專利名稱：利用酵母表達系統生產DSPAα1的方法
技術領域：
本發明涉及一種纖溶酶原激活劑的生產方法，尤其涉及一種利用酵母表達系統生產 重組吸血蝙蝠纖溶酶原激活劑去氨普酶al (DSPAal)的方法，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
去氨普酶(DSPA)是南美一種吸血蝙蝠唾液中分離的纖溶酶原激活劑，主要包括四 種蛋白質DSPAal、 DSPAa2、 DSPAp和DSPAy。試驗發現，其中DSPAal具有最好的生物 化學和藥理學性質，所以被進一步研究。研究表明在纖維蛋白刺激下，DSPAal活性增 加10500倍，而組織纖溶酶原激活劑(tPA)僅為550倍；在纖維蛋白與纖維蛋白原存 在的條件下，DSPAal活性的比率為12900倍，而tPA僅為72倍，DSPAal具有更高的纖 維蛋白選擇性。藥理學研究表明，在肺栓塞的模型中，與tPA相比，DSPAal具有更好的 纖維蛋白凝塊專一性；在鼠的人工模型中，DSPAal也表現出比tPA更好的纖維蛋白專一 性和更長的半衰期；在狗急性心肌梗塞的冠狀血栓形成模型中，DSPAal具有更快的再灌 注和更低的再閉塞率；在鼠腸系膜靜脈模型中，相比較與tPA， DSPAal表現出較低的出 血率；另外在鼠和獼猴藥理學實驗中，DSPAal也表現出比tPA更低的清除率。在實驗過 程中，未發現DSPAal直接的毒性作用，僅在大劑量時表現出副作用。
目前DSPAal已進行了 II期臨床實驗DIAS試驗及DEDAS試驗，其中DIAS試驗結 果表明安慰劑對照和給藥兩組血流再灌注率分別達到46. 7%和71. 4%,患者腦部栓塞 血流獲顯著改善，有效的阻止了腦部損傷。90天時，兩組分別有46. 7%和60%的患者達 到主要臨床終點，顱內出血發生率兩組均為3.3M(tPA在大型試驗中，出血發生率為6% 左右)；DEDAS試驗是一個多中心、劑量遞增的II期臨床試驗研究，目的為評價急性腦 缺血癥狀發作3 9小時內，DSPAal隨劑量遞增(具體試驗劑量未見報道)的療效和安 全性，結果表明共有38例病人在卒中癥狀發作3 9小時內接受了安慰劑治療、 90mcg/kg的DSPAal治療或125mcg/kg的DSPAal治療，受試者的入選標準是MRI證實 彌散灌注缺失面積達2(^以上和皮層組織低灌注區域超過2cra，在第90天時，安慰劑組 有25%的病人臨床結果有所改善，90mcg/kg組有28.6%的病人結果有所改善，而 125mcg/kg組的比例為6(^。重要的是，在接受治療的病人中，無人出現腦出血。
DSPAal早期直接從吸血蝙蝠唾液腺中分離，但含量少，純化成本高，難以大量獲 得。國外也進行了利用基因工程的方法生產DSPAal，包括在植物中、昆蟲細胞sf9和中 國倉鼠卵巢細胞CHO中表達，其表達量分別達到30mg/L、 10mg/L和60mg/L,但由于這 些表達系統中表達量較低，且具有成本髙、周期長、技術難度高等缺點，不利于大規模 的工業化生產。
酵母表達系統既有原核生物生長快、操作簡單的優點，又具有真核生物能夠對蛋白 質進行翻譯后修飾的優點，能夠表達糖蛋白等結構復雜蛋白。酵母表達系統主要有釀酒 酵母表達系統和畢赤酵母表達系統等。釀酒酵母具有一定的局限性，如產量低、表達質
4粒易丟失、外源基因過度糖基化、分泌效果差、不適合高密度發酵等。基于上述問題， 人們利用其它酵母菌株構建了可高效穩定表達外源基因的新表達系統，即甲醇營養型酵 母表達系統。作為第二代酵母表達系統，它克服了釀酒酵母表達系統的諸多不足，尤其 是其中的畢赤酵母表達系統已成為目前廣泛應用的理想的基因表達系統。
畢赤酵母(尸/c力^ pa^or&)表達系統是上個世紀70年代隨著人們對甲醇利用酵
母的研究而發展起來的。最初的目的是尋找甲醇利用菌來消化環境中的甲醇，從而發現 了畢赤酵母等幾種甲醇利用酵母，當初畢赤酵母只用于制備單細胞蛋白，由此形成了畢 赤酵母的發酵技術。80年代畢赤酵母被開發成一種異源表達系統，到1985年，Cregg等 首次報道了利用CaCl2-聚乙二醇介導原生質轉化法成功的將帶有His4選擇標記的質粒轉 入組氨酸脫氫酶基因缺陷型畢赤酵母菌株GS115中，使轉化效率提高到105轉化子Aig。在 1994年，Faber等又發現了電擊法可提高酵母細胞的轉化率，且線狀的質粒比環狀的質 粒轉化效率高。
畢赤酵母表達系統相比其它表達系統更具有較大的優勢能對蛋白質翻譯后加工、 糖基化適度、菌體生長速度快、操作簡單、費用低廉、適合高密度發酵等。已有大量的 蛋白質類藥物在畢赤酵母中成功表達，人血清白蛋白在畢赤酵母中通過高密度發酵，其 表達量達到10g/L;破傷風毒素片段C的表達量達到12g/L。對溶栓蛋白質來說，前期有 tPA在畢赤酵母中表達的報道，但由于較低的酶活而不適于工業化生產；2007年，有報 道DSPAa2在畢赤酵母中表達，其表達量僅為25mg/L，但至今還未見DSPActl在畢赤酵 母中成功表達的報道。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種適合于工業化生產的利用酵母表 達系統生產DSPAal的方法。
