專利名稱：：一種降膽固醇的發酵酸乳及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及發酵牛奶配制品，是用乳酸菌發酵并配以天然食品提取物為乳酸菌生長促進劑制成。還涉及降膽固醇功能酸乳的
技術領域：
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背景技術：
：隨著社會的發展、科技的進步，人們生活水平不斷提高，日常膳食營養也日益增加，但隨之而來的負面影響是動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的發生率不斷攀升。根據世界衛生組織公布的1996年度衛生統計年鑒，全球因心血管疾病死亡1530萬人，占總死亡人數的29%，心血管疾病因此而高居世界五大死因之首，而它們共同的病理基礎都是動脈硬化。動脈粥樣硬化由許多因素促成，其中最重要的危險因素是高脂血癥即血膽固醇和血甘油三脂的升高。因而，保持血液中膽固醇濃度在正常范圍內，對于預防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病是至關重要的[1]。美國、我國國內的營養和醫學專家推薦食物膽固醇的攝入量標準為250-300mg/d/人。但隨著人民生活水平的不斷提高和膳食營養的增加，膽固醇的攝入量很容易超標。據上海市心血管病研究所在1997-1999年間對3467名上海居民的調査，由于每日的營養攝取量比20世紀70年代有明顯增加，脂肪由24.1%增至31.8%，膽固醇由282mg上升至388mg，而碳水化合物則由65.7%降至53.7°/。，上海人的血脂則明顯增高。因此研究不影響食品風味，經濟實用的降低食品和人體血清膽固醇的方法，已成為當前改善食品質量、提高人們生活水平重要的研究課題[2]。國外對降膽固醇乳酸菌的研究起步較早。1977年，Gilliland對腸道乳桿菌降膽固醇作用進行了研究，提出乳桿菌在生長過程中通過降解膽鹽促進膽固醇的分解代謝，從而降低膽固醇含量的觀點[3]。隨后Rasic等也證實了嗜酸乳桿菌和兩雙歧桿菌對膽固醇的脫除作用[4]。迄今為止人體及動物實驗也證明了乳酸菌的降膽固醇作用[5]。我國國內關于乳酸菌降膽固醇方面的研究起步較晚，且多數都停留在體外研究的水平，還未見有成功的降膽固醇乳酸菌類產品的報道和問世。參考文獻李瑞杰譯.降低膽固醇水平預防冠狀動脈性心臟病.美國醫學會雜志中文版[M].2000，19(6):297-303.[2]張佳程，駱承庠.乳酸菌對食品中膽固醇脫除作用的研究[J]，食品科學.1998(3):20-23[3]MaireB，ColinH，andCormacG.M.BileSaltHydrolaseActivityinProbiotics[J].AppliedandEvironmentalMicrobiology,2006，72(3):1729-1738HeF，0uwehandAC，IsolauriE，etal.Comparisonofmucosaladhesionandspeciesidentificationofbifidobacteriaisolatedfromhealthyandallergicinfants[J].FEMSImmunolMedMicrobiol,2001，30(1):43-47柳翰凌.內蒙古牧區傳統乳制品中乳桿菌降膽固醇特性的研究[D].內蒙古農業大學，2006
