檢測基因突變的方法

文檔序號：439605閱讀：1201來源：國知局

專利名稱：檢測基因突變的方法
檢測基因突變的方法發明背景本發明涉及一種檢測基因插入和缺失突變的方法。近年來，檢測遺傳多態性的技術發展迅速。利用固定在底物上的探針的方法就是這些技術中的一種。在該方法中，通過與探針雜交來檢測靶標核酸。遺傳多態性除單堿基置換之外，還包括插入突變、缺失突變等等。關于用上述方法檢測單堿基置換的報道已有許多。然而，關于用上述方法檢測插入突變和缺失突變的報道卻幾乎沒有(參見，例如，Nat Genet. 14， 441-7， 1996和Nucleic Acid Res. 33 e33， 2005)。當用探針檢測插入突變或缺失突變的時候，探針與靶標核酸的雜交可能發生突變位點被環狀突出，因而出現非特異雜交。這引起了突變不能被準確檢測的問題。所以需要發展出一種檢測方法，該方法使用固定化探針能夠精確檢測插入突變和缺失突變。發明簡述本發明的一個目的是提供檢測基因突變的方法，所述方法通過使用探針能精確檢測插入突變和缺失突變。根據本發明的一個方面，它提供了檢測基因插入突變的方法，其包括步驟為使靶標核酸與野生型探針和突變型探針反應，檢測結合到各個探針上的耙標核酸的量，和將結合野生型探針的靶標核酸的量與結合突變型探針的耙標核酸的量相比較。附圖簡述圖IA是插入突變型靶標核酸與探針反應的示意圖。圖IB是當突變位于中心之外時，插入突變型靶標核酸與探針反應的示意圖。圖2A是野生型靶標核酸與野生型探針反應的示意圖。圖2B是插入突變型靶標核酸與野生型探針反應的示意圖。圖2C是野生型靶標核酸與突變型探針反應的示意圖。圖2D是插入突變型靶標核酸與突變型探針反應的示意圖。圖3A是野生型靶標核酸與野生型探針反應的示意圖。圖3B是缺失突變型耙標核酸與野生型探針反應的示意圖。圖3C是野生型靶標核酸與突變型探針反應的示意圖。圖3D是缺失突變型靶標核酸與突變型探針反應的示意圖。圖4是顯示LAMP方法中所用引物位置的示意圖。圖5顯示CYP2D6基因的序列。圖6是CYP2D6M8與野生型探針之間反應的示意圖。圖7是CYP2D6與突變型探針之間反應的示意圖。圖8A顯示用每一探針檢測CYP2D6的結果。圖8B顯示用每一探針檢測CYP2D6*18的結果。發明詳述本發明提供了檢測基因插入和缺失突變的方法。根據本發明，可以確定目的基因是否為野生型或者突變型。此處所用的術語"野生型"表示高頻率出現的基因型，而此處所用的術語"突變型，，表示低頻率出現的基因型。在本文中，作為檢測對象的核酸被稱作革巴標核酸。其序列與野生型耙標核酸互補的探針被稱作野生型探針，而其序列與突變型革巴標核酸互補的探針被稱作突變型探針。常規方法中所用的探針，其突變位置在探針中心附近。例如，在Nat Genet. 14， 441-7， 1996.中，使用了 20個堿基的探針，并且有一個突變位點位于從該探針3'端起第九個堿基處。在Nucleic Acid Res. 33 e33， 2005.中，使用了 25個堿基的探針，有一個突變位點定位于從該探針3，端起的第十三個堿基處。然而，當突變位點定位在探針中心附近時，不管靶標核酸中存在或不存在突變，所述探針都將結合靶標核酸。示意圖顯示在

圖1A中。圖1A顯示插入突變型靶標核酸21與野生型探針10之間的反應。因為它們的序列彼此不互補，突變型耙標核酸21原本是不會結合野生型探針10。然而，如圖1A所示，耙標核酸21會結合探針10，而其插入突變位點被環狀突出。其中，從探針10的一端到突變位點和從探針10的另一端到突變位點的鏈長是大致相等的，因而使得兩側都穩定結合。結果，盡管靶標核酸21是突變型，其仍結合野生型探針10導致測定錯誤。在靶標核酸有缺失突變的情況下，另一方面，野生型探針可以穩定結合其靶標核酸，同時對應于靶標突變位點的位點被環狀突出。由此推斷如本發明所示，突變位點可以定位于探針中心的外側以減少非特異的結合。如圖1B所示，當突變定位在探針ll中心外側時，從探針一端到突變位點的區域將短于另一區域。因而，較短區域的結合將不穩定，從而讓這段區域容易從靶標核酸22上分離開來。能夠由此減少非特異的結合。根據本發明，通過使用突變位點位置適當的探針，能夠提高檢測準確性。可以通過例如用解鏈溫度(Tm)來確定適合的探針如下首先，對用于檢測插入突變的探針進行描述。用于檢測插入突變的野生型探針在這樣的情況下為合適的探針，即其中從探針一端到突變位點的序列Tm值比上從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 2或更多。此處所用的關于野生型探針的突變位點，意指對應于該突變存在于靶標核酸中的位點的位點。