本發明所述的酵母表達系統是畢赤酵母表達系統，這一系統能夠高水平表達異源蛋白質。
本發明的技術方案是合成DSPAal基因序列或在不改變DSPAal氨基酸序列的基礎 上，對DSPAal基因密碼子按照畢赤酵母偏好密碼子進行基因序列優化，然后對合成的或 優化的基因序列兩端進行限制性內切酶酶切后，將其克隆到畢赤酵母中進行穩定表達。 實驗證實表達的DSPAal蛋白質具有真核細胞的修飾基團，且具有生物學活性。
本發明所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，具體步驟包括(1)合成 DSPAal基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優化DSPAal基因的核苷酸序 列；(2)雙酶切合成的或優化的DSPAal基因序列，構建重組表達質粒X-DSPAal (X代 表可選擇的表達質粒)；(3)轉化畢赤酵母菌株細胞及平板篩選陽性轉化子；(4)畢赤 酵母重組菌株發酵篩選；(5)由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAal。
上述步驟(1)中所述合成DSPAal基因的核苷酸序列指DSPAal野生型基因序列， Gene Bank登錄號為M63986; DSPAal的基因序列也可以是DSPAal突變體，即對DSPAal 野生型進行優化而得。所述按照畢赤酵母偏好密碼子序列優化DSPAal基因的核苷酸序 列的方法是在不改變DSPAal氨基酸序列的基礎上按照畢赤酵母偏好密碼子對DSPAal 全基因序列進行合成，并在兩種DSPAal 5'端引入/力at酶切位點和釀酒酵母a因子信號肽Kex2切割信號氨基酸密碼子AAMGA，同時在3'端引入fcoRI或;V"I酶切位點， 合成的DSPAal優化基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
上述步驟(2)中所述構建重組表達質粒的方法是指利用和fcoRI雙酶切合成 的或優化的DSPAal基因序列，將其克隆到表達質粒a因子下游，再酶切連接獲得重組 表達質粒X-DSPAal (X代表可選擇的表達質粒，如pPIC9K、 pPIC9、 pPICZaA/B/C、 pGAPZaA/B/C)。
上述重組表達質粒X-DSPAal可以是pPIC9K — DSPAal 、 pPIC9 — DSPAal 、 pPICZaA/B/C—DSPAal、 pGAPZaA/B/C—DSPAal、 pPIC3. 5K—DSPAal或pA0815—DSPAal。
其中所述重組表達質粒X-DSPAal優選pPIC9K—DSPAal或pPIC9—DSPAal 。
其中重組表達質粒pPIC9K-DSPAal具體的構建方法是將DSPAal克隆到pPIC9a 因子下游，然后利用5p/ I、 fcoRI雙酶切pPIC9-DSPAal和pPIC9K，將含有DSPAal的 pPIC9-DSPAal酶切片段與含卡那霉素抗性基因的pPIC9K片段利用T4 DNA連接酶連接， 得重組表達質粒pPIC9K -DSPAal 。
上述步驟(3)中所述轉化畢赤酵母菌株細胞的方法包括電擊轉化和化學轉化等。
其中電擊轉化是指利用^scl或5"aH對構建的重組質粒進行線性化，然后以電壓 1.5kV，電容25PF，電阻200Q ，放電時間4.0ms電擊轉化畢赤酵母菌株感受態細胞； 平板篩選陽性轉化子是指通過MD平板篩選獲得his+轉化子或含Zeocin的YPDS平板篩 選獲得陽性轉化子。
其中上述畢赤酵母菌株選自GS115、 X-33、 KM71、 SMD1168;其中優選GS115。
上述步驟(4)中所述畢赤酵母重組菌株發酵篩選是指在平板挑取轉化子接種于培 養基中，通過搖瓶發酵篩選，獲得高分泌表達DSPAal的畢赤酵母菌株。
其中所述的培養基包括BMGY/BMMY、 BMG/BMM、 YPD;其中優選BMGY/BMMY培養基。
上述MD平板的配方是(/L): 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4xl(T"/。生物素； 2c/。D-葡萄糖。
上述YPD培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨2% D-葡萄糖。 上述YPDS培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；2% D-葡萄糖，1M
山梨醇。
上述BMGY培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；lOOmM磷酸緩沖液 (pH 6.0) ; 1. 34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 X1(T%生物素；1%甘油。