發明內容本發明的目的在于提供一種具有降膽固醇功效的酸乳生產方法。其中主要包括高效降膽固醇乳酸菌的分離篩選、降膽固醇酸乳發酵的配方、降膽固醇酸乳的發酵工藝條件。1、降膽固醇乳酸菌GL-03的篩選及膽固醇降解誘導本發明所用的菌種為從天然發酵干酪中篩選出的高效降膽固醇的乳酸菌GL-03，經16SrDNA測序鑒定為干酪乳桿菌干酪亞種(L3"o&cj7J"scaseis"fep.mw力。降膽固醇乳酸菌GL-03經底物誘導試驗，其膽固醇降解率從誘導前的50%增加到56%，同時其具有較好的耐胃酸、耐膽鹽及對小腸上皮細胞粘附性、抑制致病菌等特性，是一種適宜于定植人體腸道的益生菌。分離篩選方法稱取適量天然發酵干酪，經無菌水稀釋后，無菌操作吸取2ml加入滅菌的脫脂乳中，37°C靜置富集培養48h。無菌操作取lml上述富集培養液加入含9ml無菌的改良KENJI選擇性培養基(含0.04%溴百里香草酚蘭)中，37'C振蕩培養1-2天，然后取培養液100化加到同樣的培養基里培養，共需三次轉管培養。根據培養基的比混濁度和指示劑顏色的變化，取第三次培養后的菌液200A加入到pH2的MRS液體培養基培養6h，取其IOO叱培養液轉接到含0.30%豬膽鹽MRS液體培養基中培養24h，然后取200A培養液的涂布在改良MRS平板上，37C恒溫培養4872h。挑取產酸的典型菌落，反復的劃線分離、純化，革蘭氏染色、鏡檢，至純菌落為止。然后，經16SrDNA測序進行菌種鑒定。定向誘導將選育的乳酸菌GL-03活化后，定量加到含0.25%膽固醇的KENJI發酵培養基中進行培養，每培養一次膽固醇的濃度都要增加0.15%，五次馴化培養后，使培養基中膽固醇的含量達到lmg/mL。選擇生長良好的乳酸菌GL-03，在含膽固醇0.lmg/mL的MRS液體培養基中，測定其在誘導馴化前后的膽固醇降解率的變化，從中篩選出降膽固醇能力提高較大的菌株。2、降膽固醇酸乳的發酵條件及工藝本發明為一種降膽固醇發酵酸乳，在發酵乳中不僅加入高效降膽固醇的乳酸菌GL-03，同時添加了山楂提取物。試驗表明山楂提取物為乳酸菌生長促進因子，適量添加可提高酸乳中乳酸菌活菌數量約100倍，山楂提取物同時可與乳酸菌協同作用降低人體膽固醇。(1)菌種活化和發酵劑制作將冰箱保藏的乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌由MRS斜面轉接到液體MRS培養基中，37。C培養12h，活化三次；活化的菌種按2%接種到滅菌的含10%(W/V)的脫脂奶粉液體中，37。C培養至凝乳，轉接三次制成發酵劑。(2)山楂提取物的制備取山楂50克，先將材料切成碎末或粉末，加38倍的水，浸泡24h，煮沸后用紋火持續3040min;濾出煎液，力卩35倍的水，進行二煎(2030min)濾出煎液，加24倍的水，進行三煎(2030min)，合并濾液濃縮至lOOmL，取上清液，U5。C，滅菌15min,4。C冰箱保存備用。(3)發酵乳原料配方功能性降膽固醇酸奶的原料質量百分配比為鮮奶或還原奶80.085.0奶粉0.02.0蔗糖5.07.0山楂浸提物4.06.0三種混合菌種2.05.0穩定劑CMC-Na0.1其中三種混合菌種為乳酸菌gl-03(L3cz^fecj7勿scaseis〃/^acase力、保力口利亞桿菌(L3C^3"X〃51W卵".CiAS)禾口嗜熱鏈球菌(5Y，t歸c^e27Z7op力77ws)3種菌混合，其比例為1:0.51.0:0.51.0，發酵溫度40-45。C。(4)工藝流程原料乳一凈乳一標準化一預熱(60°C)—均質(1517Mpa)—殺菌一冷卻一添加發酵劑一分裝一發酵一冷藏(05'C)—檢驗一發送具體操作步驟1)鮮奶(或還原奶)經奶檢、凈化、待配。2)將蔗糖、穩定劑用少量乳液(50-6(TC)溶解，加入凈化后的奶液中，攪拌均勻，升溫至5862。