野生型探針12的例子顯示在圖2A用于檢測野生型靶標核酸61，和顯示在圖2B用于檢測插入突變型靶標核酸23。從野生型探針12 —端到突變位點的具有較低Tm值的區域稱為Ll，野生型探針12的另一個區域稱為 L2。優選在此方法中使用的探針具有的Ll Tm值對L2 Tm值的比率范圍為從1:2或更多。更優選Ll對L2的Tm值的比率是l:3或更多。從改進檢測準確性而言，優選Ll的Tm值對L2的Tm值的比率范圍為從1:15 或更少。用于檢測插入突變的突變型探針在這樣的情形下是理想的探針，即當插入的堿基數是3個或者更少時，其中從探針一端到突變位點的序列Tm 值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比率是l: 2或者更多。突變型探針的例子顯示在圖2C和2D中。在圖2C中，從突變型探針31 —端到突變位點的具有較低Tm值的區域稱為L3，突變型探針31的另一個區域稱為L4。此外，探針的插入的區域稱為L5。如圖2C所示，當突變型探針31結合到野生型靶標核酸61時，突變型探針31的L3+L4區域結合到核酸61。因而，當插入的堿基數是3個或者更少，具有的L3Tm值對 L4 Tm值的比率范圍為從l: 2或更多時，此方法中所用的探針為優選的探針。更優選的是，L3對L4的Tm值的比率是l:3或者更多。從改進檢測準確性而言，優選L3 Tm值對L4 Tm值的比率范圍為從1:15或者更低。當突變位點到達突變型探針的一端時，L3不復存在。當插入堿基數較大的時候，例如當插入堿基數是4個或者更多時，L3+L4區域的長度將會較短。在這種情況下，L3+L4區域的Tm值會小到使結合不穩定，因而減少探針對靶標核酸的非特異結合。然而，當插入堿基數是3個或更少時，容易出現非特異結合；因此，當插入堿基數在3個或更少時，依照本發明的探針是有利的。然后，對檢測缺失突變的探針進行描述。用于檢測缺失突變的突變型探針在這樣的情況下為合適的探針，即其中從^:針一端到突變位點的序列Tm值對從揮:針另一端到突變位點的序列 Tm值的比值是l: 2或者更多。此處所用的關于野生型探針的突變位點，意指對應于該突變存在于靶標核酸中的位點的位點。用于檢測缺失突變的突變型探針的例子顯示在圖3C和3D。在圖3C 和3D中，從突變型探針51的一端到突變位點的具有較低Tm值的區域稱為L9，突變型探針51的另一個區域稱為LIO。優選在此方法中使用的引物L9的Tm值對L10的Tm值的比率范圍為l:2或者更多。更優選，L9對L10 Tm值的比率是1:3或者更多。從改進檢測準確性而言，優選L9 Tm 值對L10 Tm值的比率范圍為1:15或者更#>。用于檢測缺失突變的野生型探針在這樣的情形下是理想的探針，即當缺失的堿基數是3個或者更少時，其中從探針一端到突變位點的序列Tm 值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 2或者更多。野生型探針13的例子顯示在圖3A用于檢測野生型靼標核酸62，和顯示在圖 3B用于檢測缺失突變型把標核酸41。在圖3B中，野生型探針13 —端到突變位點的具有較低Tm值的區域稱為L6,野生型探針13的另一個區域稱為L7。另外，探針的缺失的區域稱為L8。當野生型探針13結合到如圖 3B所示的突變型耙標核酸41時，野生型探針13的L6+L7區域結合到核酸41。因而此方法中所用的探針在此情況下為優選的探針，即當缺失的堿基數是3個或者更少時，具有的L6的Tm值對L7的Tm值的比率范圍為 1: 2或者更多。更優選，L6對L7Tm值的比率是l:3或者更多。從改進檢測準確性而言，優選L6Tm值對L7Tm值的比率范圍為1:15或者更低。當突變位點達到野生型探針的一端時，同上述插入突變的情況一樣， L6不復存在。當缺失堿基數較大的時候，例如當缺失堿基數是4個或者更多時，L6+L7區域的長度將會非常短。在這種情況下，L6+L7區域的Tm 值會小到使結合不穩定，因而減少探針對耙標核酸的非特異結合。然而，當缺失堿基數在3個或更少時，非特異結合會容易出現；因此，當缺失堿基數在3個或更少時，依照本發明的探針是有利的。為了在檢測中使用，總體上野生型探針的Tm值優選幾乎等于突變型探針的Tm值。其Tm值的差異優選在10'C之內。可以通過任何已知的方法計算Tm值。優選使用適合處理短堿基序列的Wallace法(參見Nucleic Acid Res. 6， 3543-3557， 1979)。在Wallace法中， Tm值是基于這樣的假設而計算的，所述假設為鳥噤呤或胞嘧啶的鍵合力是4'C，腺噤呤或胸腺嘧咬的鍵合力是2C。也能夠使用毗鄰堿基對法和 GC。/。法作為其它方法。在根據本發明的突變檢測方法中，上述探針是被固定化在支持體上。