上述BMMY培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；100 mM磷酸緩沖液 (pH 6.0) ; 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 X 10、生物素；0.5%甲醇。
上述BMG培養基的配方是(/L): lOOraM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵 母氮源(YNB) ; 4X10、生物素；1%甘油。
上述B函培養基的配方是(/L): lOOmM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵
6母氮源(YNB) ; 4X10—5%生物素；0. 5%甲醇。
上述步驟(5)中所述由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPActl的方法是 15。C 25'C溫度條件下，先將畢赤酵母重組菌株表達上清液用截留分子量10Kda的超濾 器超濾，使其濃縮到符合陽離子交換層析柱上樣條件，然后將其加樣到用平衡緩沖液平 衡的陽離子交換層析柱上進行洗脫，去除雜蛋白和非蛋白雜質，再利用凝膠過濾層析柱 進行上樣洗脫，去除二聚體和小分子雜質，洗脫中出現唯一的洗脫峰，即為純化DSPAal 產物。
其中所述陽離子交換層析柱的層析介質選自羧基、羧甲基、磺酸基、磺甲基、磺 乙基、磺丙基或磷酸基衍生的葡聚糖、硅膠微粒、瓊脂糖、聚乙烯醇系、苯乙烯及二苯 乙烯、纖維素或者交聯的聚丙烯酰胺系列介質。
上述分離純化DSPAcd的方法中優選的陽離子交換層析柱優選CM s印harose FF 層析柱或SP S印hadex C-50層析柱或SP-650-S層析柱。
上述分離純化DSPAcd的方法中所述平衡緩沖液選自pH5. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液 或Na2HP0f擰檬酸緩沖液。
上述分離純化DSPAcd的方法中所述凝膠過濾層析的方法是將經陽離子交換層 析分離，濃縮后的蛋白濃度不超過50mg/ml的樣品上樣到凝膠過濾層析柱，以 pH6. 0-7. 5，內含0.卜O. 2M NaCl的Tris-HC1緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Na2HP04-檸檬酸 緩沖液為洗脫液進行洗脫，以波長為280nm檢測收集液，洗脫液曲線只有唯一的吸收峰， 收集峰值洗脫液，即為純化DSPAal的提取液。
其中所述凝膠過濾層析柱的層析介質選自交聯瓊脂糖、交聯聚乙烯醇、葡聚糖凝 膠、烯丙基葡聚糖與N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺聚合凝膠或葡聚糖與高交聯瓊脂糖的復 合凝膠；且介質能分離分子量在3， 000 300， OOODa的蛋白。
上述分離純化DSPAal的方法中優選的凝膠過濾層析柱優選S印hadex G-75或 Superdex G-75或S印hacry1-100層析柱。
上述分離純化DSPAal的方法中所述對陽離子交換層析分離的樣品的濃縮用截留 分子量為5KDa的超濾管進行。
上述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法中所述純化DSPAal的提取液能 以常規方法真空冷凍干燥制得固體的DSPAal粉末，可以直接用于制劑的研究和制備。
本發明有四個顯著優點(1)通過對DSPAal基因序列進行畢赤酵母密碼子偏好性 優化，使其更適于在畢赤酵母中表達；(2) DSPAal搖瓶發酵表達量可達到75mg/L,并 且通過高密度發酵表達量有進一步提高的潛力；(3)利用畢赤酵母生產DSPAal的方法 成本低、周期短、技術上容易實現，適于工業化生產；(4)由畢赤酵母重組菌株表達上 清液中分離純化后的DSPAal最終純度大于97%以上，可以直接用于制劑的研究和制備。
圖l畢赤酵母表達DSPAal轉化子發酵液SDS-PAGE圖。 其中從左向右泳道M為蛋白質Marker，泳道l為空白畢赤酵母發酵液，泳道2
7為誘導表達DSPAal畢赤酵母菌株。
圖2畢赤酵母表達DSPAcd轉化子發酵液酶活圖。
圖3是陽離子純化時的DSPAal洗脫圖。
圖4是DSPA(il經分子篩純化時的洗脫圖。
圖5是DSPAal的SDS-PAGE電泳圖。 其中泳道M為蛋白質Marker，泳道l為DSPAal。
圖6是經TSK分析后的DSPAal高效液相圖。
具體實施例方式
以下實施例將進一步說明本發明，但不限制本發明。
實施例l
1、 DSPAal基因及畢赤酵母偏好密碼子序列基因合成