C左右進行均質(壓力為15-17Mpa)。3)將均質后的奶液加熱至9(TC，5min或超高溫瞬時滅菌(135°C，3-5s)，然后降溫至43"，接種發酵。4)接種后料液快速分裝到銷售用容器，并送至40-45"C恒溫室發酵4-5h，至pH4.6-4.8。迅速冷卻到1(TC以下，并移至0-4。C冷庫冷藏后熟。3、降膽固醇酸乳質量標準(1)感官指標色澤色澤均勻一致，呈乳白色或稍帶微黃色。滋味氣味具有純乳酸發酵劑制成的酸牛乳特有的滋味和氣味，無酒精發酵味、霉味和其它不良氣味。組織狀態凝塊均勻細膩、無氣泡、允許少量乳清析出。(2)理化指標乳脂肪>3.00wt%，全乳固體^10wt^，酸度70110°T，砂糖>5.0wt%，滎《0.010/,m。每100g降膽固醇酸乳含有熱量60-70Kcal，非脂乳固體》8.lg，蛋白質》3.0g，砂糖^5.0g，乳酸菌活菌數>lX106cfu/g。(3)微生物指標大腸菌群《90個/毫升，致病菌不得檢出。4、降膽固醇發酵乳的動物實驗對以乳酸菌GL-03為主要發酵菌劑制成的降膽固醇酸乳，進行了體內降低血清膽固醇的動物實驗。將30只雄性小白鼠(購自大連醫科大學實驗動物中心)，在溫度2025°C，相對濕度50±5%的環境中自由飲水進食，普通詞料飼喂3d后，逐個稱重，按各組間平均體重無顯著差異重新分為3組，每組10只。A組基礎日糧組(正常組)，飼喂基礎飼料；B組高脂模型組，飼喂高脂飼料；C灌胃組高脂飼料+降膽固醇酸乳，每2天灌胃1次，在早9時左右進行，A、B組灌服0.9呢生理鹽水，C組灌服降膽固醇酸乳，灌胃量lmL/只。飼喂小鼠30天后，禁食12h，眼眶采血，4。C冷藏，測定血脂的TC、TG、HDL-C、LDL-C。采血后，小鼠斷頸處死，解剖后分別取肝、腎、脾稱重。飼喂30天后，各組小鼠血脂水平如表l所示。B組血清TC和TG含量己顯著高于A組(P<0.05)，說明飼喂小鼠高脂飼料30天高脂模型已成功建成。C組的血清TC和TG含量比B組顯著降低(P<0.05)，B組和C組的小鼠的LDL-C水平明顯下降，各種飼料配方對小鼠HDL-C的含量影響不大；動脈硬化指數(AI)是反映心血管疾病易患程度的一個指標。高脂伺料飼喂的B組小鼠的AI值為0.365，在各組中最高，而灌胃降膽固醇酸乳的小鼠AI值有所下降，AI值為0.211，并與B組相比差異顯著(P<0.05);飼喂高脂飼料后B組的小鼠的HDL-C/TC值顯著降低，為73.3%，灌胃酸乳的C組小鼠的HDL-C/TC值顯著升高，為86.2%，而正常對照組A組小鼠的HDL-C/TC比值始終保持最高，說明該降膽固醇酸乳具有降低血清膽固醇的功能。表l降膽固醇酸乳對小鼠血脂的影響(mmol/L)組別TCTGHDL-CLDL-C動脈硬化指數AIHDL-C/TC(%)A1.93±0.15B2.88±0.20C2.24±0.251.33±0.161.78±0,181.OO土O.151.88±0.202,ll士O.231,85±0.191.50±0.170.21±0.210.22±0.160.027±0.050.365±0.080.211±0.1097.4±0.0673.3±0.0482.6±0.07注AI=TC-HDL-C/HDL-C在飼喂小鼠30天中，各組小鼠毛色光潔，食欲正常，未發生自然死亡。體重及肝、腎、脾與體重百分比如表2和3所示。飼喂高脂詞料的B組小鼠的體重明顯增加(P<0.05)，C組小鼠體重與A組沒有顯著性差異(P>0.05)。飼喂高脂飼料的B組小鼠的肝重/體重明顯高于基礎日糧組的小鼠，而灌胃組(C組)的低于高脂模型組(B組)，說明由于降膽固醇酸乳的作用，使脂肪在小鼠肝臟內的存積量減少。