專利名稱：一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充質干細胞的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術與組織工程領域，特別涉及一種動態懸浮條件下共同 培養臍血造血干細胞與間充質干細胞的方法。
背景技術：
造血干細胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)可以廣泛應用于基因治療、 腫瘤凈化和骨髓移植等臨床方面的應用，尤其是造血干細胞移植已成為癌癥患 者放化療后造血功能重建的常規方法(Bellantuono, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2004, 36(4):607-620; Masson et al., Stem Cells, 2004， 22(6):897-907)。但細胞數量有限極大地限制了其在臨床上的應用，解決此問題 的有效方法是實施HSCs的體外大規模擴增。盡管造血干細胞移植能夠顯著地改 善癌癥患者放化療之后的生命質量，但絕大多數患者不可避免地要承受短期內 嚴重的嗜中性粒細胞減少癥和血小板減少癥的痛苦。因此有必要提出新的治療 方案來降低這些并發癥的發生。
間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)已被證明在體外具有支持造 血發生的功能(Jang et al., Annals of Hematology, 2006, 85(4):212-225; Majumdar et al.， Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research, 2000, 9(6):841-848; Laughlin et al., New England Journal of Medicine, 2001， 344(24): 1815-1822)，同時在 NOD/SCID小鼠體內實驗中，也證明了同時移植HSCs和MSCs能夠加速小鼠造 血功能的恢復與重建(Bensidhoum et al., Blood， 2004， 103(9):3313-3319)。而對于 臨床上乳腺癌患者化療后的造血干細胞移植，聯合植入自體MSCs后，同樣具有促進造血功能的恢復與重建，同時降低了伴隨造血干細胞移植并發癥的發病
率(Koc et al., Journal of Clinical Oncology, 2000, 18(2):307國316)。另外，MSCs也 可作為細胞治療的種子細胞和基因治療的載體細胞(Deans and Moseley， Experimental Hematology, 2000, 28(8):875-884)。因此，能夠在同一個培養體系內 同時培養與收獲HSCs和MSCs兩種干細胞，具有重要的臨床應用價值。
然而，HSCs和MSCs分別具有懸浮生長和貼壁生長的特性，體外共同培養 這兩種干細胞時，必須同時提供懸浮生長環境和賴以粘附生長的表面。微載體 與適宜的生物反應器相結合是解決此問題的有效方法。玻璃包被的聚苯乙烯 (Glass coated styrene copolymer, GCSC)微載體以其良好的表面貼附特性，在 貼壁細胞動態培養方面倍受關注。而旋轉壁式生物反應器(Rotating wall vessel bioreactor，RWVB)是近年來發展起來的，能夠為細胞提供一個較為均勻的懸浮 生長環境，適用于干細胞體外大規模培養與擴增。
Chen等(Chen et al., Stem Cells, 2006， 24(9):2052-2059)利用RWVB，在添加 高劑量細胞因子組合的條件下實現了骨髓來源的HSCs和MSCs的共培養，雖然 使HSCs與MSCs分別擴增了 9倍和29倍，但高劑量的細胞因子組合顯然比較 昂貴。關于臍血來源的HSCs和MSCs的體外共同培養至今仍未見報道。因此， 在不添加血清、只添加細胞因子和滋養層細胞支持的條件下，實現動態懸浮共 培養臍帶血來源的HSCs和MSCs,并分離、收獲這兩種干細胞，具有重要的臨 床價值和經濟效益。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干 細胞與間充質干細胞的方法。