合成DSPAal基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優化DSPAal基因的
核苷酸序列。
在不改變DSPAal氨基酸序列的基礎上按照畢赤酵母偏好密碼子對DSPAal全基因序 列進行合成，并在DSPAal 5'端引入J力aL酶切位點和釀酒酵母a因子信號肽Kex2切割信號 氨基酸密碼子(AAAAGA)，同時在3'端引入fcoRI或〃ofl酶切位點，合成的畢赤酵母偏好 密碼子優化DSPAal基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示(合成工作由上海生工生物工 程技術服務有限公司承擔)。
2、 重組質粒構建
步驟如下利用限制性內切酶i7 oI和fcoRI雙酶切上述l中DSPAal合成基因和pPIC9 表達載體，凝膠回收法純化1.4kb和8.0kb的目標片段，然后利用T4 DNA連接酶對酶切片 段進行連接，16。C連接過夜，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，通過LB平板(含Amp)篩 選陽性克隆，隨機挑取單克隆，抽提重組質粒(記作pPIC9-DSPAal)，通過酶切鑒定陽
性克隆。
然后利用&M、 fcoRI雙酶切重組質粒pPIC9-DSPAal,凝膠回收6.0kb帶，然后連接 到相同酶切的pPIC9K載體片段(4.8kb)上，獲得重組質粒pPIC9K-DSPAal，通過酶切鑒 定陽性克隆。
3、 畢赤酵母菌株轉化及平板篩選
利用限制性內切酶/Z; al酶切重組質粒pPIC9K-DSPAal和空白質粒pPIC9K，取5嗎 2(Vg質粒進行電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞。
所用Gen印ulsterII電轉化儀(Bio-Rad laboratories Inc., Hercules, CA)的參 數是電壓1.5kV，電容25PF，電阻200Q ，放電時間4.0ms。
電擊后立即加入1.0mL冰冷的1.0mol/L山梨醇，迅速涂MD平板(His-), 28 —30。C培 養，篩選His+轉化子。
4、 畢赤酵母重組菌株發酵篩選
隨機選取陽性菌株(同時挑取空白質粒轉化菌株作為對照)進行搖瓶發酵初步篩選， 篩選方法如下從MD平板上隨機挑取單克隆于YPD培養基中，28°C 200r/min過夜培養； 接5 8% (v/v)菌液到液體BMGY培養基(20mL/150mL三角瓶)中，于28。C 200r/min培養;
8待菌體密度生長到OD6oo"5-15時，4, 000r/min離心5min收集菌體，用液體BMMY培養基重 懸沉淀，再接種至BMMY培養基(50mL/500mL三角瓶，p服.O)中，使其0D柳"2.0， 20°C， 220r/min培養，每天補加0.5%甲醇(v/v)，其間以SDS-PAGE檢測蛋白質表達量(圖l)， 并同時檢測酶活(圖2)、 pH、生物量，每一樣品平行兩份進行檢測。
其中酶活檢測方法按照纖溶平板法檢測，方法是制作纖維蛋白平板，在平板上打 孔徑為2mm的孔，孑L內分別加入標準品和待測樣品，每孔10ul，每稀釋度做2孔，37T濕 盒中孵育24h，縱向和橫向量取溶圈直徑，以標準品溶液的標準曲線定量樣品的活性。
結果通過上述搖瓶發酵篩選，獲得了具有高分泌表達DSPActl的畢赤酵母菌株 GS115/pPIC9K-DSPAcd，其生產出的DSPAal具有天然生物學活性，且搖瓶發酵表達量達 到75mg/L，初步達到工業化生產水平，為DSPAal的進一步生產和開發應用奠定了基礎。
5、 由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAcd
先用pH為6. 0，濃度為20mraol/L的磷酸鹽緩沖溶液對超濾器和大孔徑(lOKDa)超 濾膜進行平衡，保持進出口壓力分別為1.3bar和0.3bar，然后對畢赤酵母重組菌株表 達上清液進行濃縮，當濃縮至1L左右時，用2倍體積的上述磷酸鹽緩沖液稀釋，之后 再繼續超濾至1L左右，如此稀釋3次，收集濃縮液，備用。
用濃度為20mmol/L， pH為6. 0磷酸鹽的平衡緩沖液平衡CM s印harose FF (1. 6X 15cm)層析柱2 3個柱體積，將上述超濾后的濃縮液上柱，進行陽離子交換層析。
具體步驟是用濃度為2Ommol/L， pH為6. 0磷酸鹽的平衡緩沖液平衡層析柱3個 柱體積，換用濃度為20mmol/L， pH為6. 8磷酸鹽緩沖液沖洗2個柱體積，待基線平穩 后接著用20mmol/L， pH為6. 8含0. 5M NaCl磷酸鹽緩沖液，從0-0. 5國aCl線形洗脫10 個柱體積，收集洗脫液(見圖3)。
對陽離子交換層析所得到的洗脫液樣品經截留分子量為5KDa的超濾管一次超濾濃 縮到一定體積，以蛋白濃度不超過50mg/ml為準。