各組間腎重/體重和脾重/體重未見顯著差異，表明在對小鼠灌胃降膽固醇酸乳期間未見明顯毒副作用。表2降膽固醇酸乳對小鼠體重的影響(G)<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3降膽固醇酸乳對小鼠臟體比的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>綜上所述，本發明使用的高效降膽固醇乳酸菌一干酪乳桿菌干酪亞種，分離自天然發酵乳制品，體外培養試驗表明其有很強的耐酸、耐膽鹽能力，粘附性好，對常見的腸道致病菌有明顯的抑制作用，不攜帶耐藥性因子，是一種適宜于人體腸道定植的乳酸菌，同時體外膽固醇降解率可達56%，體內降膽圓醇的動物實驗也表明該酸乳可明顯降低小鼠血清膽固醇。本發明首次采用高效降膽固醇的干酪乳桿菌干酪亞種為酸奶發酵菌劑，以山楂提取物為乳酸菌生長促進劑，生產高效降膽固醇酸乳。體外實驗、體內動物實驗均表明，該降膽固醇酸乳具有降低血清膽固醇的功能，效果明顯優于現有的文獻報道。原料乳中添加山楂提取物后，發酵酸乳乳酸菌活菌數可提高102倍，可明顯增強酸乳乳酸菌的益生作用和降膽固醇的功能性。具體實施例方式實施例1全脂酸乳的制備(1)乳酸菌GL-03用如下方法制得無菌操作天然發酵干酪經無菌水稀釋后，吸取2ml加入滅菌的脫脂乳中，37°C靜置富集培養48h;取1ml富集培養液加入含0.04%溴百里香草酚蘭9ml無菌的改良KENJI選擇性培養基中，37'C振蕩培養1-2天；取培養液IOO叱加到同樣的培養基里培養，共需三次轉管培養；根據培養基的比混濁度和指示劑顏色的變化，取第三次培養后的菌液200A加入到pH2的MRS液體培養基培養6h，取其100叱培養液轉接到含0.30wa豬膽鹽MRS液體培養基中培養24h，然后取200叱培養液的涂布在改良MRS平板上，37。C恒溫培養4872h;挑取產酸的典型菌落，反復的劃線分離、純化，革蘭氏染色、鏡檢，至純菌落為止；然后，經16SrDNA測序進行菌種鑒定；定向誘導將選育的乳酸菌GL-03活化后，定量加到含0.25%膽固醇的KENJI發酵培養基中進行培養，每培養一次膽固醇的濃度都要增加0.15wt%，五次馴化培養后，使培養基中膽固醇的含量達到lmg/mL;選擇生長良好的乳酸菌GL-03，在含膽固醇0.lmg/mL的MRS液體培養基中，測定其在誘導馴化前后的膽固醇降解率的變化，從中篩選出降膽固醇能力提高較大的菌株而成。(2)菌種活化和發酵劑制作將干酪乳桿菌GL-03、保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌分別由MRS斜面轉接到液體MRS培養基中，37。C培養12h，活化三次；活化后的三菌種按1:0.5:0.5接種到滅菌的含10%(W/V)的脫脂奶粉液體中，37。C培養至凝乳，轉接三次制成發酵劑。(3)山楂提取物的制備取山楂50克，先將材料切成碎末或粉末，加3倍的水，浸泡4h，煮沸后用紋火持續40min;濾出煎液，濾渣加5倍的水，進行二煎30min，濾出煎液，濾渣加3倍的水，進行三煎20min，合并濾液濃縮至lOOmL，取上清液，115°C,滅菌15min，4"C冰箱保存備用。(4)原料配方與發酵酸乳的制備原料質量百分配比為鮮奶82.0%，奶粉1.9%，蔗糖濃度5.0%，山楂浸提物6.0%，乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌3種菌混合比例為1:0.5:0.5，接種量為5.0%，穩定劑CMC-NaO.1°/。。