggcaccgccggcgagatcg (大寫字母表示好/"d III識別位點)1.2.4糖多孢紅霉菌紅霉素ei^G基因PCR引物的設計根據GenBank公布的糖多孢紅霉菌紅霉素ei^G基因序列(Genbank Accession No. AM420293)，設計并合成了l對引物上游引物P1: 5'-cggCATATGagcgtgaagcagaagtcagc (大寫字母表示iVrfe I 識別位點)下游引物P2: 5'-gtgAAGCTTGATATCtacgcgccgggcttg(大寫字母表示HZ"d III和EcoRV識別位點) 1.2.5 AG DNA片段和eijG基因片段的PCR擴增 1.2.6糖多孢紅霉菌A226原生質體的制備和轉化1.2.7糖多孢紅霉菌A226::pWHMAG整合體I和1I及糖多孢紅霉菌A226G-突變 體的篩選1.2.8 A226::pWHMAG整合體I和II及A226G-突變體發酵液中紅霉素成分的薄 層層析(TLC)分析1.2.9 A226::pWHMAG整合體I和II的PCR鑒定1.2.10A226G—突變體PCR鑒定的引物序列設計按1.2.4節中設計的引物序列 1.2.11 A226G突變體發酵液中紅霉素成分的質譜(MS)分析 2結果與分析2.1同源重組質粒pWHMAG的構建以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模板，PCR先擴增出上游片段Fral和 下游片段Fra2，再以Fral和Fra2為模版、P11和P22為引物，用重疊PCR擴增 出全長約l 600bp的DNA片段AG，克隆到pUC18載體上構建了質粒pUCAG。 序列分析表明，所克隆的AG DNA片段序列與GenBank公布的序列完全一致(預 期的290bp DNA片段已被刪除)。pWHM3質粒為穿梭型質粒，在糖多孢紅霉菌中不能穩定存在，故可作為糖 多孢紅霉菌的同源重組質粒。pUCAG質粒中外源DNA用五co R I和H/wd m酶切 后連于pWHM3質粒相應酶切位點，轉化大腸桿菌DH5a獲得了pWHMAG質粒 (圖l)。為避免糖多孢紅霉菌對外源基因甲基化特異的限制性作用，將pWHMAG質 粒轉化大腸桿菌ET12567，得到了無甲基化修飾的pWHMAG質粒。2.2糖多孢紅霉菌A226::pWHMAG整合體I和II的篩選將糖多孢紅霉菌A226制成原生質體，用pWHMAG質粒轉化，在含30ng/mL Tsr的R3M固體培養基上進行篩選。因pWHMAG質粒在糖多孢紅霉菌中不能復 制，只有整合到染色體上才能賦予菌體Tsr抗性。從轉化平皿中挑取110個單菌落 涂含30ng/mL Tsr的R3M斜面，有2個菌落可正常生長，分別命名為 A226::pWHMAG整合體I和II 。提取整合體I和II基因組DNA做模板，PCR擴 增pWHMAG質粒上Tsr抗性基因ter進行鑒定。1.2。/。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示， PCR產物位于768bp附近(圖2)，表明pWHMAG質粒已整合到A226的染色體 上。2.3整合體I和II中質粒整合位點的確定糖多孢紅霉菌紅霉素生物合成基因在染色體上以單一拷貝、成簇形式存在， 其中eovl /、 e/yv4//、 eijv4iZr、 eijC//、 eiyC2ZT、 e/j5Zr和ei3;G為一條多順反子， 共同受到e/^4 /啟動子的控制。若pWHMAG質粒與A226染色體在同源片段Fral 內發生同源重組，那么e/yG基因的表達將會受到阻斷，整合體發酵液就會積累紅 霉素A生物合成的中間產物紅霉素C;若在同源片段Fra2內發生同源重組，那么 e/3;G基因的表達將不會受到影響，整合體仍然可以合成紅霉素A。為了確定pWHMAG質粒的整合位置，提取整合體I和II發酵液中的紅霉素 做薄層層析(TLC) ， TLC結果顯示整合體I是在同源片段Fral內發生同源重 組的，而整合體II是在同源片段Fra2內發生同源重組的(圖3)。在整合體I紅霉素發酵液中仍有少量的紅霉素A，說明即使是在同源片段 Fral內發生同源重組也沒有完全阻斷e/5;G基因的表達，這暗示著e/j(7基因可能 有單獨的啟動子。2.4糖多孢紅霉菌A226G—突變體的篩選質粒pWHMAG在染色體上不穩定，在無抗生素選擇壓力時會自動經染色體 二次重組脫落。若第二次重組與第一次重組發生在同一同源片段內，質粒脫落 后染色體會回復到質粒整合前狀態，菌株恢復紅霉素A合成能力；若第二次重組 與第一次重組發生在不同的同源片段內，質粒脫落后e^G基因DNA序列中預期 的2卯bpDNA片段會發生刪除突變，突變株將失去紅霉素A合成能力，發酵液中 會有紅霉素C的積累。糖多孢紅霉菌A226::pWHMAG整合體I在無Tsr的R3M斜面上連續傳三代 后，將制得的原生質體不同濃度稀釋液涂無Tsr的R3M平皿。從平皿中挑取約l 000個單菌落，各連續涂含3(Hig/mLTsr的R3M斜面和無Tsr的R3M斜面，其中有 5個菌落僅可以在無Tsr的R3M斜面上生長。提取這5個克隆的紅霉素做TLC， 結果表明只有4號克隆僅可以積累紅霉素C，此克隆命名為A226G—(圖4)。其余 4個克隆都為回復突變。將A226G突變體進行液體培養，提取基因組DNA,以eo^基因上游引物 Pl和下游引物P2進行PCR擴增，與野生菌基因組的PCR產物相比較，A226G— 突變體的PCR產物已發生刪除突變(圖5)。對PCR產物直接進行序列分析 也表明此突變株岬G基因中間部分預期的290bp已被刪除。 