選用1. 6cmX80cm的S印hadex G-75層析柱進行凝膠過濾層析，先用20mM Tris-HC1、 pH 7. 4、內含0.15M NaCl緩沖液平衡2個柱體積，然后將濃縮后的經陽離子交換層析 分離的樣品上樣，以0. 5ml/min的流速洗脫，以波長為280nra檢測收集液，洗脫液曲線 只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脫液，即為純化DSPAal的提取液(見圖4)。
純化DSPAal的提取液以常規方法真空冷凍干燥，制得固體的DSPAal粉末。
6、 DSPAal純度分析
(1) SDS-PAGE電泳
將上述得到的DSPAal進行SDS-PAGE電泳分析。
取凝膠過濾層析所得的DSPAal的提取液濃縮，不低于lOHg上樣，進行非還原電泳， 考馬斯亮藍染色，經電泳灰度掃描后純度在95%以上(見圖5)。
(2) TSK柱純度分析
將上述得到的DSPAal進行TSK-2000高壓液相純度分析，流動相為0.1M磷酸鹽緩 沖液含O. lmol/LNaCl，pH7.0。上樣量不低于20Pg，于波長280nm處檢測，按面積歸一 法計算，純度在97%以上(見圖6)。
實施例2
91、 DSPAal基因及畢赤酵母偏好密碼子序列基因合成 步驟同實施例l。
2、 重組質粒構建
利用J力oI和Abtl雙酶切構建的pPIC9K-DSPAal，回收含DSPAal片段，并與相同酶切 的表達質粒pPICZaA用T4 DNA連接酶連接，構建重組質粒pPICZaA-DSPAal。
3、 畢赤酵母菌株轉化及平板篩選
^7I線性化質粒pPICZaA-DSPAal和空白質粒pPICZaA，取5嗎 20嗎質粒進行電擊轉 化畢赤酵母GS115感受態細胞。
所用Gen印ulsterII電轉化儀(Bio-Rad laboratories Inc. ， Hercules, CA)的參 數是電壓1.5kV，電容25PF，電阻200Q，放電時間4. Oms。電擊后立即加入l. OmL冰冷 的1.0mol/L山梨醇，28-3(TC靜置溫育l 2h，然后涂布YPDS (含100mg/ml Zeocin)平板， 28-3(TC培養。
4、 畢赤酵母重組菌株發酵篩選
隨機選取陽性菌株(同時挑取空白質粒轉化菌株作為對照)進行搖瓶發酵初步篩選， 篩選的培養基是BMGY/BMMY。篩選方法如下從YPDS平板上隨機挑取單克隆于YPD培養基 中，具體畢赤酵母重組菌株發酵篩選同實施例l發酵篩選部分。
5、 由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAal
用pH為6. 4，濃度為20mraol/L的化2朋04-檸檬酸緩沖溶液對超濾器和大孔徑(10KDa) 超濾膜進行平衡，保持進出口壓力分別為1.2bar和0.2bar，然后對畢赤酵母重組菌株 表達上清液進行濃縮，當濃縮至1L左右時，用2倍體積的上述磷酸鹽緩沖液稀釋，之 后再繼續超濾至1L左右，如此稀釋3次，收集濃縮液，備用。
將上述超濾后的濃縮液上樣至預先用濃度為20mmol/L, pH為6. 4磷酸鹽的平衡緩 沖液平衡好的SP S印hadex C-50 (1.6X10cm)層析柱2個柱體積，進行陽離子交換層 析。
具體步驟是用濃度為20mraol/L， pH為6. 4Na2HP04-檸檬酸的平衡緩沖液平衡層析 柱3個柱體積，換用濃度為20咖ol/L， pH為7. 0Na2HPO4-檸檬酸緩沖液沖洗2個柱體積， 待基線平穩后接著用20腳ol/L， pH為7. 0Na2HPO4-檸檬酸含0. 4M NaCl，從0-0. 4MNaCl 線形洗脫10個柱體積，收集洗脫液。
對陽離子交換層析所得到的洗脫液樣品經截留分子量為5KDa的超濾管一次超濾濃 縮到一定體積，以蛋白濃度不超過50mg/ml為準。
選用1. 6cmX85cra的Superdex G-75層析柱進行凝膠過濾層析，先用20mM NaH2P04-檸檬酸pH 7. 0、內含0. 2廳aCl緩沖液平衡2個柱體積，然后將濃縮后的經陽離子交換 層析分離的樣品上樣，以1. 5 ml/min的流速洗脫，在波長為280nm檢測收集液，洗脫 液曲線只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脫液，即為純化DSPActl的提取液。
純化DSPAal的提取液以常規方法真空冷凍干燥，制得固體的DSPA(xl粉末。
實施例3
1、 DSPAal基因及畢赤酵母偏好密碼子序列基因合成 步驟同實施例l。
102、 重組質粒構建
利用J力oI和Abtl雙酶切構建的pPIC9K-DSPAal，回收含DSPAal片段，并與相同酶切 的表達質粒pGAPaA用T4 DNA連接酶連接，構建重組質粒pGAPaA-DSPAal 。
3、 畢赤酵母菌株轉化及平板篩選
5^I線性化質粒pGAPaA-DSPAal和空白質粒pGAPaA，畢赤酵母菌株GS115轉化及平板 篩選同實施例2平板篩選部分。