操作步驟將蔗糖、穩定劑用少量乳液(50-60°C)溶解，加入凈化后的奶液中，同時按比例加入山楂浸提物攪拌均勻，升溫至6CTC進行均質(壓力為15-17Mpa)。均質后的奶液加熱至90。C，5min或超高溫瞬時滅菌(135°C，3-5s)，然后降溫至43°C，將乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種接種。接種后料液快速分裝到容器中，并送至43'C恒溫室發酵4h，至pH4.6-4.8。迅速冷卻到10"C以下，并移至0-4'C冷庫冷藏后熟。(4)產品規格與理化指標乳脂肪>3.00wt%，全乳固體^10wt0/0，酸度70110°T，砂糖>5.Owt%，汞《0.010/oppm。每lOOg降膽固醇酸乳含有熱量65Kcal，蛋白質4.Og，脂質3.lg，砂糖5.lg，乳酸菌活菌數>lX106cfu/g。實施例2部分脫脂酸乳的制備(1)乳酸菌GL-03用實施例1方法制得。(2)菌種活化和發酵劑制作將干酪乳桿菌GL-03、保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌分別由MRS斜面轉接到液體MRS培養基中，37。C培養12h，活化三次；活化后的三菌種按1:0.5:0.5接種到滅菌的含10%(W/V)的脫脂奶粉液體中，37。C培養至凝乳，轉接三次制成發酵劑。(3)山楂提取物的制備取山楂50克，先將材料切成碎末或粉末，加38倍的水，浸泡24h，煮沸后用紋火持續3040min;濾出煎液，加35倍的水，進行二煎(2030min)濾出煎液，加24倍的水，進行三煎(2030min)，合并濾液濃縮至100mL，取上清液，115°C，滅菌15min，4。C冰箱保存備用。(4)原料配方與發酵酸乳的制備原料質量百分配比為部分脫脂鮮奶85.0%，蔗糖濃度6.0%，山楂浸提物4.9%，乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌3種菌混合比例為1:1:1，接種量為4.0%,穩定劑CMC-NaO.1%，發酵溫度43。C。操作步驟將蔗糖、穩定劑用少量乳液(50-60°C)溶解，加入凈化后的奶液中，同時按比例加入山楂浸提物攪拌均勻，升溫至60。C左右進行均質(壓力為15-17Mpa)。均質后的奶液加熱至9(TC，5min或超高溫瞬時滅菌(135°C，3-5s)，然后降溫至43'C，將乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌以1:1:1比例混合，接種量為5wt9L接種后料液快速分裝到容器中，并送至43"C恒溫室發酵4-5h，至pH4.6-4.8。迅速冷卻到l(TC以下，并移至0-4r冷庫冷藏后熟。(5)產品規格與理化指標乳脂肪》0.5《3.Owt%，全乳固體》10wt。/。，酸度70110°T，砂糖>5.Owt%，汞《0.01%ppm。每100g降膽固醇酸乳含有蛋白質3.0g，脂質0.53.0g，砂糖5.lg，乳酸菌活菌數>lX106cfu/g。實施例3脫脂酸乳的制備(1)乳酸菌GL-03用實施例1方法制得。(2)菌種活化和發酵劑制作將干酪乳桿菌GL-03、保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌分別由MRS斜面轉接到液體MRS培養基中，37。C培養12h，活化三次；活化后的三菌種按1:0.5:0.5接種到滅菌的含10%(W/V)的脫脂奶粉液體中，37。C培養至凝乳，轉接三次制成發酵劑。