專利名稱：：一種鏈霉菌及其在還原芳香酮中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物催化領域，特別是涉及一種鏈霉菌及其在還原大環剛性芳香酮，如取代苑酮中的應用。
背景技術：
：芳香醇或光學活性芳香醇是許多藥物中間體、催化劑、分析試劑食品添加劑和先進光導材料的重要結構單元。目前，在化學上主要是通過芳香酮的還原獲得。但在化學上其合成方法存在歩驟繁瑣、產率低、成本高、環境污染嚴重等問題。原因在于芳香酮的剛性結構產生高的空間位阻，阻止了催化劑的接近。尤其對于一些剛性大環芳香酮的還原或立體選擇性還原如取代芴酮在有機合成上仍是一個挑戰性的課題。例如治療抗瘧藥一本芴醇的合成過程中，雖然合成路線經過改進(鐘景星等，中國專利1999,1029680)，但從2，7-二氯芴_4-氯乙酰芴(IV)到醇的還原過程中需要經過兩步，其中易爆催化劑KB仏加氫還原，反應條件劇烈難以控制，而且三廢嚴重和產率低。再比如，重要有機合成中間體一芴醇的合成過程中，需通過堿性煮沸的條件下來水解溴芴得到芴醇，反應.條件苛刻、產物分離困難(陳忠秀，化學試劑，2003,25(3),177178)。再比如光學活性芳香醇的合成就更加困難。雖然可通過不對稱合成或還原后手性拆分等方法獲得手性芳香醇，但這兩種方法步驟繁瑣，拆分設備昂貴，實現大規模的工業化生產困難。例如液晶材料制備過程中，除采用易爆催化劑NaBft還原中間產物芳香酮后，還需用半制備高效液相色譜拆分的方法，得到含有光學活性芳香醇結構的中間體化合物，仍然面臨產率和立體選擇性低等問題(RobertP.Lemieux等，J.AM.CHEM.SOC.2004(126)，1161-1167)。鑒于芳香醇類化合物的重要性及化學合成方法所面臨的困難，采用生物催化技術制備芳香醇類化合物應是解決上述問題的一個重要途徑。生物催化劑即生物酶或生物活細胞，具有高度的化學、區域和立體選擇性，并能在溫和的條件下進行，.如室溫、中性或接近中性pH，避免或減少產物的分解、異構化、消旋和重排反應，以及產率高、能耗低、環境友好等多種優勢(JohnM.Woodley，TrendsinBiotechnology,2008(26)，321-327;許建和等，生物加工過程，2008(6)，1-9)。
發明內容本發明的目的是針對芳香酮尤其是剛性大環芳香酮難還原的特點及化學方法條件苛刻、難以控制、產率和立體選擇性低、存在環境污染等問題，通過科學方法篩選、馴化高效還原芳香酮菌株，以解決化學合成及工業上制備芳香醇及光學活性芳香醇的難題，同時解決環境污染等問題。本發明的技術方案是本發明所述的鏈霉菌具體的篩選馴化歩驟如下從卜.海郊區土壤中取少量土樣，加入到液體大篩選培養基中進行搖床培養，溫度28'C，轉速170rpm，液體大篩選培養基配方是可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，黃豆粉25g，酵母粉4g，牛肉膏lg，NaCl2g，K2HP040.05g，水1L，pH7.0-7.2;當培養基變得渾濁，進行轉接分瓶稀釋培養，在進行涂布固體篩選平板，將固體平板放入光照培養箱中培養，3CTC、培養4-5天，挑單菌落，固體篩選平板配方為可溶性淀粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨lg，酵母粉lg，牛肉膏lg，瓊脂15g，水1L，pH7.0-7,2;然后將挑選的各個單菌體進行液體培養基擴大培養，離心(5000rpm，10min)收集菌體細胞；分別加入芳香酮一取代芴酮，篩選得到一株具有芳香酮還原活性的菌株，再將此菌株進行馴化，加入不同濃度(0.05rao1，0.1mo丄，0.2mol，0.4mol,0.8mol)的取代芴酮進行傳代培養，使其能夠耐受高濃度的取代芴酮底物，最后得到篩選馴化的菌株。