本發明的技術方案包括以下步驟1. 分離人臍帶血單個核細胞。臍帶血來自健康產婦足月分娩或足月剖腹產
嬰兒，每次臍血采集量平均為50~100mL。臍血采集后，按體積比1:1與PBS混 合均勻，用密度為1.077g'mL"的Ficoll細胞分離液以2500rpm， 25min離心后獲 得單個核細胞(Mononuclear cells, MNCs)，用IMDM基礎培養基1000rpm， 5min 離心洗滌兩次，調整細胞密度備用。
2. 臍血單個核細胞與玻璃包被的聚苯乙烯微載體在六孔板內靜止孵育24 小時將干燥的玻璃包被的聚苯乙烯微載體置于硅化處理的玻璃瓶中，按每克 微載體置于50 100mL的不含Ca2，n Mg^的PBS緩沖鹽溶液中室溫下浸泡3小 時，用新鮮的不含Ca^和Mg^的PBS緩沖鹽溶液沖洗兩次，115。C下高壓滅菌 15分鐘，鋪滿六孔板每孔底面，接種入新鮮分離得到的密度為1X10、dls，mU1 的臍血單個核細胞，靜止孵育24小時；
3. 提供滋養細胞。取人脂肪組織，以質量百分比濃度分別為0.25%的胰蛋 白酶和0.1%的I型膠原酶聯合消化，吸出下層含單個核細胞的懸液，加入含體 積百分比濃度為10%胎牛血清的培養基終止消化，剩余脂肪組織重復消化2 3 次，將收集到的細胞沉淀加入含體積百分比濃度為10。/。胎牛血清的DMEM培養 基重懸細胞，移入培養瓶中，37°C、 5%C02、 20%O2、飽和濕度條件下孵育， 每2~3天換液。待細胞在培養瓶底面積達80%融合時，加入質量百分比濃度為 0.25%的胰蛋白酶消化，按1:3的比例進行常規傳代培養，獲得脂肪干細胞
(Adipose-derived stem cells ， ADSCs )。
4. 海藻酸鈣殼聚糖膠珠包埋滋養細胞。將質量百分比濃度為1.0%的海藻酸 鈉溶液與密度為6xl05cell&mL-l的脂肪干細胞懸液以2:1體積比混合后，經5# 針頭逐滴滴加至質量百分比濃度為3.0%氯化鈣溶液中，反應8分鐘，制得直徑 為1.0 1.5毫米的包埋有脂肪干細胞的海藻酸鈣膠珠，PBS緩沖鹽溶液沖洗兩次后，再與質量百分比濃度為1.0%殼聚糖交聯反應8分鐘，將交聯反應后的包埋 有脂肪干細胞的海藻酸鈣殼聚糖膠珠用PBS緩沖鹽溶液沖洗兩次后備用。
5.準備旋轉壁式生物反應器。采用專利號為ZL 2003 1 0105054.6旋轉式細 胞培養系統來共同培養臍血造血干細胞與間充質干細胞。實驗之前，將旋轉壁 式生物反應器各個部件清洗干凈后，浸泡在體積百分比濃度為75%的酒精溶液 中過夜，再用超純水沖洗干凈。將裝配好的旋轉式細胞培養系統、連接好的管 路、充氧器分別包裹并于121。C下高壓滅菌30分鐘，烘干備用。
6. 旋轉壁式生物反應器內共同培養臍血造血干細胞與間充質干細胞。將臍 血單個核細胞與GCSC微載體在六孔板內靜止孵育24小時，待臍血間充質干細 胞粘附到GCSC微載體上后，將臍血單個核細胞懸液與包埋脂肪干細胞的海藻 酸鈣殼聚糖膠珠混合，加入IMDM培養基，調整臍血單個核細胞密度至5X 10Scells'ml/1，微載體濃度為5mg.m!/1，臍血單個核細胞與脂肪干細胞細胞數比 例為5:1，加入細胞因子組合SCF 15 ng'mU1， FL 5 ng'mL—1， TPO 6 ng'mL—1， IL-3 15ng'mL"， G-CSF 1 ngTnL"， GM-CSF 5 ng'mL"，接種至旋轉壁式生物反應器 中，37°C、 5%C02、 20%O2、飽和濕度條件下共培養12天。
7. 分離海藻酸鈣殼聚糖膠珠與臍血干細胞，收獲并分離臍血造血干細胞與 間充質干細胞。采用20目不銹鋼篩網截留包埋脂肪干細胞的海藻酸轉殼聚糖膠 珠，收集濾過液——臍血造血干細胞與粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微載體上的 間充質干細胞混合懸液，采用自由沉降法分離并收獲懸浮的臍血造血干細胞與 粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微載體上的間充質干細胞。
本發明的效果和益處是 (1 )能夠使臍血造血干細胞和間充質干細胞在動態懸浮條件下進行共培 養，并發揮滋養細胞對干細胞的滋養、支持作用。(2) 微載體為臍血間充質干細胞提供了粘附表面，使臍血間充質干細胞在
動態環境中實現貼壁懸浮培養。