(3)山楂提取物的制備取山楂50克，先將材料切成碎末或粉末，加38倍的水，浸泡24h，煮沸后用紋火持續3040min;濾出煎液，加35倍的水，進行二煎(2030min)濾出煎液，加24倍的水，進行三煎(2030min)，合并濾液濃縮至100mL，取上清液，115°C，滅菌15min，4。C冰箱保存備用。(4)原料配方與發酵酸乳的制備原料質量百分配比為脫脂鮮奶85%，蔗糖濃度6.9%,山楂浸提物6.0%，乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌3種菌混合比例為1:1:1，接種量為2.0%，穩定劑CMC-NaO.10/0。操作步驟將蔗糖、穩定劑用少量乳液(50-6CTC)溶解，加入凈化后的奶液中，同時按比例加入山楂浸提物攪拌均勻，升溫至60°C左右進行均質(壓力為15-17Mpa)。均質后的奶液加熱至90。C，5min或超高溫瞬時滅菌(135°C，3-5s)，然后降溫至43。C，將乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌以1:1:1比例混合，接43。C種量。接種后料液快速分裝到容器中，并送至43X:恒溫室發酵4-5h，至pH4.6-4.8。迅速冷卻到1(TC以下，并移至0-4。C冷庫冷藏后熟。(5)理化指標乳脂肪《0.5wt%，全乳固體^10wt。/。，酸度70110°T，砂糖》5.Owt%，汞《0.01%ppm。每100g降膽固醇酸乳含有蛋白質3.0g，脂質0.5g，砂糖5.lg,乳酸菌活菌數》lX106cfu/g。實施例4脫脂酸乳的制備(l滴種活化和發酵劑制作、(2)山楂提取物的制備同以上實施例，(3)發酵乳原料質量百分配比為脫脂還原奶80.0%，脫脂奶粉2.0%，蔗糖6.9%，山楂浸提物6.0%，乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌3種菌混合比例為1:1:1，接種量為5.0%，穩定劑CMC-NaO.1%，發酵溫度43'C。發酵操作步驟同實施例3。(4)理化指標同實施例權利要求1.一種降膽固醇的發酵酸乳，其特征在于鮮奶或還原奶用乳酸菌GL一03(Lactobacilluscaseisubsp.casei)、保加利亞桿菌(Lactobacillusbulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)3種混合菌種和山楂提取物經發酵制得；呈乳白色或微黃色，凝塊均勻細膩、無氣泡，允許少量乳清析出；其質量指標為乳脂肪≥3.00wt％，全乳固體≥10wt％，酸度70～110°T，砂糖≥5.0wt％，汞≤0.01％ppm，每100g含有熱量60—70Kcal，非脂乳固體≥8.1g，蛋白質≥3.0g，砂糖≥5.0g，乳酸菌活菌數≥1×106cfu/g，大腸菌群≤90個/毫升，致病菌不得檢出。2.如權利要求1所述降膽固醇的發酵酸乳的制備方法，其特征在于工藝步驟為(一)原料制備(1)菌種活化和發酵劑制作將冰箱保藏的經分離篩選、定向誘導而得乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌由MRS斜面轉接到液體MRS培養基中，37。C培養12h，活化三次；活化的菌種按2%接種到滅菌的含10%(W/V)的脫脂奶粉液體中，37'C培養至凝乳，轉接三次制成發酵劑；乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌之間的比例為1.0:0.51.0:0.51.0(2)山楂提取物的制備50克粉碎山楂，加38倍的水，浸泡24h，煮沸后用紋火持續3040min;濾出煎液，濾渣繼而分別加35倍、24的水，用相同的方法進行2030min的二煎、三煎，合并濾液濃縮至lOOmL，取上清液，115。