4、 畢赤酵母重組菌株發酵篩選
隨機選取陽性菌株(同時挑取空白質粒轉化菌株作為對照)進行搖瓶發酵初步篩選， 篩選的培養基是BMG/BMM。篩選方法如下從YPDS平板上隨機挑取單克隆于YPD培養基中， 然后進行培養，28T220r/min發酵培養，其間以SDS-PAGE檢測蛋白質表達量，并同時檢 測酶活、pH、生物量，每一樣品平行兩份進行檢測。
其中酶活檢測方法按照纖溶平板法檢測，方法是制作纖維蛋白平板，在平板上打 孔徑為2rara的孔，孔內分別加入標準品和待測樣品，每孔10uL，每稀釋度做2孔，37T濕 盒中孵育24h，縱向和橫向量取溶圈直徑，以標準品溶液的標準曲線定量樣品的活性。
5、 由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAal
預先用pH為6. 6，濃度為20mmol/L的磷酸鹽(Na2HP04-KH2P04)緩沖溶液對超濾器和 大孔徑(10KDa)超濾膜進行平衡，保持進出口壓力分別為1.3bar和0.3bar，然后對畢 赤酵母重組菌株表達上清液進行濃縮，當濃縮至1L左右時，用2倍體積的上述磷酸鹽 緩沖液稀釋，之后再繼續超濾至1L左右，如此稀釋3次，收集濃縮液，備用。
用濃度為20mmol/L， pH為6. 6磷酸鹽的平衡緩沖液平衡SP-650-S (1. 6X 13cm)層 析柱2個柱體積，將超濾后的濃縮液上樣至平衡好的陽離子交換層析柱，進行陽離子交 換層析。
具體步驟是用濃度為20醒ol/L， pH為6.6磷酸鹽緩沖液平衡層析柱3個柱體積， 換用濃度為20nimol/L， pH為7. 6磷酸鹽緩沖液沖洗2個柱體積，待基線平穩后接著用 20mmol/L， pH為7. 6磷酸鹽含0. 3M NaCl,從0-0. 3MNaCl線形洗脫10個柱體積，收集 洗脫液。
對陽離子交換層析所得到的洗脫液樣品經截留分子量為5KDa的超濾管一次超濾濃
縮到一定體積，以蛋白濃度不超過50mg/ml為準。
選用1. 6cmX90cm的S印hacry1-100層析柱進行凝膠過濾層析，預先用20mM磷酸
鹽pH 7.6、含0.1MNaCl緩沖液平衡層析柱2個柱體積，然后將濃縮后的經陽離子交換
層析分離的樣品上樣，以lml/min的流速洗脫，在波長為280nm處檢測洗脫液，洗脫液
曲線只有唯一的吸收峰，即為純化DSPAal的提取液。
純化DSPActl的提取液以常規方法真空冷凍干燥，制得固體的DSPAal粉末。 本發明中LB平板的配方是(/L): 1%酵母抽提物；0.5%蛋白胨；1% NaCl。 本發明中MD平板的配方是(/L): 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4xl0's。/o生
物素；2n/。D-葡萄糖。
本發明中YPD培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；2。/。D-葡萄糖。 本發明中YPDS培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；2% D-葡萄
糖，1M山梨醇。
11本發明中BMGY培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；100 mM磷 酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 ><10'5%生物素；1%甘油。
本發明中BMMY培養基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；100 mM磷 酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 x 10_5%生物素；0.5%甲醇。
本發明中BMG培養基的配方是(/L): lOOmM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基 酸酵母氮源(YNB) ; 4X10、生物素；1%甘油。
本發明中BMM培養基的配方是(/L): lOOmM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基 酸酵母氮源(YNB) ; 4X10、生物素；0.5%甲醇。序列表
〈110〉齊魯制藥有限公司
〈120〉利用酵母表達系統生產DSPAal的方法
〈141〉 2008-01-11
〈160〉 1
〈210〉 1
〈211〉 1344
〈212〉 DNA
〈213〉畢赤酵母(/Vc力ia paWor^) 〈222〉 (1)…(1344) 〈400〉 1
ctcgagaaaagagcttacggtgttgcttgtaaggacg鄉tcactcagatgacttacaga60