(3) 旋轉壁式生物反應器顯著降低了細胞生長環境的剪切力，使細胞始終 處于動態懸浮生長環境，有利于造血干細胞的擴增。
(4) 利用本發明一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充質干 細胞的方法，對海藻酸鈣殼聚糖膠珠包埋人脂肪干細胞滋養下的人臍血造血干 細胞與間充質干細胞進行了動態懸浮共培養。結果表明，這兩種臍血干細胞在 此培養體系中均生長良好，12天后造血干細胞和間充質干細胞的擴增倍數分別 可達5倍以及14倍。
圖1是本發明所述的一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充 質干細胞的方法流程圖。
圖2是本發明所述的一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充 質干細胞的方法海藻酸鈣殼聚糖膠珠(直徑為1.0-1.5毫米)包埋滋養細胞的顯 微照片。
圖3是本發明所述的一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充 質干細胞的方法臍血單個核細胞在接種至旋轉壁式生物反應器之前與微載體在 六孔板內孵育時的顯微照片(100x)。
圖4是本發明所述的一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充 質干細胞的方法體外擴增過程中UCB-MSCs粘附在GCSC微載體表面上的光鏡 與掃描電鏡觀察結果(A:六孔板內光鏡照片，200x; B: RWVB內光鏡照片， 200x; C:六孔板內掃描電鏡照片；D: RWVB內掃描電鏡照片)。
具體實施方式
以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發明的具體實施例。 實施例1:
本實施例為靜態條件下共同培養UCB-HSCs與UCB-MSCs。 將新鮮分離得到的UCB-MNCs以5X10Scells，mL—1的密度接種到提前鋪滿 GCSC微載體的六孔板中，與包埋ADSCs的海藻酸鈣殼聚糖膠珠混合均勻， ADSCs的接種密度為1 X 1()Scells'ml/1，補充IMDM培養基使培養體系為4mL， 37°C、 5%C02、 20%O2、飽和濕度條件下共培養9天。其中微載體的濃度為 5mg'm!/1，細胞因子組合與用量為SCF 15ng'mL"， FL5ng'mL"， TP0 6ng'mL"， IL-3 15ng.mL"， G-CSF lng,ml/1， GM曙CSF 5ng'mL"。每隔24小時計數NCs， 分別在第72小時、216小時從培養體系中取2mL的含有GCSC微載體的細胞懸 液，經含0.02% EDTA的質量百分比濃度為0.125。/。的胰蛋白酶消化后，流式細 胞儀分別分析檢測CD34+CD45+CD105鄰胞即HSCs和CD34—CD45-CD105+細胞 即MSCs的含量。
實驗結果采用稀釋換液法，UCB-MNCs在不添加血清，只添加細胞因子 和滋養層細胞支持的條件下，體外靜態培養9天，UCB-HSCs和UCB-MSCs分 別擴增了2.6倍和8.5倍。
此實施例說明，UCB-MSCs在GCSC微載體上能夠良好地粘附生長；由于 六孔板僅能提供二維靜態培養環境，該體系不能自動調節細胞周圍由于養料、 氧及代謝廢物產生的濃度梯度，致使UCB-HSCs的擴增倍數較低。提示在動態 培養條件下，UCB-HSCs與UCB-MSCs可能會增殖更多。
實施例2:
本實施例為動態懸浮條件下共同培養UCB-HSCs與UCB-MSCs。 將新鮮分離得到的UCB-MNCs以lXlO^ell&mL-1的密度接種到提前鋪滿GCSC微載體的六孔板內靜止孵育24小時，待UCB-MSCs充分粘附到微載體上 后，與包埋ADSCs的海藻酸鈣殼聚糖膠珠混合，補充IMDM培養基以使動態懸 浮培養時UCB-MNCs和ADSCs的細胞密度可分別為5 X 1()5cellsTnL'1和IX lOScelkmL",微載體濃度為5mg-mL—1，細胞因子組合與用量與實施例1相同。 將此混合液接種至RWVB內，反應器的培養室轉速保持在6rpm， 37°C、 5%C02、 20%O2、飽和濕度條件下共培養12天。每隔24小時計數NCs，分別在第72小 時、216小時從培養體系中取4mL的含有GCSC微載體的細胞懸液，消化，分 析檢測HSCs和MSCs的含量，方法同實施例1 。