經篩選馴化的菌株具有如下的微生物學特征在放線菌大篩選培養基上菌落繭白或灰白，表面平坦，菌絲發達，多分枝，無隔，呈桿狀。能在大多數培養基上生長良好，氣生菌絲和基內菌絲均以白色或白灰為主。明膠液化，牛奶凝固及淀粉水解、酪氨酸水解呈陽性，纖維素上不生長，不產生硫化氫，能利用大部分的受試碳源，全細胞氨基酸分析表明含有天冬氨酸，全細胞糖分析表明含有半乳糖。根據文獻"伯杰細菌鑒定手冊"(第八版)及基于16SrpNA(GeneBank登錄號為EU216596)的系統進化分析和形態學特征，可初步定為鏈霉菌的一個新種，因此將其命名為Str印tomycessp.DUT003。己于2008年5月23日已在國家知識產權局專利局指定的保藏學.位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位簡稱CGMCC，保藏編號為2518，分類命名為Str印tomycessp.DUT003，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。本發明所述的鏈霉菌在還原芳香酮一取代芴酮中的應用具體操作為將濕重為10-100g/L的鏈霉菌懸浮在pH7.0-8.0的20mMTris-HCl或20mMHEPES緩沖液中，加入濃度為0.1-lmmol/L的芳香酮化合物一取代芴酮(氟芴酮、氯芴酮、溴莉酮、碘芴酮或甲基芴酮)，然后置于3(TC、轉速170rpm的搖床巾，反應2-12h，獲得相應的芳香醇或光學活性芳香醇，反應轉化率為89-98%，立體選擇性為83-100%;或者是將濕重為10-100g/L的鏈霉菌懸浮在pH7.0-8.0、含體積比5%助溶劑的20mMTris-HCl或20mMHEPES緩沖液中，加入濃度為0.l-10mmol/L的芳香酮化合物.一取代莉酮(氟芴酮、氯芴酮、溴芴酮、碘芴酮或甲基芴酮)，然后置于3(TC、轉速170rpm的搖床中，反應2-12h，獲得相應的芳香醇或光學活性芳香醇，反應轉化率為89-98%，立體選擇性為83-i00%，選用的助溶劑為DMSO，甲醇，乙醇.；乙腈'DMF，SDS，TritonX-100或Tween-20。應用鏈霉菌還原取代芴酮生成相應的芳香醇或光學活性芳香醇的反應通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本發明的有益效果是本發明提供的鏈霉菌易于培養，能夠高效還原芳香酮，尤其是大環剛性芳香酮如取代芴酮，產物為芳香醇及光學活性芳香醇，解決了化學合成和工業上合成芳香醇和光學活性芳香醇的難題，而且且反應條件溫和，操作步驟簡單，具有很高的立體選擇性，無其它副產物產生，環境污染小，具有很好的工業應用開發前景。附圖1為本發明所述的鏈霉菌的顯微鏡及電鏡照片。具體實施例方式篩選、馴化鏈霉菌的步驟如下從上海郊區土壤中取樣，作為菌源進行篩選、馴化培養。將少量土樣，加入到液體大篩選培養基中進行搖床培養，溫度28'C，轉速170rpm;液體大篩選培養基配方是可溶性淀粉丄0g，葡萄糖20g，黃豆粉25g，酵母粉4g，牛肉膏lg，NaCl2g，K2HP(X0.05g，水1L，pH7.0-7.2。當培養基變得渾濁，進行轉接分瓶稀釋培養，在進行涂布固體篩選平板，將固體平板放入光照培養箱中培養，30'C、培養4-5天，挑單菌落。固體篩選平板配方為可溶性淀粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨lg，酵母粉lg，牛肉膏lg，瓊脂15g，水1L，pH7.0-7.2。