野生型探針和突變型探針優選固定在相同的支持體上。首先，將含有靶標核酸的樣本溶液與固定化的野生型和突變型4果針分別反應。然后，檢測結合到每個探針上的耙標核酸的量。接著，將結合到野生型探針上的靶標核酸的量與結合到突變型探針上的靶標核酸的量相比較。當結合到突變型探針上耙標核酸的量更多些時，可確定靶標核酸的基因型是突變型。另一方面，當結合到野生型探針上靶標核酸的量更多些時，便可確定靶標核酸的基因型是野生型。通過以此方式比較檢測結果，就能夠檢測出靶標核酸的突變。<核酸>本說明書中所用的術語"核酸"旨在包括DNA、 RNA、 PNA、 S-寡核苷酸(S-oligo)和甲基膦酸酯寡核苷酸(methyl phosphonate oligo)(部分的結構能夠用堿基序列表示)的這類物質。<乾標核酸>物。自然存在的核酸包括個體的基因組DNA、基因組RNA和mRNA。所述個體包括，但不僅限于，人、非人的動物、植物、病毒和例如細菌、酵母和支原體這些微生物。這些核酸提取自從個體收集而來的樣本，例如血液、血清、白細胞、尿液、糞便、精液、唾液、組織、活組織檢查、口黏膜、培養的細胞、咳出的痰液等等。或者，所述核酸直接提取自孩吏生物。可以通過使用例如商業的核酸提取試劑盒QIAamp (QIAGEN)或者SMITEST (Sumitomo Metal Industries, Ltd.)來實現核酸的提取。含有提取自個體樣本或微生物的核酸的溶液被稱作樣本溶液。樣本溶液可能經過比如擴增和純化的任何處理。將處理過的樣本溶液用于本發明的檢測方法。提取的核酸將優選用已知的擴增技術進行擴增。擴增方法的實例包括但不僅限于，多聚酶鏈式反應(PCR)、環狀結構介導的(lo叩mediated)等溫擴增技術(LAMP法)、等溫嵌合引物起始的核酸擴增(ICAN法)、基于核酸序列的擴增方法(NASBA法)、鏈置換擴增(SDA法)和連接酶鏈式反應(LCR 法)以及滾環擴增法(RCA法)。通過特定擴增需要檢測的區域，從而限定核酸的檢測區域。通過這樣做甚至在僅用探針不能達到特異性時使檢測可行。為了有效結合探針，靶標核酸或擴增產物將處理為單鏈。^使得核酸變為單鏈的方法的實例包括，但不僅限于，使用珠子或者酶的方法和用T7 RNA聚合酶進行轉錄反應的方法。由LAMP法或ICAN法擴增且不需要是單鏈的擴增產物的樣本被直接用于下一步。優選擴增的靶標核酸具有莖環結構，因為使其變為單鏈的步驟是不需要的。具有莖環結構的擴增產物在與探針的雜交中是有利的。LAMP法(參見，例如，日本專利號3313358)優選用于靶標核酸的擴增。LAMP法是提供具有莖環結構的擴增產物的簡單方法。LAMP法的原則簡述于圖4的示意圖里。在LAMP法中，使用了識別靶標核酸的6個區的4個引物和鏈置換型DNA合成酶。在等溫條件下(60至65'C)擴增靶標核酸。6個區按照從靶標核酸5，端起的次序叫做F3區、F2區和F1區，按照從乾標核酸3，端起的次序叫4故B3c區、B2c區和Blc區。圖4中分別顯示了 4個引物的序列。Flc、 F2c、 F3c、 Bl、 B2和B3區在鏈上分別與Fl、 F2、 F3、 Blc、 B2c和B3c區互補。在LAMP法的擴增產物中，形成環狀結構，并且F2和F1之間以及B2和B1之間的區域都是單鏈區域。因此，探針通過利用這個區域的序列能容易的檢測乾標核酸(參見，例如，Jpn. Pat. Appln. KOKAI Publication No. 2005-143492)。反應時間為30到60分鐘，因此耙標核酸可以被快速擴增。<反應條件>該結合反應，即靶標核酸和探針之間的雜交在適當條件下進行。適合的條件依據在靶標核酸中含有的堿基類型、靶標核酸的結構和探針的類型而變化。例如通過離子強度在0.01到5的范圍之間變動和pH值在5到10 的范圍之間變動的緩沖溶液可以獲得合適的條件。可以向反應溶液中加入任意的添加劑。添加劑的實例包括例如，象右旋糖酐硫酸鹽、鮭精DNA、小牛胸腺DNA、 EDTA和表面活性劑這樣的雜交催化劑。反應溫度優選在10到90'C的范圍之內。通過攪動或者搖動可以增進反應效率。具有離子強度在0.01到5的范圍之間變動和pH值在 5到10的范圍之間變動的緩沖溶液可以用于反應后的洗滌。 <探針>探針的鏈長，盡管并非限制，優選在5到50個堿基的范圍內，更優選在10到40個堿基的范圍內，還要更優選在15到35個堿基的范圍內。探針可以是未修飾的，或者可以是以了在支持物上固定的反應的功能團，如氨基、象基、羥基、硫醇基和瘋基，或者以例如抗生物素蛋白和生物素這些物質修飾的。固定探針的支持物可以用硝化纖維素膜、尼龍膜、微量滴定板、玻璃、電極、磁體、珠子、塑料、膠乳、合成樹脂、天然樹脂或者光纖制成。