實驗結果采用稀釋換液法，UCB-MNCs在不添加血清，只添加細胞因子 和滋養層細胞支持的條件下，在RWVB內動態懸浮培養12天，HSCs禾卩MSCs 分別擴增了 5.2倍和13.9倍，顯著優于六孔板中的培養結果。
此實施例說明，不添加血清、只添加細胞因子及滋養層細胞，采用微載體 與生物反應器相結合的技術，可以實現動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細 胞和間充質干細胞，使這兩種干細胞獲得較高的擴增倍數。海藻酸鈣殼聚糖膠 珠的人脂肪干細胞有效地滋養、支持了 UCB-HSCs與UCB-MSCs的體外擴增從 而，并部分替代了動物血清的作用，更加靠近臨床，更加具有醫學價值。
實施例3:
本實施例為擴增后的UCB-HSCs的集落形成CFU-Cs培養。 CFU-Cs集落主要包括CFU-Mix，s、 CFU-GMs和BFU-Es。分別在第0小時、 72小時和216小時將RWVB中的懸浮細胞，進行CFU-Cs集落培養。將擴增后 的UCB-HSCs以2X lOScells'ml/1的密度接種于甲基纖維素培養基中，每個35mm 培養皿接種lmL，每個樣本平行3皿。37°C、 5%C02、 20%O2、飽和濕度的培 養箱中培養10 12天，倒置顯微鏡下計數50個細胞以上的集落個數。其中培養基為含0.9。/。甲基纖維素的IMDM，添加30。/。FBS、 1°/。BSA、 50U'mL"青霉素、 50mg'mL"鏈霉素、1 X 1(T4M 2-巰基乙醇、2mM左旋古氨酰銨、50ng'ml/1重組 SCF、 lOng'mL"重組人IL-3、 10 ng'mU1重組人GM-CSF及3U'mL"重組人EPO。 實驗結果RWVB內動態懸浮條件下培養的UCB-HSCs能夠形成CFU-Cs 集落(參見圖5)。
此實施例說明，動態懸浮條件下培養的造血干細胞，仍具有形成CFU-Cs 集落的能力，良好地保持了 UCB-HSCs的干細胞特性。 實施例4:
本實施例為擴增后的UCB-MSCs多向誘導分化分析。
在RWVB內動態懸浮培養結束時，將粘附在GCSC微載體上的細胞用含 0.02% EDTA的質量百分比濃度為0.125%的胰蛋白酶消化下來，調整細胞密度 至5xlO、dls.mL—1，接種到24孔板中，每孔加入1ML常規培養基，三天后全量 吸出培養基，分別添加成骨、軟骨、脂肪誘導劑進行誘導分化培養4周，每3 天全量換液一次。分別在1周進行成骨細胞ALP染色、4周進行成骨細胞礦化 結節von Kossa染色、軟骨細胞甲苯胺藍染色和脂肪細胞油紅染色。
其中成骨誘導劑的成份為IMDM培養基中添加10% FBS、 O.l(iM地塞米 松、lOmMp-甘油磷酸鈉、50pM維生素C;脂肪誘導劑的成份為IMDM培養 基中添加10。/。FBS、 0.1mM3-異丁基-l-甲基黃嘌呤、lpM地塞米松、0.2|iM 口引 哚美辛和lOpM胰島素；軟骨誘導劑的成份為IMDM培養基中添加O.lpM地 塞米松、50嗎'mL"維生素C、 100吸mL"丙酮酸鈉、lOng'mL"轉化生長因子 (TFG-卩3)、 500ng'mL"骨形成蛋白(BMP-6)及50mgTnl/1 ITS+。
實驗結果動態懸浮條件下粘附在GCSC微載體上培養的UCB-MSCs經成 骨誘導一周時，約90°/。的細胞表達堿性磷酸酶，誘導兩周時，約80%的細胞能夠礦化結節；軟骨誘導三周時，約90%的細胞間外基質被甲苯胺藍染成藍紫色; 脂肪誘導兩周時，約80%的細胞胞內有紅色的脂滴形成。多向誘導分化結果說 明，動態懸浮條件下粘附在GCSC微載體上培養的大部分細胞具有向成骨細胞、 軟骨細胞和脂肪細胞分化的能力，并且所分化成的成骨細胞具有較好的礦化結 節能力。
此實施例說明，在RWVB內動態懸浮條件下粘附在GCSC微載體上所擴增 的細胞為UCB-MSCs，擴增的MSCs仍具有向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞 分化的能力。
盡管本發明是以人脂肪干細胞滋養人臍帶血來源的造血干細胞和間充質干 細胞、選用玻璃包被的聚苯乙烯微載體提供粘附表面為例來描述的，但這種描 述并不意味著對本發明構成限制。參照本發明的描述，其它種類的滋養細胞、 被滋養細胞、微載體粘附表面以及實施例的其他變形，對于本領域技術人員都 是可以預料的。因此，這樣的變形不會脫離所屬權利要求限定的范圍及精神。