再將挑選的各個單菌體進行液體培養基擴大培養，離心(5000rpm，10min)收集菌體細胞，分別加入芳香酮一取代芴酮，篩選得到一株具有芳香酮還原活性的菌株，再將此菌株進行馴化，加入不同濃度的取代荷酮(0.05rao1，0.1mol，0.2mol,0.4mol，0.8mol)進行傳代培養，是其能夠耐受高濃度的取代芴酮底物，最后得到篩選馴化的菌株。并將該菌株于2008年5月23R保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱CGMCC，保藏編號為2518。鏈霉菌菌株最適生長溫度為20-37°C，最適生長pH為6-8。在大篩選固體培養基上菌落繭白或灰白，表面平坦，菌絲發達，多分枝，無隔，呈桿狀。能在大多數培養基上生長良好，氣生菌絲和基內菌絲均以白色或白灰為主。實施例1實施例2鏈霉菌的16SrDNA的擴增通過擴增該菌株的16SrDNA，得到了長度為1424bp的16SrDNA序列。PCR引物采用16SrDNA擴增通用引物，27f(5，-GAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3，)和1492r(5，-TACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3，)。用PCR儀進行擴增反應。反應體系為TaKaRaPCR10XBuffer,5ul;MgCl2(25mM),4u1;dNTPMixture(各2.5mM)，4ul;引物8f(20um)，0.25ul;引物1492r(20nm)，0.25ul;模板DNA，lul;TaKaRaTaq(5U/u1)，0.25u1;超純水，Upto50wl。PCR反應條件為94°C5分鐘，之后30個循環包括94"C1分鐘，55-Cl分鐘，72。C2分鐘，最后在72r下延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測。通過NCBI中Blast程序進行序列比對，表明該菌株與Str印tomycesrecifensis同源性達到99%。鏈霉菌的培養與收集步驟如下固體培養基配方為可溶性淀粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨lg，酵母粉lg，牛肉膏lg，瓊脂15g，水1L，pH7.0-7.2。液體培養基配方為可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，黃豆粉25g，酵母粉4g，牛肉膏lg，NaCl2g，K2HP040.05g，水1L，pH7.0-7.2。基于液體培養基的體積，挑取固體培養基中菌落接種于液體培養基中，接種量為2%，培養溫度為3(TC，搖床轉速為200rpm，培養時間為4天。離心(5000rpm，10min)收集菌體，-2(TC保存，備用。鏈霉菌的生理生化特性見表1。鏈霉菌的培養特性見表2。表1鏈霉菌Str印tomycessp.DUT003的生理生化特性明膠液化+葡萄糖+牛奶凝固與胨化+乳糖+淀粉水解+蔗糖+纖維素水解鼠李糖+硫化氫產生—麥芽糖+酪氨酸水解+甘露糖+表2鏈霉菌Str印tomycessp.DUT003的培養特性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>蔗糖蔡氏瓊脂——————實施例3鏈霉菌在生物催化還原芳香酮中的應用歩驟如下(1)將鏈霉菌置于pH為7.0-8.0的Tris-HCl緩沖液中，使其細胞濃度為50g(濕重)/L，加入芳香酮2-取代(氟、氯、溴、碘、甲基)芴酮，濃度為0.5mmo1/1，置于轉速為200rpm、溫度為3(TC的搖床中反應12h;U.(2)用HPLC監測反應的進程；(3)待反應完成后，加入等體積的乙酸乙酯萃取出有機化合物，過無水硫酸鎂柱除去水份及部分雜質，4(TC減壓濃縮，分離得到固體有機化合物一芳香醇取代芴醇。