在其上固定有探針的支持物可以是DNA芯片。所述DNA芯片是指將探針以高密度固定在諸如玻璃和硅等物質上的芯片。該DNA芯片能同時檢測多種基因的序列信息。嫌測方法>一般來說，通過熒光檢測法檢測雜交產生的雙鏈核酸。在此方法中，基因先用熒光標記然后用高敏感的熒光分析儀檢測。此外，還有一種通過電化學原理檢測雙鏈核酸的方法。在這種方法中，將探針固定在電極上。雙鏈核酸用電化學法來檢測，所述方法用電化學活性嵌合劑與雙鏈核酸特異'性的反應(參見，例i口， Jpn. Pat. Appln. KOKAI Publication No. 10-146183)。當前檢測類型的DNA芯片既不需要標記也不需要熒光檢測中所用的大而昂貴的檢測器。因而，此方法能夠作為簡單和便宜的方法而合適使用。在下文中，將對檢測方法的具體實例進行詳細描述。 l.熒光檢測系統將靶標核酸用諸如熒光染料的熒光活性物質標記。熒光染料包括但不限于Cy3、 Cy5、 FITC和若丹明。或者，也可以使用以這些物質標記的二級^^針標記靶標核酸。取決于標記類型用合適的檢測器來檢測熒光標記的把標核酸。2.通用檢測系統通過結合嵌入劑到雙鏈核酸上以對其進行檢測，所述雙鏈核酸由靶標核酸和固定在電極上的探針組成。此處所用的電極可以產生于，但不限于，諸如金、金合金、銀、鉑、汞、鎳、把、硅、鍺、鎵、鵠及其合金的金屬元素，或者諸如石墨和玻璃碳(glassy carbon)的碳，或其氧化物和化合物。使用電化學活性物質作為嵌入劑。這種物質包括但不限于，Hoechst 33258、吖咬橙、奎納克林、道諾霉素、金屬嵌入劑、雙嵌入劑如雙吖啶、三嵌入劑和多嵌入劑。這些嵌入劑可以用電化學活性金屬復合物如二茂鐵和viologen所修飾。通過應用高于使嵌入劑能發生電化學反應的電勢，能夠測定由該嵌入劑衍生的反應電流值。在這樣的情況下，電勢在恒定速率或脈沖方式下掃描，或者可以應用恒定電壓。在測量過程中，可以通過諸如穩壓器、數字萬用電表和函數發生器的i殳備來控制電流和電壓。從發明的另一方面而言，其提供了在本發明的方法中所用的野生型和突變型的探針。也提供了具有固定在其上的探針的探針固定化支持物。所述探針固定化支持物優選作為DNA芯片提供。在本發明的又一方面而言，其提供了用于在本發明檢測方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含如前面所定義的野生型探針和/或突變型探針。優選的，該試劑盒還包含用于靶標核酸擴增的LAMP法中所用的引物。該試劑盒可以包含鏈置換型DNA合成酶、合成的底物和緩沖溶液。實施例對通過本發明的方法檢測的具體實施例進行詳細描述。使用 CYP2D6*18作為靼標基因，該CYP2D6*18在人基因CYP2D6中有9個堿基的基因插入突變。CYP2D6基因的部分序列顯示在圖5中。通過PCR 從雜合的樣本中擴增出5.3 kbp的CYP2D6基因片段，所述雜合的樣本由野生型CYP2D6和插入9個堿基的突變型CYP2D6*18組成。將此PCR 產物引入pCR2.1質粒栽體。通過克隆分別得到含有野生型CYP2D6或插入9個堿基的突變型CYP2D6*18的質粒。分別使用各個質粒作為模板進行LAMP擴增。將此LAMP產物與固定在電極上的探針反應。其后，對結合到探針上的產物進行電化學檢測。 (1)靼標核酸的擴增引物合成LAMP法中所用的引物。它們的序列如下所示。圖5顯示了引物序列在耙標核酸上對應的位置。對于Flc區，使用圖5中顯示序列的反義鏈。對于B2和B3區，使用圖5中顯示序列的反義鏈。2D6*18 F3引物GCCCGCATGGAGCTC2D6"8 FIP引物GGAAAGCAAAGACACCATGGT (Flc)畫 CCTCTTCTTCACCTCCCTGC (F2)2D6*18 B3引物CCACATTGCTTTATTGTACATTAG2D6*18 BIP 引物TGAGCTTTGTGCTGTGCC (Blc)-TCTGGCTAGGGAGCAGG (B2)FIP引物含有Flc部分和F2部分。BIP引物含有Blc部分和B2部分。在兩部分間可以有或者沒有插入的任意序列。反應溶液1LAMP法的反應溶液具有如下成分滅菌的超純水 5.5 jiLBst DNA多聚酶 1 jLiL緩沖液 12.5Tris.HCl， pH 8.0 40 mMKC1 20 mMMgS04 16 mM(NH4)2S04 20 mM吐溫20 0.2%甜菜堿1.6 MdNTP2.8 raMF3引物(10 juM)0.5 pLB3引物(10|nM)0.5 nLFIP引物(20 ^M)2 jiLBIP引物(20 pM)2 jiL質粒模板(3 pg/pl)1 pL^普25 pL[擴增反應核酸用LAMP法在63。