權利要求
1. 一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充質干細胞的方法，其特征在于以下步驟(1)分離人臍血單個核細胞臍帶血來自健康產婦足月分娩或足月剖腹產嬰兒，臍血采集量平均為50～100mL，密度梯度離心分離得到單個核細胞，用IMDM基礎培養基1000rpm，5min離心洗滌，調整細胞密度備用；(2)臍血單個核細胞與玻璃包被的聚苯乙烯微載體在六孔板內靜止孵育24小時玻璃包被的聚苯乙烯微載體經不含Ca2+和Mg2+的PBS緩沖鹽溶液處理后，115℃下高壓滅菌15分鐘，鋪滿六孔板每孔底面，接種入新鮮分離得到的密度為1×107cells·mL-1的臍血單個核細胞，靜止孵育24小時；(3)提供滋養細胞滋養細胞為人脂肪組織來源的脂肪干細胞，以5×104cells·mL-1的密度接種于含體積百分比濃度為10％胎牛血清的DMEM培養基中培養，當細胞在培養瓶底面積達80％融合時，加入質量百分比濃度為0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例進行常規傳代培養；(4)海藻酸鈣殼聚糖膠珠包埋滋養細胞將質量百分比濃度為1.0％的海藻酸鈉溶液與密度為6×105cells·mL-1的脂肪干細胞懸液以2∶1體積比混合后，經5#針頭逐滴滴加至質量百分比濃度為3.0％氯化鈣溶液中，反應8分鐘，制得直徑為1.0～1.5毫米的包埋有脂肪干細胞的海藻酸鈣膠珠，PBS緩沖鹽溶液沖洗后，再與質量百分比濃度為1.0％殼聚糖交聯反應8分鐘，將交聯反應后的包埋有脂肪干細胞的海藻酸鈣殼聚糖膠珠用PBS緩沖鹽溶液沖洗后備用；(5)準備旋轉壁式生物反應器將旋轉壁式生物反應器各個部件清洗干凈后，浸泡在體積百分比濃度為75％的酒精溶液中過夜，再用超純水沖洗干凈；將裝配好的旋轉式細胞培養系統、連接好的管路、充氧器分別包裹并于121℃下高壓滅菌30分鐘，烘干備用；(6)旋轉壁式生物反應器內共同培養臍血造血干細胞與間充質干細胞將臍血單個核細胞與玻璃包被的聚苯乙烯微載體在六孔板內靜止孵育24小時后，與包埋脂肪干細胞的海藻酸鈣殼聚糖膠珠混合，加入IMDM培養基，調整臍血單個核細胞密度至5×105cells·mL-1，微載體濃度為5mg·mL-1，臍血單個核細胞與脂肪干細胞的細胞數比例為5∶1，加入細胞因子組合SCF 15ng·mL-1，FL 5ng·mL-1，TPO 6ng·mL-1，IL-315ng·mL-1，G-CSF 1ng·mL-1，GM-CSF 5ng·mL-1，接種至旋轉壁式生物反應器中，37℃、5％CO2、20％O2、飽和濕度條件下共同培養12天；(7)分離海藻酸鈣殼聚糖膠珠與臍血干細胞，收獲并分離臍血造血干細胞與間充質干細胞采用20目不銹鋼篩網截留包埋脂肪干細胞的海藻酸鈣殼聚糖膠珠，收集濾過液——臍血造血干細胞與粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微載體上的間充質干細胞混合懸液，采用自由沉降法分離并收獲懸浮的臍血造血干細胞與粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微載體上的間充質干細胞。
全文摘要
本發明公開了一種動態懸浮條件下共同培養臍血造血干細胞與間充質干細胞的方法，屬于生物技術與組織工程領域。其特征是不添加血清、只添加細胞因子和滋養細胞，用海藻酸鈣殼聚糖膠珠將滋養細胞包埋起來，結合微載體與旋轉壁式生物反應器技術實現臍血造血干細胞與間充質干細胞的共同培養，并分離、收獲這兩種臍血來源的干細胞。本發明的效果和益處是微載體為臍血間充質干細胞提供了粘附表面，使間充質干細胞實現貼壁動態懸浮培養；旋轉壁式生物反應器不僅為造血干細胞提供了懸浮生長環境，還有效降低了流體剪切力對造血干細胞造成的損傷；滋養細胞可以滋養膠珠外部的臍血干細胞，不僅起到部分替代血清的作用，還利于不同細胞之間的分離與收獲。
文檔編號C12M3/02GK101285053SQ20081001163
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者劉天慶, 孫相彧, 崔占峰, 李香琴, 范秀波, 馬學虎 申請人:大連理工大學