agacaagagtcttggttgagaccagaagtcagatccaagagagttgaacactgtcagtgt120
gac卿ggtcaggct卿tgtcacactgttccagtcaactcttgttctgaaccaagatgt180
ttc犯cggtggtacttgttggcaggctgtctacttctctgacttcgtttgtcagtgtcca240
gctggttacactggt卿agatgtgaagttgacactagagctacttgttacgaaggtcag300
ggtgtcacttacagaggtacttggtctactgctgaatccagagttg犯tgtatcaactgg360
cagtcttccttgttgactagaagaacttacaacggt3g犯tgccagacgccttcaacttg420
ggtttgggtactgtagaaacccaaacggtgctccaaagccttggtgttac■
gtcatcaaggctggtaagttC￡LCttCtg￡Latcttgttctgttccagtctgttctaaggct540
acttgtggtttgagaaagtaC犯gg犯CC3cagttgcactctactggtggtttgttcact600
gacatcacttctcacccttggcaggctgctatcttcgctcatcctctggt660
gag3gattcttgtgtggtggtatcttgatctcttcttgttgggtcttgactgctgctcac720
tgtttccaggaatcttacttgccagaccagttg犯ggttgtcttgggtagaacttacaga780
gtcaagccaggtg鄉3柳gcagactttcaaggtc犯g8Lagtacatcgttcac犯ggEig840
ttcgatgacgacacttacaacaacgacattgctttgttgcagttgaagtctgactctcca900
cagtgtgctcaagaatctgactctgttagagctatctgtttgccagaagct犯cttgcag960
ttgccagactggactg犯tgtgagttgtctggttacggtaagcacaagtcttcttctcca1020
ttctactctgaac已gttgaagg犯ggtcacgtcagattgtacccatcttccagatgtgct1080
ccaaagttcttgttcaacaagactgttactaacaacatgttgtgtgctggtgacactaga1140
tccggtgaaatctaxxceLaacgttcacgacgcttgtcagggtgactctggtggtccattg1200
gtctgtatgacatgactttgttggg城C3tctcttggggtgttggttgt1260
ggtg卿3ggacgttccaggtgtctacactaaggttactaactacttgggttggatcaga1320
gac犯catgc3Cttgt犯g3attc134權利要求
1. 一種利用畢赤酵母表達系統生產DSPAα1的方法，步驟包括(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)雙酶切合成的或優化的DSPAα1基因序列，構建重組表達質粒X-DSPAα1；(3)轉化畢赤酵母菌株細胞及平板篩選陽性轉化子；(4)畢赤酵母重組菌株發酵篩選；(5)由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAα1；其特征是步驟(1)所述優化的DSPAα1基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；步驟(3)所述轉化畢赤酵母菌株細胞的方法采用電擊轉化或化學轉化；步驟(5)所述分離純化DSPAα1的步驟為15℃～25℃溫度條件下，先將畢赤酵母重組菌株表達上清液用截留分子量10KDa的超濾器超濾，使其濃縮到符合陽離子交換層析柱上樣條件，然后將其加樣到用平衡緩沖液平衡的陽離子交換層析柱上進行洗脫，去除雜蛋白和非蛋白雜質，再利用凝膠過濾層析柱進行上樣洗脫，去除二聚體和小分子雜質，洗脫中出現唯一的洗脫峰，即為純化DSPAα1產物。
2. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是步驟(2) 所述重組表達質粒X-DSPAal是pPIC9K-DSPAal 、 pPIC9-DSPAal 、 pPICZaA/B/C-DSPAal 或pGAPZaA/B/C-DSPAal。
3. 如權利要求2所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所述重 組表達質粒X-DSPAal是pPIC9K-DSPAal或pPIC9-DSPAal 。
4. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是步驟(3) 所述畢赤酵母菌株是GS115、 X-33、 KM71或SMD1168。
5. 如權利要求4所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所述畢 赤酵母菌株是GS115。
6. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是步驟(4) 所述畢赤酵母重組菌株發酵篩選的培養基是BMGY/BMMY、 BMG/B醒或YPD。
7. 如權利要求6所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所述畢 赤酵母重組菌株發酵篩選的培養基是BMGY/BMMY。
8. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是步驟(5) 所述陽離子交換柱的層析介質選自羧基、羧甲基、磺酸基、磺甲基、磺乙基、磺丙基或 磷酸基衍生的葡聚糖、硅膠微粒、瓊脂糖、聚乙烯醇系、苯乙烯及二苯乙烯、纖維素或 者交聯的聚丙烯酰胺系列介質。
9. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是步驟(5) 所述陽離子交換層析柱選自CM s印harose FF層析柱或SP .S印hadex C-50層析柱或 SP-650-S層析柱。
10. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAcd的方法，其特征是步驟(5)所述平衡緩沖液選自pH5. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液或Na2HP04-檸檬酸緩沖液。
11. 如權利要求1所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是步驟 (5)所述凝膠過濾層析的方法是將經陽離子交換層析分離、濃縮后的蛋白濃度不超過50mg/ml的樣品上樣到凝膠過濾層析柱，以pH6. 0-7.5,內含0. 1-0. 2M NaCl的 Tris-HC1緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Na2HP0廠檸檬酸緩沖液為洗脫液進行洗脫，以波長為 280mn檢測收集液，洗脫液曲線只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脫液，即為純化DSPAal 的提取液。
12. 如權利要求11所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所述 凝膠過濾層析柱的層析介質選自交聯瓊脂糖、交聯聚乙烯醇、葡聚糖凝膠、烯丙基葡聚 糖與N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺聚合凝膠或葡聚糖與高交聯瓊脂糖的復合凝膠。
13. 如權利要求12所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所述 凝膠過濾層析柱的層析介質能分離分子量在3， 000 300， OOODa的蛋白。
14. 如權利要求11所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所 述凝膠過濾層析柱選自S印hadex G-75或Superdex G-75或S印hacr.yl-100層析柱。
15. 如權利要求l所述利用畢赤酵母表達系統生產DSPAal的方法，其特征是所述 純化DSPAal的提取液能以常規方法真空冷凍干燥制得固體的DSPAal粉末。
全文摘要
本發明公開了一種利用畢赤酵母表達系統生產DSPAα1的方法，步驟包括(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)雙酶切合成的或優化的DSPAα1基因序列，構建重組表達質粒X-DSPAα1；(3)轉化畢赤酵母菌株細胞及平板篩選陽性轉化子；(4)畢赤酵母重組菌株發酵篩選；(5)由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAα1。本發明的方法成本低、周期短、技術上容易實現，搖瓶發酵表達量達到75mg/L，初步達到工業化生產水平，并且分離純化后的DSPAα1最終純度大于97％以上，可以直接用于制劑的研究和制備。
文檔編號C12N15/58GK101487015SQ20081001377
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月15日 優先權日2008年1月15日
發明者孫麗霞, 李劍鳳, 武國棟, 王慶民, 王晶翼, 巖 閆 申請人:齊魯制藥有限公司