C下擴增1小時。滅菌水代替模^1作為一個陰性對照。LAMP的擴增產物用瓊脂糖膠電泳-驗證。結果，出現一個LAMP 產物典型的梯形圖案。在陰性對照中觀察不到擴增。這些結果說明CYP2D6 能通過使用以上的引物對進行專一擴增。(2)構建探針固定化電極探針I在本實施例中，分別使用了 5個針對野生型檢測的探針和5個針對插入突變檢測的探針。為了檢測正鏈靶標核酸，探針是負鏈。使用負探針用作陰性對照，所述負探針具有與CYP2D6基因序列不相關的序列。為了固定在金電極上，上述的11個探針的3，末端均以硫醇修飾。圖6顯示在野生型探針1到5和突變型革巴標核酸之間的反應示意圖。-野生型探針1由18個堿基組成。可能的插入突變位點在靶標核酸上位于從5，末端開始的第八個堿基。從3，端到突變位點的寡DNA鏈Tm值 (T1)是34。C,從5，端到突變位點的寡DNA鏈Tm值(T2)是28'C，所述Tm 值由Wallace法確定。-野生型探針2由18個堿基組成。可能的插入突變位點在靶標核酸上位于從5，末端開始的第六個堿基。從3'端到突變位點的寡DNA鏈Tm值 (T3)是42。C ，從5'端到突變位點的寡DNA鏈Tm值(T4)是20°C 。-野生型探針3由19個堿基組成。可能的插入突變位點在靶標核酸上位于從5，末端開始的第五個堿基。從3，端到突變位點的寡DNA鏈Tm值 (T5)是48°C ，從5'端到突變位點的寡DNA鏈Tm值(T6)是16°C 。-野生型探針4由20個堿基組成。可能的插入突變位點在靶標核酸上位于從5，末端開始的第三個堿基。從3'端到突變位點的寡DNA鏈Tm值 (T7)是56"C ，從5，端到突變位點的寡DNA鏈Tm值(T8)是10°C 。-野生型探針5由20個堿基組成。可能的插入突變位點在靶標核酸上位于從5，末端開始的第一個堿基。從3'端到突變位點的寡DNA鏈Tm值 (T9)是62°C ，從5，端到突變位點的寡DNA鏈Tm值(T10)是4°C 。對于野生型探針1，從探針5，端到突變位點的序列Tm值對從探針3，端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 1.2;對于野生型探針2是1: 2.1; 對于野生型探針3是1: 3.0;對于野生型探針4是1: 5.6;且對于野生型探針5是1: 15.5。圖7顯示了野生型探針1到5與野生型靶標核酸之間反應的示意圖。所有野生型探針1到5的突變位點都位于5，端一側。-突變型探針1由19個堿基組成。插入突變位點在離5，端從第一個到第九個堿基的區域內。-突變型探針2由17個堿基組成。插入突變位點在離5'端從第一個到第五個堿基的區域內。-突變型探針3由18個堿基組成。插入突變位點在離5，端從第一個到第四個堿基的區域內。-突變型探針4由20個堿基組成。插入突變位點在離5，端從第一個到第三個堿基的區域內。-突變型探針5由21個堿基組成。插入突變位點在離5，端從第一個到第二個堿基的區域內。各個探針的序列顯示如下負探針5'-GTGCTGCAGGTGCG-3'野生型4笨針1: 5'畫GGGCTGTCCAGTGGGCAC畫3，野生型探針2: 5'-GCTGTCCAGTGGGCACCG-3' 野生型4笨針3: 5'-CTGTCCAGTGGGCACCGAG-3，野生型4: 5-GTCCAGTGGGCACCGAGAAG-3' 野生型4笨針5: 5，-CCAGTGGGCACCGAGAAGCT-3' 突變型探4十1: 5'-CAGTGGGCACAGTGGGCAC-3' 突變型4笨針2: 5'-GGGCACAGTGGGCACCG畫3，突變型探針3: 5'畫GGCACAGTGGGCACCGAG-3' 突變型4笨針4: 5，畫GCACAGTGGGCACCGAGAAG-3' 突變型探針5: 5'-CACAGTGGGCACCGAGAAGCT-3'探針固定化電極]上述探針經由硫醇和金之間的強共價鍵固定在金電極上。將含有末端用硫醇修飾的探針的溶液點在金電極上并在25'C留置1小時。接著，將電極浸泡在1 mM巰基己醇中然后用0.2xSSC溶液清洗。將每個探針點在兩個電極上。電極與各個探針的對應顯示在下面。在清洗之后，將電極用超純水洗并且進行空氣干燥以得到探針固定化電極。[電極安排電極1，2:負探針電極3，4:野生型探針l電極5，6:突變型探針l電極7，8:野生型探針2電極9,10:突變型探針2電極11，12:野生型探針3電極13，14:突變型探針3電極15，16:野生型探針4電極17，18:突變型探針4電極19，20:野生型探針5電極21,22:突變型探針5(3)雜交將如上所述準備好的探針固定化電極浸泡在含LAMP產物和2xSSC 鹽的溶液中，然后留置在55。