(4)硅膠柱層析分離得到純的芳香醇化合物一取代芴醇，進行核磁和質譜鑒定，并測定旋光值和對應體過量值。實施例4鏈霉菌還原不同的芳香酮化合物-取代莉酮，步驟如下(1)將鏈霉菌置于pH為7.0-8.0的Tris-HC1緩沖液中，使其細胞濃度為50g(濕重)/L，加入芳香酮2-取代(氟、氯、溴、碘、甲基)芴酮，濃度為0.5mmo1/1，加入助溶劑〈5%(v/v)(有機溶劑DMSO或甲醇或乙醇或乙腈或DMF;表面活性劑SDS或TritonX-100或Tween-20)，置于轉速為200卬ra、溫度為30。C的搖床中反應，反應時間為12h。(2)用HPLC監測反應的進程色譜儀Agilent1100，色譜柱CromasilC18(250咖X4.6隱，5ym);流動相70。/。甲醇50min;流速0.8ml/min;檢測波長254咖；柱溫室溫；進樣體積10^1。(3)待反應完成后，加入等體積的乙酸乙酯萃取出有機化合物，過無水硫酸鎂柱除去水份及部分雜質，4(TC減壓濃縮，分離得到固體有機化合物一芳香醇取代芴醇。(數據見附表3)(4)硅膠柱層析分離得到純的芳香醇化合物--取代芴醇，進行核磁和質譜鑒定，并測定旋光值和對應體過量值，數據見表3。'表3鏈霉菌Str印tomycessp.DUT003還原不同取代芴酮情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、一種鏈霉菌，該鏈霉菌于2008年5月23日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC2518，分類命名為Streptomycessp.DUT003。2、根據權利要求1所述的一種鏈霉菌，其特征在于，該鏈霉菌在放線菌大篩選培養基上28X:下，培養4-5天，菌落繭白或灰白，表面平坦，菌絲發達，多分枝，無隔，呈桿狀，氣生菌絲和基內菌絲以白色或白灰為主。3、應用一種鏈霉菌還原芳香酮的方法，其特征在于，將濕重為10-100g/L的鏈霉菌懸浮在pH7.0-8.0的緩沖液中，加入濃度為0.1-lmmol/L的芳香酮化合物一取代芴酮，然后置于30°C、轉速170rpm的搖床中，反應2-12h。4、根據權利要求3所述的應用一種鏈霉菌還原芳香酮的方法，其特征在于，將濕重為10-100g/L的鏈霉菌懸浮在pH7.0-8.0、含體積比5%助溶劑的的緩沖液中，加入濃度為0.1-10mmol/L的芳香酮化合物一取代莉酮，然后置于30°C、轉速170rpm的搖床中，反應2-12h。。5、根據權利要求3所述的應用一種鏈霉菌還原芳香酮的方法，其特征在于，所述的緩沖液為20mMTris-HCl或20mMHEPES。6、根據權利要求3所述的應用一種鏈霉菌還原芳香酮的方法，其特征在于，所述的芳香酮為氟芴酮、氯芴酮、溴芴酮、碘芴酮或甲基芴酮。7、根據扭利要求4所述的應用一種鏈霉菌還原芳香酮的方法，其特征在于，所述的助溶劑為DMSO，甲醇，乙醇，乙腈，DMF，SDS，TritonX-100或Tween-20。全文摘要本發明涉及生物催化領域，特別是涉及一種鏈霉菌(Streptomycessp.DUT003，保藏號為CGMCC2518)及其在還原大環剛性芳香酮，如取代芴酮中的應用。應用本發明的鏈霉菌能夠高效還原芳香酮，尤其是大環剛性芳香酮如取代芴酮，產物為芳香醇及光學活性芳香醇，解決了化學合成和工業上合成芳香醇和光學活性芳香醇的難題，轉化率可達89-98％，且產物具有高的立體選擇性，ee值為83-100％。該鏈霉菌易于培養，還原反應條件溫和，操作步驟簡單，環境污染小，具有很好的工業應用開發前景。文檔編號C12P7/02GK101418269SQ20081001351公開日2009年4月29日申請日期2008年9月27日優先權日2008年9月27日發明者君楊,青楊,波謝,錢旭紅,陶黎明申請人:大連理工大學