C滅菌15min，4。C冰箱保存備用；(二)發酵酸乳的制備(3)原料配方原料奶80.085.0奶粉0.02.0蔗糖5.07.0山楂浸提物4.06.0三種混合菌種2.05.0穩定劑CMC-Na0.1其中三種混合菌種為乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌3種菌混合，其比例為1:0.51.0:0.51.0;(4)工藝步驟1)原料奶經奶檢、凈化、待用；2)將蔗糖、穩定劑用少量乳液于50-6(TC溶解，加入凈化后的奶液中，攪拌均勻，升溫至5862X:，15-17Mpa進行均質；3)將均質后的奶液加熱至8892。C，5min滅菌，然后降溫至43匸，接種；4)接種后于4045。C恒溫室發酵45h,至pH4.64.8，迅速冷卻到10"C以下，并移至0-4"C冷庫冷藏后熟。3.如權利要求2所述降膽固醇的發酵酸乳的制備方法，其特征在于工藝步驟(一)原料制備的(l)中所述菌種活化和發酵劑制作的經分離篩選、定向誘導而得乳酸菌GL-03是用如下方法制得無菌操作天然發酵干酪經無菌水稀釋后，吸取2ml加入滅菌的脫脂乳中，37°C靜置富集培養48h;取lml富集培養液加入含0.04%溴百里香草酚蘭9ml無菌的改良KENJI選擇性培養基中，37'C振蕩培養1-2天；取培養液100叱加到同樣的培養基里培養，共需三次轉管培養；根據培養基的比混濁度和指示劑顏色的變化，取第三次培養后的菌液200叱加入到pH2的MRS液體培養基培養6h，取其IOO化培養液轉接到含0.30%豬膽鹽MRS液體培養基中培養24h，然后取200叱培養液的涂布在改良MRS平板上，37T:恒溫培養4872h;挑取產酸的典型菌落，反復的劃線分離、純化，革蘭氏染色、鏡檢，至純菌落為止；然后，經16SrDNA測序進行菌種鑒定；定向誘導:將選育的乳酸菌GL-03活化后，定量加到含0.25%膽固醇的KENJI發酵培養基中進行培養，每培養一次膽固醇的濃度都要增加O.15%，五次馴化培養后，使培養基中膽固醇的含量達到lmg/mL;選擇生長良好的乳酸菌GL-03，在含膽固醇0.lmg/mL的MRS液體培養基中，測定其在誘導馴化前后的膽固醇降解率的變化，從中篩選出降膽固醇能力提高較大的菌株而成。4.如權利要求2所述降膽固醇的發酵酸乳的制備方法，其特征在于工藝步驟中所述的原料奶為還原奶。5.如權利要求2所述降膽固醇的發酵酸乳的制備方法，其特征在于所述工藝步驟3)，是將均質后的奶液加熱135"C，進行超高溫3-5s滅菌，然后降溫至43°C，接種。全文摘要一種降膽固醇的發酵酸乳及其制備方法。原料奶用乳酸菌GL-03、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌3種混合菌種和山楂提取物經發酵制得；其工藝步驟為原料奶須經奶檢、凈化后備用；蔗糖、穩定劑用少量乳液溶解，加入凈化后的奶液中升溫至60℃進行均質、滅菌，降溫至43℃接種于40～45℃恒溫室發酵4～5h，至pH4.6～4.8后迅速冷卻到10℃以下，并移至0-4℃冷庫冷藏后熟。乳酸菌GL-03體外培養試驗表明其有很強的耐酸、耐膽鹽能力，粘附性好，對常見的腸道致病菌有明顯的抑制作用，不攜帶耐藥性因子，是一種適宜于人體腸道定植的乳酸菌，同時體外膽固醇降解率可達56％。動物試驗證明降膽固醇酸乳具有降低血清膽固醇的功能。文檔編號A23L1/29GK101361506SQ20081001349公開日2009年2月11日申請日期2008年9月28日優先權日2008年9月28日發明者侯紅漫,郭東啟申請人:大連工業大學