C雜交20分鐘。接著將探針固定化電極在 0.2xSSC溶液中于48。C浸泡20分鐘并且洗滌。接著將探針固定化電極在磷酸鹽緩沖液中浸泡10分鐘，該磷酸鹽緩沖液含50 pM Hoechst 33258作為嵌入劑。然后測量Hoechst 33258的氧化電流響應。(4)結果圖8A顯示用野生型探針1到5和突變型探針1到5檢測野生型靶標核酸的結果。照例，靶標核酸用野生型探針1到5來檢測。另一方面，用突變型探針1到3幾乎沒有檢測到信號，但是用突變型探針4檢測到微弱的信號，并且用突變型探針5檢測到強信號。因此，當突變由4個或者更多的堿基組成時，觀察不到非特異的結合，但是當突變由3個或者更少的堿基組成時，將觀察到非特異的結合。然而，當所述突變型探針其中插入堿基數為三個或更少時，以及當在靶標核酸上從探針一端到突變位點的序列Tm值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l:2或更多(突變型探針4和突變型探針5)的時候，有顯示通過使用突變型探針能抑制非特異結合。圖8B顯示檢測插入突變型耙標核酸的結果。照例，靼標核酸用突變型揮:針1到5來檢測。另一方面，通過插入突變位點位于幾乎探針中央的突變型探針1 (Tm比值1: 1.2)檢測到強的信號。在野生型探針1和突變型探針1之間信號方面沒有可識別的區別，因而說明存在許多非特異結合。插入突變位點稍接近末端位置的野生型探針2 (Tm比值1: 2.1)與突變型探針2存在差異，則可以將突變檢測出來。野生型探針3 (Tm比值l: 3.0)和野生型探針4 (Tm比值1: 5.6)的突變位點更為接近末端位置，其與突變型揮:針3和4有重大差異。野生型探針5的突變位點置于末端位置，與突變型探針5(Tm比值l: 15.5)也有差別。因而，其顯示出當突變位點位于探針中心之外時，能夠消除非特異信號。明確的，有事實表明，當野生型探針在靶標核酸上從探針一端到突變位點的序列Tm值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 2或更多的時候，能夠消除野生型探針和突變型靶標核酸的非特異結合。在上面的實施例中，進行了檢測插入突變的實驗，但很容易認識到關于缺失突變，有相反作用的探針將抑制非特異結合，因此確保能準確檢測突變。例如，缺失突變型耙標核酸和野生型探針的結合能夠與野生型靶標核酸和用于插入突變的突變型探針的結合以同樣的方式被理解。另外，野生型乾標核酸和用于缺失突變的突變型探針之間的結合也能與插入突變型靶標核酸和野生型探針之間的結合以同樣的方式被理解。由此得出結論，檢測缺失突變時，通過^^用突變型撰:針和野生型揮:針將減少非特異結合和準確的檢測缺失突變，所述突變型探針其從探針一端到突變位點的序列Tm 值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 2或更多，且當缺失堿基數為三個或更少時，所述野生型探針其從探針一端到突變位點的序列Tm值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 2或更多。對于本領域技術人員，將很容易想到附加的有利條件和修改。因此，從更廣闊的方面而言，本發明不限于此處所述的具體的細節和典型的實施方案。因此，可以進行多方面的修改而不背離所附權利要求及其等效物所定義的一般發明概念的精神或范圍。<110>株式會社東芝〈120〉檢測基因突變的方法〈130〉 07S0978〈140> <141><150>P 2007-031318<151〉 2007-02-09<歸 31<170〉 Patentln version 3. 3<210〉 1〈211> 15<212〉腿<213> 人工<220><223〉 F3引物<400> 1gcccgcatgg agctc<210〉 2<211> 21〈212> DNA<213> 人工<220><223> FIP引物(Flc)<400〉 2ggaaagcaaa gacaccatgg t<210〉 3<211> 20<212〉 DNA<213> 人工<220〉<223> FIP引物(F2)序列表1521<400> 3cctcttcttc acctccctgc 20<210> 4<211> 24<212> DNA<213> 人工<220><223〉 B3引物<400> 4ccacattgct ttattgtaca ttag 24〈210> 5<211> 18<212〉 DNA<213> 人工<220〉<223〉 BIP引物(Blc)<400> 5tgagctttgt gctgtgcc 18<210> 6<211> 