2.5糖多孢紅霉菌A226G-突變體發酵產物的質譜(MS)鑒定將糖多孢紅霉菌A226G-突變體的50mL發酵液用乙酸乙酯萃取，水浴濃縮 后用質譜儀檢測A226G突變體發酵液的紅霉素成分。MS鑒定結果顯示A226G— 突變體發酵液中僅積累紅霉素C，而且也沒有檢測到上一步中間產物紅霉素D (圖6)，說明糖多孢紅霉菌紅霉素C-12位羥基化酶EryK可以完全把其底物紅 霉素D轉化成紅霉素C。 2.6A226G—突變體中e/jG基因的功能補償 2.6.1糖多孢紅霉菌表達質粒pZMWG的構建以糖多孢紅霉菌A226總DNA為模板,上游引物Pl和下游引物P2進行PCR 擴增出efj( 基因，克隆到pUC18載體上構建了質粒pUCG。序列分析表明，所 克隆的e/^G片段序列與GenBank公布的序列完全一致。將pUCG中的eijGDNA片段亞克隆至糖多孢紅霉菌表達載體pZMW中， 構建了質粒pZMWG。 iVrfe I和￡a> RV酶切pZMWG質粒后獲得預期大小的 兩個片段(圖7)。 2.6.2互補測驗將糖多孢紅霉菌突變體A226G—制成原生質體，用pZMWG質粒轉化，在含 125fig/mLAm的R3M固體培養基上進行篩選。從轉化平皿中挑取6個單菌落涂含 125fig/mL Am的R3M斜面，這6個克隆均可正常生長，命名為^266《+ I 、 II 、 m、 IV、 V、 VI。接種^2601+ I和A226于100mL TSB培養基/500mL三角燒瓶，30。C振蕩培養96h，提取紅霉素，TLC結果顯示A226GXT I恢復了紅霉素A 的生產能力，但產量比野生菌A226要低(圖8)。
權利要求
1. 一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法，其特征在于利用染色體同源重組的性質，將糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3″-O-甲基轉移酶編碼基因eryG刪除，或將含有EryG S-腺苷甲硫氨酸SAM結合位點對應的DNA序列在內的染色體片段刪除，或對eryG基因插入失活，得到產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體。
2、 根據權利要求1所述的一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構 建方法，其特征在于所述的刪除或插入失活方法是指下列方法之 一(1)先用重疊PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴增出紅霉 素3"-0-甲基轉移酶編碼基因ei^G缺失或部分缺失的重疊DNA片 段，將其克隆到質粒pWHM3上構建成同源重組質粒，再將此質粒 轉化到糖多孢紅霉菌中，使其發生染色體同源重組，篩選出ei^G 基因失活的糖多孢紅霉菌突變體，其發酵主要產物為紅霉素C; (2) 用PCR方法擴增出紅霉素e/jG基因部分DNA片段，將其克隆到 質粒pWHM3上，構建成同源重組質粒，將此質粒轉化到糖多孢紅 霉菌中，使其經染色體同源重組插入到eo^基因上，從而使其蛋白 產物EryG失活，得到產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體；(3)用 限制酶酶切的方法從糖多孢紅霉菌基因組文庫中將紅霉素e/jG基 因的部分DNA片段亞克隆到質粒pWHM3上，構建成同源重組質 粒，將質粒轉化到糖多孢紅霉菌中，使其經染色體同源重組插入到 ei^7基因上，從而使其蛋白產物EryG失活，得到產紅霉素C的糖 多孢紅霉菌突變體；(4)先用PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中 擴增出紅霉素e/j( 基因全部或部分DNA片段，將其克隆到質粒 pWHM3上，接著將選擇標記基因(如抗性基因)克隆到質粒 pWHM3插入片段中間的合適位置上，構建成同源重組質粒，將質 粒轉化到糖多孢紅霉菌中，使其發生染色體同源重組，篩選出eo^ 基因失活的糖多孢紅霉菌突變體，其發酵產物為紅霉素C。
3、 根據權利要求2所述的一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構 建方法，其特征在于具體做法是用重疊PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴增出缺失e/yG基因起始密碼子下游343-632nt的同源 DNA片段」G，將其克隆到同源重組質粒pWHM3上，構建了 pWHMAG。將pWHMAG質粒轉化到糖多孢紅霉菌中，使其與染 色體發生同源重組，篩選出e7G基因失活的糖多孢紅霉菌突變體。
全文摘要
本發明公開一種產紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構建方法，利用染色體同源重組的性質，將糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3″-O-甲基轉移酶編碼基因eryG起始密碼子下游的343-632nt的290bp DNA序列(對應于GenbankAccession No.AM420293序列中的823972-824261nt)刪除，利用薄層層析、PCR和質譜方法篩選出一株eryG基因失活的糖多孢紅霉菌突變體，此突變體主要積累中間產物紅霉素C，而不再合成紅霉素A。
文檔編號C12N15/09GK101255413SQ200810019010
公開日2008年9月3日 申請日期2008年1月8日 優先權日2008年1月8日
發明者張部昌, 華 袁 申請人:安徽大學