17<212> DNA <213>人工<220><223> BIP引物(B2)<400〉 6tctggctagg gagcagg 17〈210> 7<211> 14<212> DNA<213> 人工<220><223> 負探針<400> 7gtgctgcagg tgcg 14<210> 8<211〉 18<212> 腿<213〉人工<220><223〉野生型探針-l<400〉 8gggctgtcca gtgggcac<210> 9<211〉 19<212> DNA<213〉人工<220〉<223〉突變型探針-1<400〉 9cagtgggcac agtgggcac<210> 10<211〉 18<212> 腿<213〉人工<220〉<223> 野生型探針-2<400〉 10gctgtccagt gggcaccg<210〉 11<211〉 17<212〉 DNA<213> 人工<220〉<223〉突變型探針-2<400〉 11gggcacagtg ggcaccg<210> 12<211〉 19<212〉 DNA〈213〉人工<220><223>野生型探針-3 <400> 12ctgtccagtg ggcaccgag<210> 13<211> 18<212> DNA<213> 人.T.<220><223> 突變型探針-3<400〉 13ggcacagtgg gcaccgag<210> 14<211〉 20<212〉 DNA<213> 人工<220><223> 野生型探針-4<400> 14gtccagtggg caccg卿ag<210> 15<211> 20<212〉 DNA<213> 人工<220〉<223〉突變型探針-4<400〉 15gcacagtggg caccgagaag<210> 16<211〉 20<212〉 DNA<213> 人工<220><223〉野生型探針-519182020<400> 16ccagtgggca ccgagaagct 20〈210〉 17<211〉 21<212〉 DNA<213> 人工<220><223> 突變型探針-5<400> 17cacagtgggc accgagaagc t 21〈210〉 18<211〉 260<212〉腿<213> 智人(Homo sapiens) <220〉<223〉野生型CYP2D6<400〉 18gccgtgcatg cctcggggag tgctgcagca cttcagcttc tctttgcttt cctggtgagc gggtacctag tccccagcct ggtagttcca actcgggtcc<210〉 19<211〉 269<212〉腿<213〉智人<220><223〉突變型CYP2D6 <400〉 19gccgtgcatg cctcggggag tgctgcagca cttcagcttc accatggtgt ctttgctttccccctggccc gcatggagct cttcctcttc ttcacctccc 60 tcggtgccca ctggacagcc ccggcccagc caccatggtg 120 ccatccccct atgagctttg tgctgtgccc cgctagaatg 180 gctccctagc cagaggctct aatgtacaat aaagcaatgt 240260cccctggccc gcatggagct cttcctcttc ttcacctccc 60 tcggtgccca ctgtgcccac tggacagccc cggcccagcc 120 ctggtgagcc catcccccta tgagctttgt gctgtgcccc 180gctagaatgg ggtacctagt ccccagcctg ctccctagcc agaggctcta atgtacaata 240 aagcaatgtg gtagttccaa ctcgggtcc 269<210〉 20<211> 40<212〉 DNA〈213〉智人<220〉<223〉突變型耙標序列〈400〉 20cagcttctcg gtgcccactg tgcccactgg acagccccgg 40<210> 21<21D 18<212> 腿 <213>智人<220〉<223〉野生型-l探針<400> 21gggctgtcca gtgggcac 18<210> 22<211> 18<212〉 DNA<213〉人工<220〉<223>野生型-2探針<400〉 22gctgtccagt gggcaccg 18<210〉 23<211> 19<212> 腿<213> 人工〈220〉<223〉野生型-3探針<400> 23ctgtccagtg ggcaccgag 19<210> 24〈211> 20<212〉 DNA<213〉人工<220><223> 野生型-4探針<400〉 24gtccagtggg caccgagaag 20<210> 25<211> 20<212> DNA〈213〉人工<220><223>野生型-5探針<400〉 25ccagtgggca ccgagaagct 20<210〉 26<211〉 31<212> DNA<213〉智人<220〉<223>野生型耙標序列<400> 26cagcttctcg gtgcccactg gacagccccg g 31<210〉 27<211> 19<212> DNA<213> 人工<220><223>突變型-l探針 <400> 27cagtgggcac agtgggcac 19<210> 28 <211> 17 <212> 腿<213> 人工 <220><223> 突變型-2探針 <400> 28gggcacagtg ggcaccg<210> 29<211> 18<212> DNA<213〉人工<220><223>突變型-3探針〈400〉 29ggcacagtgg gcaccgag<210> 30<211〉 20<212> 腿<213〉人工<220〉<223> 突變型-4探針<400> 30gcacagtggg caccg3g肌g<210> 31<211〉 21<212〉 DNA<213〉人工<220〉<223>突變型-5探針<400〉 31cacagtgggc accgagaagc t
權利要求
1.檢測基因插入突變的方法，其包括步驟使靶標核酸與野生型探針和突變型探針反應，檢測結合到所述各個探針上的靶標核酸的量，和將結合到野生型探針上的靶標核酸的量與結合到突變型探針上的靶標核酸的量進行比較，其表征為，野生型探針與野生型靶標核酸的序列具有序列互補性，并且從探針一端到突變位點的序列Tm值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是1∶2或更多。
2. 根據權利要求l的方法，其表征為，突變型探針與突變型靶標核酸的序列具有序列互補性，并且當插入堿基數為三個或更少時，從探針一端到插入堿基的序列Tm值對從探針另一端到插入堿基的序列Tm值的比值是l: 2或更多。
3. 根據權利要求l的方法，其表征為，靶標核酸具有莖環結構，并且如果耙標核酸有突變，該突變位于環狀結構部分。
4. 根據權利要求3的方法，其表征為，靶標核酸是通過LAMP法擴增的產物。
5. 根據權利要求1的方法，其表征為，野生型探針和突變型探針的 Tm值之間的差別為l(TC或更小。
6. 根據權利要求l的方法，其表征為，探針被固定在支持物上。
7. 根據權利要求l的方法，其表征為，用電化學活性的核酸識別體檢測與探針結合的靶標核酸。
8. 檢測基因缺失突變的方法，其包括步驟使靶標核酸與野生型探針和突變型探針反應，檢測與各個探針結合的耙標核酸的量，和將結合到野生型探針上的靶標核酸的量與結合到突變型探針上的靶標核酸的量進行比較，其表征為，突變型探針與突變型靶標核酸的序列具有序列互補性，并且從探針一端到缺失堿基的序列Tm值對從探針另一端到缺失堿基的序列 Tm值的比值是l: 2或更多。
9. 根據權利要求8的方法，其表征為，野生型探針與野生型靶標核酸的序列具有序列互補性，并且當缺失的堿基數為三個或更少時，從探針一端到突變位點的序列Tm值對從探針另一端到突變位點的序列Tm值的比值是l: 2或更多。
10. 根據權利要求8的方法，其表征為，靶標核酸具有莖環結構，并且如果耙標核酸有突變，該突變位于環狀結構部分。
11. 根據權利要求10的方法，其表征為，靶標核酸是通過LAMP法擴增的產物。
12. 根據權利要求8的檢測方法，其表征為，野生型探針和突變型探針的Tm值之間的差別為l(TC或更小。
13. 根據權利要求8的方法，其表征為，探針被固定在支持物上。
14. 根據權利要求8的方法，其表征為，用電化學活性的核酸識別體檢測與探針結合的乾標核酸。
全文摘要
本發明提供了檢測基因插入或缺失突變的方法，其包括以下步驟將靶標核酸與野生型探針和突變型探針反應，檢測結合到各個探針上的靶標核酸的量，和將結合到野生型探針上的靶標核酸的量與結合到突變型探針上的靶標核酸的量進行比較。
文檔編號C12Q1/68GK101240338SQ20081000552
公開日2008年8月13日申請日期2008年2月4日優先權日2007年2月9日
發明者中村奈緒子申請人:株式會社東芝

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